CN116200405A - 调控水稻香味物质含量的基因OsPAO4及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控水稻香味物质含量的基因OsPAO4及其应用。本发明通过研究发现，在水稻籽粒中特异过表达OsPAO4基因后，水稻籽粒中的2AP含量得到了显著提高，且OsPAO4基因是香味物质2AP含量的正向调控基因，说明可以通过控制OsPAO4基因在水稻中的表达模式来提高籽粒中的2AP含量，可以作为培育高富集2AP水稻的一种全新的技术手段。本发明对OsPAO4基因的鉴定及功能研究，不仅对阐明水稻OsPAO4基因的生物学功能有重要意义，有利于深入认识2AP在籽粒中的积累机制，而且对优质稻米的培育具有重要的促进意义，为优质香稻的育种提供了全新的方向。

Description

调控水稻香味物质含量的基因OsPAO4及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控水稻香味物质含量的基因OsPAO4及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的粮食作物，其中香稻由于在蒸煮过程中会散发出令人愉悦的独特香味而被誉为水稻中的珍品，近年来国内和国际市场对香稻的需求持续增加。稻米的香味在国际贸易中是决定香米价格的重要因素之一，优质香米的价格是非香稻的3倍之高。当前，在我国南方优质籼稻的评价体系中，香味已成为优质米的重要指标。因此，优质香稻的育种对于优质稻米品牌的创建、农业的提质增效、农民收入的提高等方面都具有重要的经济和社会效益。
2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)是所有香米中共有的特征香气成分。对水稻香味基因的遗传定位研究发现，Badh2是香味性状的主效基因，该基因编码甜菜碱醛脱氢酶，其功能突变会导致2AP积累(Bradbury等,The gene for fragrance in rice.Plant BiotechnologyJournal,2005,3:363-370；Chen等,Badh2,encoding betaine aldehyde dehydrogenase,inhibits the biosynthesis of 2-acetyl-1-pyrroline,a major component in ricefragrance.The Plant Cell,2008,20:1850-1861)。水稻整个生育期的地上茎叶部分均能产生2AP，其含量在幼苗期、分蘖期和孕穗期的叶片中逐渐增加，但籽粒中的2AP含量明显降低，且糙米中的2AP含量明显高于精米(Hinge等,Aroma volatile analyses and 2APcharacterization at various developmental stages in Basmati and Non-Basmatiscented rice(Oryza sativa L.)cultivars.Rice,2016,9:38)。另外，香稻品种、栽培方式、气候条件和保存方式等多种因素均会影响2AP的积累水平。籽粒中的2AP含量是稻米价格的重要决定因素，因此，研究如何提高籽粒的2AP含量、特别是特异性提高胚乳中的2AP含量，对于提升香米的经济价值具有重要的意义。
当前的香稻生产中，主要是依靠控制水肥条件、添加营养元素等栽培管理方式来提高香稻中的2AP含量。如在水稻的营养生长期和灌浆期进行盐胁迫、香稻灌浆期适当遮阴处理、干湿交替灌溉、施加Mn元素等均可提高香稻中的2AP含量(Poonlaphdecha等,Effectof timing and duration of salt treatment during growth of a fragrant ricevariety on yield and 2-acetyl-1-pyrroline,proline,and GABA levels.Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2012,60(15):3824-3830；Mo等,Shading during thegrain filling period increases 2-acetyl-1-pyrroline content in fragrantrice.Rice,2015,8:9；Li等,Manganese-induced regulations in growth,yieldformation,quality characters,rice aroma and enzyme involved in 2-acetyl-1-pyrroline biosynthesis in fragrant rice.Plant Physiology and Biochemistry,2016,103:167-175；Bao等,Molecular basis for increased 2-acetyl-1-pyrrolinecontents under alternate wetting and drying(AWD)conditions in fragrantrice.Plant Physiology and Biochemistry,2018,133:149-157)。但这些相关增香措施并没有特异性提高精米中的2AP含量，且不同香稻品种的增幅表现不同，导致增香效果有限，糙米2AP含量的增加幅度一般在10-50％之间，最高只能提升至106.65％。因此，挖掘香味控制基因，通过遗传手段改良香稻育种将是一种必然选择。从2AP生物合成机制分析，Badh2基因突变只能导致2AP被积累，但并不决定其含量(Bradbury等,Inactivation of anaminoaldehyde dehydrogenase is responsible for fragrance in rice.PlantMolecular Biology,2008,68:439-449)，而如何挖掘新的有效香味调控基因来特异性提高籽粒中的2AP含量，则要从整个2AP生物合成通路进行深入分析。2AP生物合成通路分为谷氨酸-脯氨酸代谢途径和多胺代谢两条途径，其中谷氨酸-脯氨酸代谢途径中的1-吡咯啉-5-羧酸合成酶P5CS基因在香稻品种中过表达后，能够使籽粒中的2AP含量提高两倍(Kaikavoosi等,2-acetyl-1-pyrroline augmentation in scented indica rice(Oryzasativa L.)varieties through 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase(P5CS)genetransformation.Applied Biochemistry and Biotechnology,2015,177(7):1466-1479)。而多胺代谢途径在2AP合成中的作用则被长期忽视，且该途径目前尚未有香味调控基因被发掘出来。此外，多胺氧化酶OsPAO4基因作为多胺代谢中的一个关键酶，其能否调控籽粒香味物质的生物合成和积累尚未见相关研究报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明克隆和鉴定了一种调控水稻香味物质2AP含量的基因OsPAO4，通过在水稻中过表达OsPAO4基因可以提高籽粒中的2AP含量。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了多胺氧化酶基因OsPAO4在调控水稻香味物质2AP含量中的应用。
优选地，所述水稻为香稻品种。更优选地，所述水稻为美香占2号香稻品种。
优选地，所述调控为在水稻籽粒中特异过表达OsPAO4基因，使水稻籽粒中的2AP含量提高。
本发明鉴定的OsPAO4基因的基因编号是LOC_Os04g57550，对过表达OsPAO4基因的水稻籽粒进行2AP含量测定，发现过表达籽粒中的2AP含量是野生型的3-8倍，进一步通过DNA、RNA水平鉴定，确定转基因表型确实是由OsPAO4基因的超量表达引起。本基因的鉴定对阐明水稻OsPAO4基因的生物学功能有重要意义，有利于深入认识2AP在籽粒中的积累机制，同时对优质稻米的培育具有重要的促进意义。
优选地，所述相关的生物材料包括编码OsPAO4基因的蛋白，含有OsPAO4基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明还提供了一种培育高富集2AP水稻的方法，即通过水稻胚乳特异性启动子驱动OsPAO4基因的表达，提高水稻籽粒中的2AP含量即得。
OsPAO4基因是香味物质2AP含量的正调控基因，通过在胚乳中特异过表达OsPAO4基因可以作为培育高富集2AP水稻的一种全新的技术手段，应用于转基因水稻和转基因水稻种子中，有利于培育高香型香稻。
作为本发明的一个优选实施方式，上述培育高富集2AP水稻的方法具体包括以下步骤：
S1、将水稻胚乳特异性启动子序列连接至OsPAO4基因的CDS序列，构建OsPAO4胚乳特异过表达载体，OsPAO4基因的CDS序列如SEQ ID NO：1所示；
S2、利用OsPAO4胚乳特异过表达载体转化水稻愈伤组织，对所得转基因水稻愈伤组织进行抗性筛选后即得。
优选地，所述水稻胚乳特异性启动子为球蛋白Glb1启动子，所述球蛋白Glb1启动子具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
优选地，通过农杆菌介导的遗传转化法用OsPAO4胚乳特异过表达载体转化水稻愈伤组织。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过研究发现，在水稻籽粒中特异过表达OsPAO4基因后，水稻籽粒中的2AP含量得到了显著提高，且OsPAO4基因是香味物质2AP含量的正向调控基因，说明可以通过控制OsPAO4基因在水稻中的表达模式来提高籽粒中的2AP含量，提高稻米的香味，为优质香稻的育种提供了全新的方向，对于提升香米的经济价值具有重要的意义。总体而言，本发明具有以下优点：
(1)水稻多胺氧化酶家族含有多个基因，部分成员被证实在调控水稻下胚轴长度和苗期耐盐性方面发挥作用，但对水稻籽粒2AP积累的相关研究未见报道。本发明鉴定的OsPAO4基因对籽粒2AP含量具有正调控作用，这对于阐明多胺氧化酶基因调控籽粒2AP富集的生物学功能有重要意义。
(2)尽管Badh2香味基因是必需基因，但该基因突变仅能够导致2AP积累，无法调控其含量，同时籽粒中的2AP积累机制仍不清楚。而本发明鉴定的OsPAO4基因能够调控籽粒的2AP含量，有利于深入揭示籽粒中2AP积累的分子机制，便于通过基因工程策略培育优质香稻品种。
(3)当前生产上主要是应用特定的栽培管理方式来提高香稻的2AP含量，但其提升籽粒2AP的幅度非常有限。本发明利用基因工程策略，发现OsPAO4基因能够实现籽粒2AP数倍程度的提高，对于优异香稻品种的选育意义深远。
附图说明
图1为OsPAO4过表达水稻植株潮霉素筛选标记基因的DNA水平检测结果(泳道1-11表示11个独立的转化单株)；
图2为OsPAO4过表达水稻植株目的基因的DNA水平检测结果(泳道1-11表示11个独立的转化单株)；
图3为OsPAO4过表达水稻籽粒的半定量RT-PCR水平检测结果(左边为野生型，右边三个为过表达植株OE3、OE5、OE6)；
图4为OsPAO4过表达水稻籽粒的qRT-PCR水平检测结果(左边为野生型，右边三个为过表达植株OE3、OE5、OE6)；
图5为OsPAO4过表达水稻的整株表型(左边为野生型，右边三个为过表达植株OE3、OE5、OE6)；
图6为OsPAO4过表达水稻成熟籽粒的2AP含量检测结果(左边灰色柱子代表野生型，右边三个黑色柱子表示过表达植株OE3、OE5、OE6)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
下述实施例的试验操作采用本领域常规技术。实施例中所用的水稻为美香占2号香稻品种，其审定编号为粤审稻2006009；试验中所涉及的载体、试剂等均为市售。下述实施例提及的诱导培养基、AAM培养基、共培养培养基、预培养培养基、筛选培养基、预分化培养基、分化培养基和生根培养基均参照以下文献配制：
Toki S,Hara N,Ono K,Onodera H,Tagiri A,Oka S,Tanaka H.Early infectionof scutellum tissue with Agrobacterium allows high-speed transformation ofrice.Plant J.2006 Sep；47(6):969-76.
实施例1 OsPAO4基因过表达水稻的获得
1、OsPAO4基因克隆和过表达载体的构建
设计相应引物，以水稻cDNA为模板，克隆全长为1464bp的PAO4基因(基因编号为LOC_Os04g57550)的CDS序列(SEQ ID NO：1)；扩增引物为5'-ATGGATCCCAATAGCCTCAAAACT-3'(SEQ ID NO：3)和5'-TCAGGTCCTGCAAATCTGAAGG-3'(SEQ ID NO：4)，扩增PAO4 CDS序列所用的PCR反应体系为20μL：1-2μL美香占2号水稻叶片总RNA反转录出的cDNA为模板，2×TaqMix10μL，10μM引物各0.5μL，用双蒸水补至20μL。反应程序为：95℃，变性5min；95℃30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，34个循环；72℃，10min结束反应。
同时，以水稻基因组DNA为模板，克隆984bp的Glb1胚乳特异启动子区段序列(基因编号为LOC_Os05g41970，SEQ ID NO：2)。扩增启动子所用引物为：5'-gaattcTCGGGCGCCTGGAGGGAGGAGA-3'(小写字母表示酶切位点序列，SEQ ID NO：5)和5'-ggatccATTGATGATCAATCAGACAATC-3'(小写字母表示酶切位点序列，SEQ ID NO：6)，PCR反应体系为：1-2μL美香占2号水稻基因组DNA模板，2×Taq Mix 10μL，10μM引物各0.5μL，用双蒸水补至20μL。反应程序为：95℃，变性5min；95℃30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，34个循环；72℃，10min结束反应。
最后，将PAO4 CDS序列和Glb1启动子区段分别连接到pEASY-T1克隆载体，进行测序确认无误后，用EcoRI和BamHI(NEB)双酶切获得Glb1启动子区段序列，将其连接到双元载体pCAMBIA1300骨架载体，再将PAO4 CDS区段以平末端连接方式插入骨架载体，再将获得的Glb1 promoter:PAO4-CDS过表达载体转入大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株，提取相应质粒并测序保证序列正确。
水稻PAO4基因的CDS序列(1464bp，SEQ ID NO：1)如下：
ATGGATCCCAATAGCCTCAAAACTGGAGGCCTCTTGCTTCCGACCATTGAGAGGCAATGTGCTTCGCCTCCATCCGTCATCGTGATCGGTGGGGGAATTTCAGGGGTTGCAGCAGCCCGTGCTCTCTCCAATGCTTCGTTTGAGGTGACTGTTTTGGAGTCCAGAGATCGCGTAGGCGGTCGTGTCCATACCGATTACTCTTTCGGATGCCCAATTGATATGGGAGCCTCATGGCTCCACGGCGTTTGTAATGAGAACTCCTTGGCACCATTGATTGGCTATCTTGGGCTGAAATTATATCGCACTAGTGGCGACAACTCTGTTCTGTATGATCATGATTTAGAAAGTTATGCACTCTTTGATAAGGCTGGCCATCAGGTCTCAAAGGAGACAGTTGCTAAAGTTGAAGAAACATTTGAAAGAATTCTTGATGAGACAGTTAAAGTGCGTGATGAGCAGGAACATGACATGCCCCTTCTACAGGCGATTTCACTTGTTCTTGAGAGGCACCCCCATCTGAAGTTACAAGGGATAGATGATCAAGTCTTGCAATGGTGTGTCTGTCGGCTTGAGGCATGGTTTGCTGCAGATGCTGATGAAATATCTCTGAAAAACTGGGATCAGGAGCATGTTCTTACCGGTGGCCATGGTCTGATGGTGAACGGATACTATCCTATAATTCAGGCTCTTGCACAAGGTCTAGATATCCGGCTTAATCAAAGGGTAACCAAAATTGCCCGCCAATTCAATGGAGTGACAGTTACCACTGAAGATGGAACAAGTTACTCTGCCGATGCTTGCATCATTACAGTACCGCTCGGTGTGCTCAAGGCAAACATAATCAAGTTCGAGCCTGAGTTGCCCTCATGGAAGAGCTCTGCAATCGCAGACCTTGGTGTCGGTATCGAGAACAAGATCGCCATGCACTTCGATACAGTCTTCTGGCCTAATGTTGAGGTGCTGGGAATGGTTGGCCCAACGCCTAAAGCATGTGGGTACTTCCTGAACCTCCACAAGGCCACCGGCAATCCGGTCCTCGTCTACATGGCCGCCGGTAGATTTGCTCAAGAAGTGGAAAAACTGTCAGACAAGGAGGCCGTTGATCTGGTCATGTCTCACCTGAAGAAAATGCTACCTGACGCCACTGAACCTACGAAGTATTTGGTTTCACGCTGGGGTTCTGACCCGAACTCGCTGGGTTCCTACTCGTGCGACCTGGTCGGGAAGCCGGCCGACGTGTCGGCGCGGTTCGCCGCACCGGTGGAGAACCTCTACTTCGCCGGCGAGGCGGCCAGCGCCGACCACTCGGGGTCCGTCCACGGCGCCTACTCGTCGGGGATCGCCGCCGCCGATGAGTGCCGGAAGCGCATCCTGATGCAGAAGGGCATCCCTGACCTCGTCCAGGTCAAGGCCTACGAGGAGATGGCCGGAGTCATTGCTCCCCTTCAGATTTGCAGGACCTGA。
水稻Glb1启动子区段的序列(984bp，SEQ ID NO：2)如下：
GGCGCCTGGAGGGAGGAGAGGGGAGAGATGGTGAGAGAGGAGGAAGAAGAGGAGGGGTGACAATGATATGTGGGGCCATGTGGGCCCCACCATTTTTTTAATTCATTCTTTTGGTGAAACTGACATGTGGGTCCCATGAGATTTATTATTTTTCGGATCGAATTGCCACGTAAGCGCCACGTCAATGCTACGTCAGATGAAGACCGAGTCAAATTAGTCACGTAAGCGCCACGTCAGCCAAAACCGCCATCCAAACCGCCGAGGGATCTCATCTGCACTGGTTTTGATAGTTGAGGGACCCGTTGTATCTGGTTTTTCGATTGAAGGACGAAAATCAAATTTGTTGACAAGTTAAGGGACCTTAAATGAACTTATTCCATTTCAAAATATTCTGTGAGCCATATATACCGTGGGCTTCCAATCCTCCTCAAATTAAAGGGCCTTTTTAAAATAGATAATTGCCTTCTTTCAGTCACCCATAAAAGTACAAAACTACTACCAACAAGCAACATGCGCAGTTACACACATTTTCTGCCCATTTCCACCACGTCACAAAGAGCTAAGAGTTATCCCTAGGACAATCTCATTAGTGTAGATACATCCATTAATCTTTTATCAGAGGCAAACGTAAAGCCGCTCTTTATGACAAAAATAGGTGACACAAAAGTGTTATCTGCCACATACATAACTTCAGAAATTACCCAACACCAAGAGAAAAATAAAAAAAATCTTTTTGCAAGCTCCAAATCTTGGAAACCTTTTTCACTCTTTGCAGCATTGTACTCTTGCTCTTTTTCCAACCGATCCATGTCACCCTCAAGCTTCTACTTGATCTACACGAAGCTCACCGTGCACACAACCATGGCCACAAAAACCCTATAAAACCCCATCCCATCGCCATCATCTCATCATCAGTTCATCACCAACAAACAAAAGAGGAAAAAAAAACATATACACTTCTAGTGATTGTCTGATTGATCATCA。
2、OsPAO4基因过表达水稻植株的构建
(1)水稻成熟胚愈伤组织的诱导
去壳后的香稻种子经75％酒精清洗两次，再用1％次氯酸钠消毒处理，接着以无菌水清洗三次后用灭菌滤纸吸干水分，将种子平铺在诱导培养基(N6大量，B5微量，B5有机，MS铁盐，30g/L蔗糖，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，2.8g/L脯氨酸，2.0mg/L 2,4-D，4.5g/L植物凝胶，pH＝5.8)上，30℃光照7天，在成熟胚处诱导生成愈伤组织，收集愈伤组织用于农杆菌浸染转化。
(2)农杆菌介导的水稻愈伤组织侵染
将构建好的OsPAO4基因过表达质粒通过电击法转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105。将转化菌液在含有利福平、羧卞青霉素和潮霉素(各50mg/L)的YEB培养基上进行培养，28℃暗培养2～3天，挑选单菌落在YEB平板上进行划线培养，挑取火柴头大小的菌落置于YEB液体培养基中，28℃培养16h，将0.1mL菌液转接到含有150μM乙酰丁香酮的50mL YEB液体培养基中继续培养，待OD600至0.5左右时，离心收集菌体；弃去上清，用适量含300μM乙酰丁香酮的AAM培养基(N6大量，B5微量，B5有机，MS铁盐，68.5g/L蔗糖，30g/L葡萄糖，500mg/L水解酪蛋白，2.8g/L脯氨酸，2.0mg/L 2,4-D，4.5g/L植物凝胶，pH＝5.2)轻轻重悬菌体，使OD600达到0.4～0.5，将培养好的菌液添加到水稻愈伤组织中(将水稻愈伤浸泡在收集好的菌液中)，28℃摇床中120rpm轻摇30min，随后将愈伤组织转移至灭菌纱网中晾干，最后将愈伤组织平铺至含100μM乙酰丁香酮的共培养培养基(N6大量，B5微量，B5有机，MS铁盐，30g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，2.8g/L脯氨酸，2.0mg/L2,4-D，4.5g/L植物凝胶，pH＝5.2)中，25℃暗培养三天。
(3)水稻愈伤转化体的筛选及抗性植株的再生
将共培养三天后的愈伤组织转移至三角瓶中，用无菌水漂洗掉愈伤组织外的农杆菌，至无菌水澄清时，将愈伤组织置于无菌水中静置30min，再用无菌水漂洗两遍，之后再用含有200mg/L羧卞青霉素的无菌水清洗，静置15min，将愈伤组织晾干后转接于预培养培养基(N6大量，B5微量，B5有机，MS铁盐，30g/L蔗糖，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，2.8g/L脯氨酸，2.0mg/L 2,4-D，200mg/L羧卞青霉素，500mg/L头孢霉素，4.5g/L植物凝胶，pH＝5.8)中，30℃暗培养3～4天。
将预培养基上的所有愈伤组织转移至筛选培养基(N6大量，B5微量，B5有机，MS铁盐，30g/L蔗糖，300mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，2.8g/L脯氨酸，2.0mg/L 2,4-D，200mg/L羧卞青霉素，400mg/L头孢霉素，50mg/L潮霉素，4.5g/L植物凝胶，pH＝5.8)中，在温度为30℃，光暗周期为14/10h的培养间培养两周，挑选新鲜的黄色抗性愈伤组织，转入新的筛选培养基继续培养两周，再将新的愈伤组织第三次转移至筛选培养基，继代培养两周。之后再将抗性愈伤组织转移至预分化培养基(MS大量，MS微量，MS有机，MS铁盐，30g/L蔗糖，1000mg/L水解酪蛋白，20g/L山梨醇，0.5mg/L NAA，2mg/L 6-BA，1mg/L KT，4.5g/L植物凝胶，pH＝5.8)上，培养7～10天，待愈伤上出现绿点后，将其转移至分化培养基(MS大量，MS微量，MS有机，MS铁盐，10g/L蔗糖，300mg/L水解酪蛋白，20g/L山梨醇，0.5mg/L NAA，2mg/L 6-BA，1mg/L KT，4.5g/L植物凝胶，pH＝5.8)中，培养四周左右后分化出小苗。将抗性小苗转接于生根培养基(1/2MS大量，1/2MS微量，1/2MS有机，1/2MS铁盐，15g/L蔗糖，4.5g/L植物凝胶，30mg/L潮霉素，pH＝5.8)中，三周后可获得生根的抗性幼苗。对抗性幼苗进行炼苗处理后，可直接移栽于温室，按照常规种植方法种至水稻成熟后获得OsPAO4基因过表达水稻种子。
实施例2 OsPAO4基因过表达转基因水稻分子鉴定和表型分析
(1)OsPAO4基因过表达水稻种子催芽萌发后，在光照培养箱中培养15d，然后移栽至大田中，按常规栽培方法进行管理，直至植株完全成熟。
(2)过表达转基因水稻的分子鉴定：在DNA水平上，利用引物5'-CGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'(SEQ ID NO：7)和5'-CGGTCGGCATCTACTCTATT-3'(SEQ ID NO：8)对转基因水稻叶片基因组DNA中的潮霉素基因(潮霉素基因Hyg为双元载体中自带的筛选标记基因)进行PCR检测；利用引物5'-ACGAAGCTCACCGTGCAC-3'(SEQ ID NO：9)和5'-CAGCAAACCATGCCTCAAGCC-3'(SEQ ID NO：10)对Glb1启动子-PAO4 CDS目的片段进行PCR检测。其中，潮霉素基因的PCR反应体系为：1-2μL叶片基因组DNA模板，2×TaqMix10μL，10μM引物各0.5μL，用双蒸水补至20μL。反应程序为：95℃，变性5min；95℃30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃，10min结束反应。Glb1启动子-PAO4 CDS目的片段的PCR反应体系为：1-2μL叶片基因组DNA模板，2×TaqMix10μL，10μM引物各0.5μL，用双蒸水补至20μL。反应程序为：95℃，变性5min；95℃30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，34个循环；72℃，10min结束反应。
在RNA水平上，对花后15d的转基因籽粒的总RNA进行提取，反转录出cDNA后进行PAO4基因表达水平鉴定(RT-PCR和qRT-PCR)。在RT-PCR方面，PAO4目的基因全长序列扩增所用的引物序列为：5'-ATGGATCCCAATAGCCTCAAAACT-3'(SEQ ID NO：11)和5'-TCAGGTCCTGCAAATCTGAAGG-3'(SEQ ID NO：12)，内参基因Actin的扩增引物序列为：5'-TCATGAAGATCCTGACGGAG-3'(SEQ ID NO：13)和5'-AACAGCTCCTCTTGGCTTAG-3'(SEQ ID NO：14)。PAO4的PCR反应体系为20μL：1-2μL转基因水稻叶片总RNA反转录出的cDNA为模板，2×TaqMix10μL，10μM引物各0.5μL，用双蒸水补至20μL。反应程序为：95℃，变性5min；95℃30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，循环数同Actin内参保持一致；72℃，10min结束反应。Actin的PCR反应体系为20μL：1-2μL转基因水稻叶片总RNA反转录出的cDNA为模板，2×TaqMix10μL，10μM引物各0.5μL，用双蒸水补至20μL。反应程序为：95℃，变性5min；95℃30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，适当循环(约23-25循环)至条带微亮即可；72℃，10min结束反应。在qRT-PCR方面，目的基因PAO4的扩增引物序列为：5'-AAAACTGTCAGACAAGGAGGCC-3'(SEQ ID NO：15)和5'-CCCAGCGTGAAACCAAATAC-3'(SEQ ID NO：16)，内参基因UBQ5的引物序列为：5'-ACCACTTCGACCGCCACTACT-3'(SEQ ID NO：17)和5'-ACGCCTAAGCCTGCTGGTT-3'(SEQ ID NO：18)。qRT-PCR的反应体系为：取2-4μgRNA进行反转录，获得cDNA，扩增方法按照Bio-Rad公司反转录试剂盒说明书进行；使用2×SYBR Green Supermix，添加适当模板，10μM引物各0.4μL，用双蒸水补至20μL，每个样品平行重复三次。在Bio-Rad CFX Connect荧光定量PCR仪上进行反应，扩增程序为：94℃30s，然后94℃5s，60℃30s进行40个循环扩增；然后94℃5s，65℃1min进行熔解曲线分析，获得的数据根据2-ΔΔCt方法计算相应基因的转录水平。
图1为OsPAO4过表达水稻植株潮霉素筛选标记基因的PCR检测结果。显示目的条带的大小为861bp，表明潮霉素筛选标记基因在转基因植株中均被检出。图2为OsPAO4过表达水稻植株目的基因的PCR检测结果。显示目的条带的大小为733bp，表明转基因植株中目的片段(Glb1启动子-PAO4 CDS)均被检出。图3为OsPAO4过表达水稻籽粒的半定量RT-PCR水平检测结果。显示三个过表达水稻花后15d籽粒中PAO4基因的转录水平明显高于野生型。图4为OsPAO4过表达水稻籽粒的qRT-PCR水平检测结果。也表明三个过表达水稻花后15d籽粒中PAO4基因的转录水平显著高于野生型。
(3)OsPAO4基因过表达转基因水稻的整株表型
图5为成熟期OsPAO4过表达水稻的整株表型图，标尺均为50cm。显示过表达水稻能够正常结实，株型无明显改变。
(4)OsPAO4基因过表达转基因水稻籽粒的2AP含量检测
将成熟的饱满籽粒脱壳后低温研磨成细粉，然后利用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合气相色谱-质谱技术(GC-MS)进行2AP含量测定。
图6为OsPAO4过表达水稻籽粒2AP含量的检测结果，其中左边灰色柱子代表野生型，其2AP含量为492.17μg/kg，右边三个黑色柱子分别表示OE3、OE5和OE6过表达植株，籽粒中的2AP含量分别为1537.37μg/kg、1631.17μg/kg和3934.56μg/kg，分别是对照的3.1、3.3和8.0倍，表明胚乳特异性过表达OsPAO4能够显著提高籽粒中的2AP含量。
综上可见，在水稻籽粒中特异过表达OsPAO4基因后，水稻籽粒中的2AP含量得到了显著提高，且OsPAO4基因是香味物质2AP含量的正向调控基因，说明通过控制OsPAO4基因在水稻中的过表达可以作为培育高富集2AP水稻的一种全新的技术手段。同时，本基因的鉴定及功能研究，不仅对阐明水稻OsPAO4基因的生物学功能有重要意义，有利于深入认识2AP在籽粒中的积累机制，而且为优质香稻的育种提供了全新的方向，促进优质稻米的培育。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.多胺氧化酶基因OsPAO4在调控水稻香味物质2AP含量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述水稻为香稻品种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控为在水稻籽粒中特异过表达OsPAO4基因，使水稻籽粒中的2AP含量提高。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因OsPAO4还包括与其相关的生物材料，所述相关的生物材料包括编码OsPAO4基因的蛋白，含有OsPAO4基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.一种培育高富集2AP水稻的方法，其特征在于，通过水稻胚乳特异性启动子驱动OsPAO4基因的表达，提高水稻籽粒中的2AP含量即得。
6.根据权利要求5所述的一种培育高富集2AP水稻的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、将水稻胚乳特异性启动子序列连接至OsPAO4基因的CDS序列，构建OsPAO4胚乳特异过表达载体，OsPAO4基因的CDS序列如SEQ ID NO：1所示；
S2、利用OsPAO4胚乳特异过表达载体转化水稻愈伤组织，对所得转基因水稻愈伤组织进行抗性筛选后即得。
7.根据权利要求5或6所述的一种培育高富集2AP水稻的方法，其特征在于，所述水稻胚乳特异性启动子为球蛋白Glb1启动子，所述球蛋白Glb1启动子具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
8.根据权利要求6所述的一种培育高富集2AP水稻的方法，其特征在于，通过农杆菌介导的遗传转化法用OsPAO4胚乳特异过表达载体转化水稻愈伤组织。
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