CN116194131A - 避免或最小化与car-t细胞治疗相关的副作用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于治疗癌症的化合物和组合物，作为嵌合抗原受体T细胞(CAR‑T)治疗的一部分。具体而言，本发明公开IL‑18结合分子，例如IL‑18结合蛋白(IL‑18BP)，用于在嵌合抗原受体T细胞(CAR‑T)疗法中作为避免或最小化副作用的调节剂。

Description

避免或最小化与CAR-T细胞治疗相关的副作用
本发明提供用于治疗癌症的化合物和组合物，作为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗的一部分。具体而言，本发明提供IL-18结合分子，例如人IL-18结合蛋白(IL-18BP)，用于在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法中作为避免或最小化不希望的副作用的调节剂。
过继T细胞转移(ACT)是输注医学的一个新领域，涉及输注淋巴细胞以介导抗肿瘤、抗病毒或抗炎作用。该领域已从临床前模型中有前途的免疫肿瘤学形式迅速发展到最近CAR-T细胞治疗白血病和淋巴瘤的商业批准。
CAR将抗原结合结构域(最常见的是源自抗体可变结构域的单链可变片段(scFv))与“TCR”链的信号传导结构域以及来自诸如CD28、OX40和CD137的受体的额外共刺激结构域组合。
使用第一代CAR设计在多种癌症患者中进行的初步临床试验的结果令人失望。然而，在2011年，靶向CD19并编码共刺激结构域的第二代CAR-T细胞成为癌症中的工程化T细胞治疗的主要范式。来自评价其他靶点的CAR-T细胞试验的早期结果表明，CD19脱肿瘤交叉反应(offtumor cross-reactions)不是孤例，通常可以用其他谱系依赖性靶点观察到。
目前已显示CAR-T技术在CD19之外具有更广泛的应用，靶向BCMA和CD22的CAR-T细胞的早期临床试验已报道了分别在多发性骨髓瘤和急性淋巴细胞白血病中具有类似的有效抗肿瘤活性。然而，与CD19一样，BCMA和CD22高度局限于B细胞谱系，B细胞谱系存在于可控毒性的可以靶向的组织中。迄今为止，在实体瘤中靶向肿瘤相关抗原的尝试所取得的成功有限。
实体瘤的困难在于，实体瘤通常被不利的免疫抑制微环境包围。这种环境呈现出许多阻碍CAR-T细胞到达它们的抑制因素。在这些条件下，典型的CAR-T方法不会成功。因此，具有新颖设计的CAR-T细胞正在开发中，其被工程化设计为表达额外的细胞因子以促进CAR功能，所述额外的细胞因子如白介素-12(IL-12)(Chmielewski,M.和H.Abken(2017)Cell Rep21(11):3205-3219；Pegram,H.J.等(2012)Blood 119(18):4133-4141；Zhang,T.等(2015)ONCOTARGET 6(32):33961-33971)、IL-15(Hurton,L.V.等(2016)Proc Natl AcadSci U S A113(48):E7788-e7797)以及干扰素-β(IFN-β)(Zhao,Z.等(2015)Cancer Cell28(4):415-428)。
Carl H.June小组(Hu,B.等(2017)Cell Reports 20(13):3025-3033)假设合成的IL-18表达可能促进CAR-T细胞功能。IL-18最初被表征为T细胞中干扰素-γ(IFN-γ)表达的诱导物，在临床试验中已显示其激活淋巴细胞和单核细胞而不会引起严重的剂量限制毒性。Hu等报道了IL-18介导的对人和小鼠T细胞增殖的有效作用。此外，CAR-T细胞分泌合成的IL-18显示出显著增强的CAR-T细胞扩增和抗肿瘤活性。
目前，这些细胞处于临床前和临床早期开发阶段，在实体瘤中表现出强大的性能。
Das等(2016)Blood,127卷,13期,1666-75页公开了中和TNFa或使用IL-18BP治疗可降低噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)的严重程度。Griffin等(2020)BestPractice and research clinical Reumatology,34卷,4期公开了CAR-T治疗可导致CRS，其可演变为HLH。此外，WO 2019/076489涉及用免疫细胞疗法治疗CRS。US 2018/265846涉及表达外源性抗炎或免疫抑制蛋白的CAR细胞。WO 2019/213686涉及用IL-18抑制剂治疗骨髓瘤。
尽管ACT后T细胞激活预期会产生某种程度的免疫刺激和炎症，但CD19特异性、BCMA特异性和CD22特异性CAR-T细胞已观察到严重的细胞因子释放综合征(CRS)。CAR-T细胞相关CRS的严重程度与肿瘤负荷部分相关。在最严重的形式中，CRS与噬血细胞性淋巴组织细胞增多症和巨噬细胞激活综合征共有许多特征，包括持续发热、低血压、缺氧(累及肺部)、其他末端器官损伤和功能障碍(包括肝和肾)、血细胞减少、凝血病、噬血细胞增多症以及神经毒性(Brudno,J.N.和J.N.Kochenderfer(2019)."Recent advances in CAR-T-celltoxicity:Mechanisms,manifestations and management."Blood Rev 34:45-55)。
虽然用T细胞免疫治疗时CRS具有预期毒性，但在CD19特异性CAR-T细胞和BCMA特异性CAR-T细胞的不同临床研究中，也报道了严重程度从轻度到危及生命的意外神经系统并发症。CD19特异性CAR-T细胞的神经毒性在很大程度上是可逆的。目前尚不清楚CAR-T细胞治疗引起的脑水肿是否是CRS的极端表现，或者是否还存在单独的作用机制。为了支持后者，有证据表明内皮损伤，可能与炎症细胞因子有关，对神经毒性的发生有贡献。T细胞免疫治疗介导的CRS和脑水肿的机制尚不清楚，部分原因是该领域缺乏研究这些重要毒性的信息性动物模型。
针对这些CAR-T副作用的管理提出了几种方法。例如，使用托珠单抗(tocilizumab)提供IL-6R阻断改善了CRS症状的管理。然而，IL-6R阻断对CD19特异性CAR-T细胞后神经系统后遗症的影响尚不清楚。
全身皮质类固醇的免疫抑制也可以改善CRS的症状，地塞米松由于其优越的中枢神经系统穿透而成为合理的首选药物。毫不奇怪，使用延长的全身皮质类固醇显示降低CAR-T细胞的持久性和潜在疗效。
因此，需要备选的和更有效的管理解决方案，以帮助避免或最小化CAR-T细胞治疗的这些副作用。
现在令人惊讶地发现，在本发明的范围内，IL-18结合分子例如IL-18结合蛋白(IL-18BP)可以用作CAR-T细胞肿瘤治疗中的联合用药，以避免或最小化副作用，尤其是作为患者游离IL-18水平的调节剂。在CAR-T细胞转移后和/或在副作用的临床表现时，例如炎症反应，如IL-18驱动的高炎性状态，例如以巨噬细胞激活综合征样表现为特征，例如发热、心动过速、肝损伤、噬红细胞作用、高甘油三酯血症、多谱系血细胞减少、凝血病、中枢神经系统功能障碍和/或小肠结肠炎，尤其考虑IL-18结合分子，尤其是本文所提供的IL-18结合蛋白的联合用药。
本发明的IL-18结合分子可在使用工程化为表达额外细胞因子如IL-18的细胞来促进CAR功能的CAR-T细胞治疗中用作IL-18水平的调节剂。
因此，本发明为癌症治疗提供了新的机会。
本发明的治疗方法可以通过使用分别描述于WO 2015/032932和/或WO 2016/139297中的定量测定法与患者体液中游离IL-18的精确定量相结合，其公开内容在此引入作为参考。
因此，本发明的一个目的是提供用于控制CAR-T细胞治疗中的副作用，尤其是由免疫系统过度调节(overshooting of the immune system)和/或细胞因子释放综合征引起的毒性副作用的手段和方法。
该技术问题通过本文中所提供、尤其是权利要求书中所表征的实施方案来解决。
因此，本发明尤其涉及以下实施方案：
1.IL-18结合分子，用于诊断为患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的患者的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法中，以避免或最小化与该CAR-T疗法相关的副作用。
2.用于实施方案1的用途的IL-18结合分子，其作为患者IL-18水平的调节剂，以避免或最小化与该CAR-T疗法相关的副作用。
3.用于实施方案2的用途的IL-18结合分子，其中所述IL-18水平是游离IL-18的水平。
4.用于实施方案1至3中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中所述IL-18结合分子抑制IFN-γ分泌。
5.用于实施方案1至4中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中所述IL-18结合分子抑制IL-18介导的刺激IFN-γ分泌，该分泌由IL-12进一步提高。
6.用于实施方案1至5中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中与肿瘤抗原表达相关的疾病是增生性疾病、癌前病症、癌症和/或与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症。
7.用于实施方案1至6中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中该患者患有癌症，尤其是血液学癌或实体瘤，尤其是表达肿瘤相关抗原的肿瘤。
8.用于实施方案7的用途的IL-18结合分子，其中该癌症是血液学癌，所述血液学癌选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoidleukemia,ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)、B细胞前淋巴细胞白血病(Bcell prolymphocytic leukemia)、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤(blasticplasmacytoid dendritic cell neoplasm)、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病(malignant lymphoproliferative condition)、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生不良(myelodysplasia)和骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrommacroglobulinemia)中的一种或多种。
9.用于实施方案1至8中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中在CAR-T治疗中使用这样的细胞群体，该细胞群体是经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
10.用于实施方案9的用途的IL-18结合分子，其中该细胞经进一步工程化以表达IL-18。
11.用于实施方案1至10中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中该副作用是由于免疫系统过度调节和/或细胞因子释放综合征。
12.用于实施方案11的用途的IL-18结合分子，其中该副作用选自持续发热、低血压、缺氧(累及肺部)、包括但不限于肝和肾的其他末端器官损伤和功能障碍、血细胞减少、凝血病、噬血细胞增多症以及神经毒性。
13.用于实施方案1至12中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其作为患者游离IL-18水平的调节剂。
14.用于实施方案1至13中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其用于降低患者IL-18水平，尤其是游离IL-18水平。
15.用于实施方案1至14中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中该患者是动物，尤其是人。
16.用于实施方案1至15中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其为IL-18结合蛋白(IL-18BP)，包括保留该调节剂活性的任何功能等同物或其功能部分。
17.用于实施方案1至15中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其为特异性结合游离IL-18但不结合复合物中结合的IL-18的IL-18结合抗体，包括保留该调节剂活性的任何功能等同物或其功能部分。
18.用于实施方案16的用途的IL-18结合分子，其为人IL-18BP(hIL-18BP)，优选地为重组人IL-18BP(rhIL-18BP)，包括保留该调节剂活性的任何功能等同物或其功能部分。
19.用于实施方案18的用途的IL-18结合分子，其中所述人IL-18BP选自人IL-18BP的同种型a、b、c和d，尤其是如SEQ ID NO:2中的同种型a、如SEQ ID NO:3中的同种型b、如SEQ ID NO：4中的同种型c或如SEQ ID NO:5中的同种型d，包括同种型a、b、c和/或d的保留该调节剂活性的任何功能等同物或功能部分。
20.用于实施方案19的用途的IL-18结合分子，其为如SEQ ID NO:2所示的IL-18BP，包括保留该调节剂活性的任何功能等同物或其功能部分，优选其中该功能等同物与SEQ ID NO:2所示的序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，并且保留调节剂活性。
21.用于实施方案20的用途的IL-18结合分子，其中所述功能等同物或其功能部分包括保留该调节剂活性的IL-18BP突变蛋白、片段、肽、功能衍生物、功能片段、部分、环状排列的衍生物(circularly permuted derivative)、包含IL-18BP的融合蛋白、其同种型或盐。
22.组合物，其包含IL-18结合分子，尤其是实施方案16至21中任一项所述的IL-18结合分子，用于诊断为患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的患者的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法中，以避免或最小化与该CAR-T疗法相关的副作用，任选地，其中该组合物包含可药用载体和/或溶剂和/或赋形剂。
23.用于实施方案22的用途的组合物，其作为患者IL-18水平的调节剂，以避免或最小化与该CAR-T疗法相关的副作用。
24.用于实施方案22或23的用途的组合物，其中该副作用是由于免疫系统过度调节和/或细胞因子释放综合征。
25.用于实施方案22至24中任一项所述的用途的组合物，其中该疾病是增生性疾病、癌前病症、癌症和/或与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症。
26.用于实施方案22至25中任一项所述的用途的组合物，其中该患者患有癌症，尤其是血液学癌或实体瘤，尤其是表达肿瘤相关抗原的肿瘤。
27.用于实施方案26的用途的组合物，其中该癌症是血液学癌，所述血液学癌选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症中的一种或多种。
28.用于实施方案22至27中任一项所述的用途的组合物，其中该副作用选自持续发热、低血压、缺氧(累及肺部)、包括但不限于肝和肾的其他末端器官损伤和功能障碍、血细胞减少、凝血病、噬血细胞增多症以及神经毒性。
29.用于实施方案22至28中任一项所述的用途的组合物，其包含：
(i)经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞群体，其中该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，以及
(ii)IL-18结合分子，尤其是实施方案15至20中任一项所述的IL-18结合分子。
30.用于实施方案29的用途的组合物，其中(i)的细胞群体经进一步工程化以表达IL-18。
31.用于实施方案22至30中任一项所述的用途的组合物，其中所述IL-18结合蛋白(IL-18BP)进一步包含IL-18BP的N端和/或C端缺失变体。
32.用于实施方案22至31中任一项所述的用途的组合物，其中该患者是动物，尤其是人。
33.用于实施方案22至32中任一项所述的用途的组合物，其以多达40％、尤其是多达30％、尤其是多达20％、尤其是多达15％、尤其是多达10％、尤其是多达7.5％、尤其是多达5％、尤其是多达2.5％、尤其是多达1％、尤其是多达0.5％、尤其是多达0.25％、尤其是多达0.1％、尤其是多达0.05％、尤其是多达0.01％的量包含IL-18BP的N端和/或C端缺失变体。
34.用于实施方案31或33的用途的组合物，其中所述缺失变体包含IL-18BP C端1至5个氨基酸残基之间和/或IL-18BP N端1至30个氨基酸残基之间的缺失。
35.用于实施方案31至34中任一项所述的用途的组合物，其中所述IL-18BP的N端和/或C端缺失变体以多达40％的量、尤其是以2％至35％之间的量存在。
36.实施方案1至21中任一项所述的IL-18结合分子或实施方案22至35中任一项所述的组合物，用于控制和/或调节、尤其是降低患者的IL-18水平，尤其是游离IL-18水平。
37.用于在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法下调节患者IL-18水平以避免或最小化副作用的方法，其包括对有需要的患者施用治疗有效量的IL-18结合分子，尤其是实施方案16至21中任一项所述的IL-18结合分子，或治疗有效量的实施方案22至35中任一项所述的组合物。
38.用于实施方案37的用途的方法，其用于调节，尤其是降低患者IL-18水平，尤其是游离IL-18水平。
39.用于实施方案37或38的用途的方法，其中该患者患有与肿瘤抗原表达相关的疾病，例如增生性疾病、癌前病症、癌症和与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症。
40.用于实施方案39的用途的方法，其中该患者患有癌症，尤其是血液学癌或实体瘤，尤其是表达肿瘤相关抗原的肿瘤。
41.用于实施方案40的用途的方法，其中该癌症是血液学癌，所述血液学癌选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症中的一种或多种。
42.用于实施方案37至41中任一项所述的用途的方法，其中该患者是动物，尤其是人。
43.实施方案37至42中任一项所述的方法，其中该CAR-T细胞和该IL-18结合分子或该组合物分别同时对该患者施用。
44.实施方案37至42中任一项所述的方法，其中该CAR-T细胞和该IL-18结合分子或该组合物分别依次对该患者施用。
45.实施方案37至44中任一项所述的方法，其中该IL-18结合分子或该组合物分别作为CAR-T疗法期间的急性干预对该患者施用。
46.用于实施方案7的用途的IL-18结合分子或用于实施方案26的用途的组合物或实施方案40的方法，其中该癌症是实体瘤，尤其选自结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食管癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌(epidermoidcancer)、鳞状细胞癌(squamous cell cancer)、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、所述癌症的组合以及所述癌症的转移灶(metastatic lesion)。
47.用于实施方案1至21、36或46中任一项所述的用途的IL-18结合分子或用于实施方案22至35或46中任一项所述的用途的组合物或实施方案37至46中任一项所述的方法，其中使用能够检测体液中的游离IL-18的测定法，确定了该患者体液中游离IL-18的异常水平，尤其是其中该游离IL-18的水平超过健康对照受试者的体液中游离IL-18的水平，尤其是超过5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％，所述测定法包含实施方案16至21中任一项所述的IL-18结合分子。
48.用于实施方案47的用途的IL-18结合分子、用于所述用途的组合物或方法，其中用于定量体液中游离IL-18水平的测定法包括以下步骤：
a)使疑似含有游离IL-18的体液样品与作为游离IL-18的捕获分子的实施方案16至21中任一项所述的IL-18结合分子接触；
b)允许该IL-18结合分子与游离IL-18结合；和
c)检测IL-18结合分子的结合并确定样品中游离IL-18的量。
49.用于实施方案47或48中任一项所述的用途的IL-18结合分子、用于所述用途的组合物或方法，其中该体液选自支气管肺泡灌洗液(BALF)循环液、分泌液、活组织检查和匀浆组织，尤其是血清、尿液、眼泪、唾液、胆汁、汗液、呼气或呼出物、痰液、支气管肺泡液；皮脂、细胞的、腺体、黏膜和组织分泌物。
50.用于实施方案1至21、36或46至49中任一项所述的用途的IL-18结合分子或用于实施方案22至35或46至49中任一项所述的用途的组合物或实施方案37至49中任一项所述的方法，其中该患者的疗法进一步包括使用一种或多种检查点抑制剂。
51.用于实施方案50的用途的IL-18结合分子或用于实施方案50的用途的组合物或实施方案50的方法，其中该检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
因此，本发明涉及IL-18结合分子，尤其是IL-18结合蛋白(IL-18BP)，用于在患有与肿瘤抗原表达相关的疾病(例如增生性疾病、癌前病症、癌症和/或与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症)的患者的CAR-T治疗中作为联合用药；尤其是作为调节剂，尤其是作为IL-18的调节剂，尤其是作为CAR-T治疗患者身体样品和/或体液中游离IL-18的调节剂(该IL-18水平可以由于癌症和/或CAR-T细胞经工程化以分泌IL-18而提高)，以避免或最小化与该CAR-T疗法相关的副作用。
本文所用的IL-18结合分子可抑制IFN-γ分泌。本文所用的IL-18结合分子可抑制IL-18介导的刺激IFN-γ分泌，该分泌由IL-12进一步提高。
在一个具体实施方案中，通过使用本发明的IL-18结合分子，尤其是本发明的IL-18BP，CAR-T治疗下的患者体液中的IL-18水平得到调节，尤其是降低，以避免或最小化与该CAR-T疗法相关的副作用，尤其是免疫反应过度调节和/或毒性副作用的风险。IL-18水平可以是游离IL-18水平。
在本发明的一个具体实施方案中，该副作用选自持续发热、低血压、缺氧(累及肺部)、包括但不限于肝和肾的其他末端器官损伤和功能障碍、血细胞减少、凝血病、噬血细胞增多症以及神经毒性。
在本发明中，CAR-T治疗下的患者的身体样品和/或体液中游离IL-18水平的精确定量可以通过使用分别在WO 2015/032932和/或WO 2016/139297中描述的定量测定来进行。取决于在其中所述的测定中测定的游离IL-18水平，可以测定IL-18结合分子的量，其通过避免或最小化副作用，尤其是由于免疫系统过度调节和/或细胞因子释放综合征引起的副作用，确保CAR-T治疗的有效性提高。
在本发明中，该测定法可用于确保仅选择那些需要这种治疗的CAR-T治疗患者，例如在其体液中具有提高的IL-18水平，尤其是提高的游离IL-18水平的患者，并且因此可能对与本文所述的IL-18结合分子，尤其是本文所述的IL-18结合蛋白(IL-18BP)的联合用药产生反应。
额外地或备选地，该测定法可用于监测与本文所述的IL-18结合分子，尤其是本文所述的IL-18结合蛋白(IL-18BP)联合用药的CAR-T的有效性。因此，所治疗的患者体液中提高的IL-18水平(尤其是游离IL-18水平)的降低表明联合用药有效。
具体而言，可用于定量CAR-T治疗下的患者的身体样品和/或体液中游离IL-18水平的测定法可包括以下步骤：
a)使疑似含有游离IL-18的身体样品或体液样品与作为游离IL-18的捕获分子的IL-18结合分子，尤其是本文所述的IL-18结合分子接触；
b)允许该IL-18结合分子与游离IL-18结合；和
c)检测IL-18结合分子的结合并确定样品中游离IL-18的量。
在本发明中，该身体样品和/或体液可选自支气管肺泡灌洗液(BALF)循环液、分泌液、活组织检查(biopsy)和匀浆组织，尤其是血清、尿液、眼泪、唾液、胆汁、汗液、呼气或呼出物、痰液、支气管肺泡液；皮脂、细胞的、腺体、黏膜和组织分泌物。
在一个具体实施方案中，本发明的IL-18结合分子是特异性结合游离IL-18但不结合复合物中结合的IL-18的抗体。
在另一个具体实施方案中，本发明的IL-18结合分子是IL-18结合蛋白(IL-18BP)，尤其是人IL-18BP(hIL-18BP)，尤其是重组人IL-18BP(rhIL-18BP)，包括其保留参考分子的调节剂活性的任何功能等同物或功能部分。
在另一个具体实施方案中，该IL-18BP选自IL-18BP的同种型a、b、c和d，尤其是同种型a，尤其是同型c。
在另一个具体实施方案中，该IL-18BP选自分别如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3、4和5所示的IL-18BP同种型a、b、c和d，但尤其是如SEQ ID NO:2所示的IL-18BP的同种型a，或如SEQ ID NO:4所示的同种型c，包括其保留参考分子的调节剂活性的任何功能等同物或功能部分。
在本发明中，不同组合的上述同种型的混合物可用于本发明的组合物中，但尤其是同种型a和同种型c的混合物，包括其保留参考分子的调节剂活性的任何功能等同物或功能部分。
在本发明中，术语“功能等同物”或“功能部分”意指涉及结合IL-18的参考分子的等同物或部分，且其仍保留选择性结合游离IL-18的能力，因此在CAR-T治疗中作为调节剂发挥作用以避免或最小化副作用。
在本发明的范围内还包含IL-18BP功能突变蛋白、功能片段、功能肽、功能衍生物、功能片段、功能部分、功能环状排列衍生物、包含IL-18BP的功能融合蛋白、其功能同种型或功能盐，其保留选择性结合游离IL-18的能力，因此在CAR-T治疗中发挥作用以避免或最小化副作用，尤其是作为CAR-T治疗下的患者中游离IL-18水平的调节剂发挥作用。
在一个实施方案中，本发明涉及IL-18BP，其是包含全部或部分IL-18BP的融合蛋白，其与免疫球蛋白的全部或部分融合，优选与免疫球球蛋白的恒定区融合，并且其中该融合蛋白仍能够选择性结合游离IL-18，该融合蛋白保留选择性结合游离IL-18的能力，因此在CAR-T治疗中发挥作用以避免或最小化副作用，尤其是作为CAR-T治疗下的患者中游离IL-18水平的调节剂发挥作用。更具体而言，该免疫球蛋白可以是IgG1或IgG2同种型，用于本文所述的实施方案中的任一个实施方案的组合物中。
在另一个实施方案中，本发明涉及IL-18BP，其是包含全部或部分IL-18BP的融合蛋白，其与小分子的全部或部分融合，尤其是与小分子药物的全部或部分融合，任选地，其中该融合是通过接头分子，并且该融合蛋白保留选择性结合游离IL-18的能力，因此在CAR-T治疗中发挥作用以避免或最小化副作用，尤其是作为CAR-T治疗下的患者中游离IL-18水平的调节剂发挥作用。
在一个实施方案中，本发明提供用于本文所述任一实施方案中的IL-18结合分子，其中该抑制剂是IL-18结合蛋白(IL-18BP)，其与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3、4和5所示的序列，但尤其是与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4所示的序列具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，并且保留选择性结合游离IL-18的能力，因此在CAR-T治疗中发挥作用以避免或最小化副作用，尤其是作为CAR-T治疗下的患者中游离IL-18水平的调节剂发挥作用。
在本发明的另一个实施方案中，该IL-18BP可以以多达40％、尤其是多达30％、尤其是多达20％、尤其是多达15％、尤其是多达10％、尤其是多达7.5％、尤其是多达5％、尤其是多达2.5％、尤其是多达1％、尤其是多达0.5％、尤其是多达0.25％、尤其是多达0.1％、尤其是多达0.05％、尤其是多达0.01％的量伴有IL-18BP的N端和/或C端缺失变体。
在一个具体实施方案中，IL-18BP的所述N端和/或C端缺失变体以多达40％的量、尤其是以2％至35％之间的量存在。
具体而言，所述缺失变体可以包含IL-18BP C端1至5个氨基酸残基之间和/或IL-18BP N端1至30个氨基酸残基之间的缺失。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及组合物，其包含IL-18结合分子，尤其是本文提供的IL-18结合蛋白，用于患有与肿瘤抗原表达相关的疾病(例如增生性疾病、癌前病症、癌症和与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症)的患者中的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗，尤其是以提高治疗的有效性和/或作为所治疗的患者中IL-18水平的调节剂以避免或最小化副作用，尤其是与CAR-T治疗相关的副作用，尤其是由于免疫系统过度调节和/或细胞因子释放综合征引起的副作用。
在本发明的一个具体实施方案中，该副作用选自持续发热、低血压、缺氧(累及肺部)、包括但不限于肝和肾的其他末端器官损伤和功能障碍、血细胞减少、凝血病、噬血细胞增多症以及神经毒性。
在另一个实施方案中，本发明涉及组合物，其包含IL-18结合分子，尤其是本文提供的IL-18结合蛋白，此外还包含本文提供的IL-18BP的N端和/或C端缺失变体，用于有需要的患者的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗，以提高治疗的有效性和/或用于控制、调节、尤其是降低患者的IL-18水平，尤其是游离IL-18水平。
具体而言，本发明的IL-18结合分子和包含IL-18结合分子的组合物可用作调节剂，尤其是所治疗的患者中IL-18水平的调节剂，尤其是所治疗的患者的游离IL-18水平的调节剂，以避免或最小化副作用，尤其是与CAR-T治疗相关的副作用，尤其是由于免疫系统过度调节和/或细胞因子释放综合征引起的副作用。
具体而言，本发明的组合物可以包含：
(i)经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞群体，其中该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，以及
(ii)IL-18结合分子，尤其是本文提供的IL-18结合蛋白。
在一个具体实施方案中，(i)的细胞群体经进一步工程化以表达IL-18。
在另一个具体实施方案中，该组合物进一步包含IL-18BP的N端和/或C端缺失变体，尤其是IL-18BP的N端和/或C端缺失变体，尤其是本文所述的缺失变体。
在另一具体实施方案中，上述组合物进一步包含可药用载体和/或赋形剂。
在本发明的多个实施方案中，该IL-18结合分子、尤其是本文所述的本发明的IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)，或本文所述的本发明的组合物，其包含所述IL-18结合分子、尤其是本发明的IL-18BP，并任选地进一步包含IL-18BP的N端和C端缺失变体(包括其任何功能等同物或功能部分)，用作CAR-T治疗中的联合用药，尤其是作为调节剂，以避免或最小化副作用，尤其是由于免疫系统过度调节和/或细胞因子释放综合征引起的副作用。
具体而言，该CAR-T治疗用于患有与肿瘤抗原表达相关的疾病(例如增生性疾病、癌前病症、癌症和/或与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症)的患者。
具体而言，本发明的IL-18结合分子和包含该IL-18结合分子的组合物用于哺乳动物的、尤其是人的CAR-T治疗。
在一个具体实施方案中，本发明的IL-18结合分子和包含该IL-18结合分子的组合物用于CAR-T治疗，尤其是用于治疗血液系统肿瘤和/或实体瘤，尤其是表达肿瘤相关抗原的肿瘤。
具体而言，该癌症可以是血液学癌，尤其是选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和白血病前期中的一种或多种的血液学癌。
在一个具体实施方案中，该癌症可以是实体瘤，尤其是选自以下癌症：结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食管癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、所述癌症的组合以及所述癌症的转移灶。
在一个实施方案中，本发明的IL-18结合分子和包含该IL-18结合分子的组合物，尤其是本发明的包含(i)经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)并进一步工程化以表达IL-18的细胞群体，其中该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，和(ii)IL-18结合分子，尤其是本文提供的IL-18结合蛋白的组合物，用于治疗实体瘤，尤其是表达肿瘤相关抗原的肿瘤，尤其是非小细胞肺癌、恶性胸膜间皮瘤或多形性胶质母细胞瘤的CAR-T治疗。
本文所用的治疗或处理包括预防、停止、缓解和/或逆转与待治疗的疾病或病症相关的症状。
在本发明中，治疗或处理可以至少持续到所治疗的患者表现出治疗反应。
在多个其他实施方案中，本发明涉及本发明的IL-18结合分子，尤其是本文所述的本发明的IL-18BP，或包含本发明的IL-18结合分子，尤其是本文所述的本发明IL-18BP的组合物，用于前述实施方案中的任一个实施方案，其中：
·与患有该疾病或病症的未治疗的个体相比，IFNγ、IL-13和/或IL-17A的表达增加得到改变，尤其抑制；和/或
·IL-18BP与游离IL-18的结合通过捕获和中和组织和循环中过量的游离IL-18来补偿IL-18/IL-18BP失衡；和/或
·IL-18结合受到限制或抑制，所述IL-18结合尤其是游离IL-18与IL-18受体(IL-18R)的结合，但尤其是游离IL-18与IL-18Rα的结合；和/或
·IL-18BP使IL-18与IL-18受体的结合，尤其是与IL-18Rα的结合降低了至少5％、尤其是至少10％、尤其是至少15％、尤其是至少20％、尤其是至少25％、尤其是至少30％、尤其是至少40％、尤其是至少45％、尤其是至少50％、尤其是至少55％、尤其是至少60％、尤其是至少65％、尤其是至少70、尤其是至少75、尤其是至少80、尤其是至少85％、尤其是至少90％、尤其是至少95％、尤其是100％；和/或
·IL-18BP通过限制或阻止IL-18与IL-18受体(IL-18R)的结合，尤其是游离IL-18与IL-18Rα的结合来中和游离IL-18。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)，或涉及包含本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)的组合物，用于前述实施方案中的任一个实施方案，其中与健康对照中的≤4pg/mL相比，确定体液中游离IL-18的水平为≥5pg/mL，尤其是多达10000pg/mL。
在一个具体实施方案中，体液中游离IL-18的水平是正常水平的两到三倍。
体液中游离IL-18的确定可通过使用用于定量体液中、身体样品中或原位的游离IL-18水平的测定法来完成，该测定法包括以下步骤：
a)使疑似含有游离IL-18的体液样品或身体样品或身体区域与IL-18结合分子、尤其是IL-18BP接触，该IL-18结合分子、尤其是IL-18BP特异性结合游离IL-18，但不结合复合物中结合的IL-18，并作为游离IL-18的捕获分子发挥作用；
b)允许该IL-18结合分子、尤其是IL-18BP与游离IL-18结合；和
c)检测IL-18与IL-18结合分子、尤其是IL-18BP的结合，并确定样品中或原位游离IL-18的量。
在本发明的一个实施方案中，该样品选自支气管肺泡灌洗液(BALF)循环液、分泌液、活组织检查和匀浆组织，尤其是血清、尿液、眼泪、唾液、胆汁、汗液、呼气或呼出物、痰液、支气管肺泡液；皮脂、细胞的、腺体、黏膜和组织分泌物。
为了确定本发明的样品中游离IL-18的存在或不存在，可以使用本领域普通技术人员已知的任何免疫测定法型式，例如，可以使用利用用于检测的第二试剂的间接检测方法的测定型式，尤其是ELISA、免疫沉淀和凝集测定法。这些测定法的详细描述例如在Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork 1988 555-612、Maertens和Stuyver的WO96/13590、Zrein等(1998)和WO96/29605中给出。
该样品可以是未稀释或稀释的生物流体，例如但不限于血清、尿液、眼泪、唾液、胆汁、汗液、呼气或呼出物、痰液、支气管肺泡液；皮脂、细胞的、腺体、黏膜或组织的分泌物、活组织检查、匀浆组织。
对于原位诊断，可通过本领域已知的方法(例如静脉内、鼻内、腹膜内、脑内、动脉内注射)对待诊断的个体施用该IL-18结合分子，尤其是IL-18BP或其任何活性和功能性部分，以使得IL-18BP与游离IL-18之间可以发生特异性结合。该IL-18结合分子，尤其是IL-18BP，或其任何活性和功能性部分可包含可检测标记，如下文进一步描述。
在本发明的另一个方面，本文所述的游离IL-18的检测可通过免疫测定方法完成。免疫测定法通常包括使测试样品与特异性结合游离IL-18的IL-18结合分子、尤其是本文在多个实施方案中所述的IL-18BP接触，并检测样品中IL-18BP/游离IL-18复合物的存在。免疫测定方法可以选自本领域技术人员已知的多种免疫测定方法，例如竞争性或非竞争性的基于酶的免疫测定法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)和Western印迹等。此外，可以使用多重测定法，包括阵列，其中将该IL-18结合分子、尤其是IL-18BP放置在支持物(例如玻璃珠或平板)上，并与测试样品反应或以其他方式接触。
IL-18结合分子、尤其是IL-18BP的多种化学或生物化学衍生物可以使用已知的方法产生。一种作为包含IL-18分子、尤其是IL-18BP的免疫缀合物的用于诊断的衍生物与可检测标记缀合。然而，在许多实施方案中，不标记IL-18分子、尤其是IL-18BP，但在测定过程中，它通过与另一标记的分子结合或结合于另一标记的分子而被间接标记。本发明涵盖包含IL-18分子、尤其是IL-18BP和标记的分子复合物。
可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。适宜的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适宜的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适宜的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 680、DilC19(3)、罗丹明Red-X、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 546、Texas Red、YOYO-1+DNA、四甲基罗丹明，Alexa Fluor 594、BODIPY FL、Alexa Fluor 488、荧光素、BODIPY TR、BODIPY TMR、羧基SNAR-1、FM 1-43、Fura-2、Indo-1、级联蓝、NBD、DAPI、Alexa Fluor 350、氨基甲基香豆素、萤光黄、碘化丙啶或丹磺酰胺；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括绿色荧光蛋白、修饰的绿色荧光蛋白、萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白(aequorin)，适宜的放射性材料的实例包括125I、131I、35S或3H。
免疫测定通常包括在可检测标记的IL-18分子、尤其是IL-18BP的存在下孵育样品，如生物流体、组织提取物、新鲜收获的细胞或细胞裂解物，并通过本领域公知的许多技术中的任何一种检测结合的IL-18分子、尤其是IL-18BP。用IL-18BP测量游离IL-18水平的一种方法是通过酶免疫测定法(EIA)，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)(Voller,A.等,J.Clin.Pathol.31:507-520(1978)；Butler,J.E.,Meth.Enzymol.73:482-523(1981)；Maggio,E.(编辑),Enzyme Immunoassay,CRC Press,Boca Raton,FL,1980)。在随后暴露于适当的底物时，与IL-18分子、尤其是IL-18BP缀合或与IL-18分子的结合配偶体、尤其是IL-18BP缀合的酶将与底物反应，从而产生可以例如通过分光光度法或荧光法检测的化学部分。
在本发明的一个具体实施方案中，用于任何上述型式但尤其是ELISA型式的IL-18分子、尤其是IL-18BP是IL-18BP同种型a、b、c或d，或其功能等同物或功能衍生物，或其功能片段，尤其是同种型a，尤其是同种型c，或其衍生物，尤其是如SEQ ID NO 2和3、4和5所示的同种型a、b、c或d，但尤其是如SEQ ID NO:2所示的IL-18BP的同种型a或如SEQ ID NO 4所示的同种型c。
此外，上述同种型的混合物可用于本发明的组合物中，但尤其是同种型a和同种型c的混合物。
生物样品可与固相支持物或载体(例如硝酸纤维素)或能够固定细胞、细胞颗粒或可溶性蛋白质的其他固体支持物接触并固定在其上。然后可以用适宜的缓冲液洗涤支持物，然后用可检测标记的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP处理。然后可以用缓冲液第二次洗涤固相支持物，以去除未结合的IL-18结合分子、尤其是未结合的IL-18BP。然后可以通过常规手段检测固体支持物上结合的标记的量。这种技术的一个公知的实例是Western印迹。
在多个实施方案中，本发明提供包含标记的IL-18分子、尤其是本文所述的本发明IL-18BP的组合物。
还在另一个实施方案中，本发明涉及用于调节嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)癌症治疗中的副作用的方法，所述方法包括：
a.在第一个任选步骤中，使用本文在多个实施方案中描述的方法定量所述受试者的体液中游离IL-18的量；
b.对有需要的患者施用治疗有效量的IL-18结合分子、尤其是本文提供的IL-18结合蛋白，或有效量的本文提供的组合物。
具体而言，需要这种治疗的患者是这样的患者，其身体样品或体液中的游离IL-18水平已测定为超过健康对照受试者的身体样品或体液中的游离IL-18水平5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％。
治疗或预防有效量的任一前述实施方案中所述的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物可通过全身、鼻内、面颊、口腔、经黏膜、气管内、静脉内、皮下、尿道内、阴道内、舌下、支气管内、肺内、经皮或肌肉内施用、尤其是支气管肺施用对患者施用。
以适宜的剂型和/或单位和/或剂量间隔对有需要的患者施用本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物。
在一个具体实施方案中，将本文所述的本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)，配制为药物组合物，尤其是包含用于注射的无菌溶液的药物组合物，其优选进一步包含氯化钠，和/或氢氧化钠和/或磷酸钠缓冲液，尤其是浓度在0.01M和0.2M之间，尤其是0.01M和0.15M之间。本文优选在本发明的组合物中包含氯化钠和磷酸钠缓冲液。在一个优选实施方案中，本发明的组合物、尤其是药物组合物包含约0.12M氯化钠和约0.02M磷酸钠缓冲液。
本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)，或包含本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)的组合物，可以单剂量或剂量单位/天、以多剂量或剂量单位/天、以多剂量或剂量单位/周或多剂量或以多剂量或剂量单位/月对有需要的患者施用。单剂量或剂量单位可以分成几个剂量或剂量单位，并在几个小时或一整天内对待治疗的患者施用。
在一个实施方案中，每48小时施用本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)，或包含本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)的组合物。
在一个实施方案中，本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)，或本发明的组合物，可以通过皮下注射施用。具体而言，皮下注射的部位是交替的，尤其是注射部位在大腿和前腹壁的多个象限之外。构成本发明组合物的单剂量的单独注射尤其是在同一身体区域内但不是在完全相同的注射部位施用。
在一个实施方案中，本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)，或本发明的组合物，可以静脉内施用。本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)，或本发明的组合物的制剂，可以使用本领域已知的方法调整用于静脉内使用。
在一个实施方案中，在施用之前，将组合物置于室温，尤其是18-25℃之间。
在一个具体实施方案中，本发明的组合物、尤其是根据前述实施方案中的任一个实施方案使用的组合物的单剂量包含10mg至600mg IL-18BP。
具体而言，该单剂量可以包含10mg至20mg、20mg至40mg、40mg至80mg、80mg至160mg、160mg至320mg或320mg至600mg IL-18BP。
在本发明的多个实施方案中，单剂量可包含0.5mg IL-18结合分子/kg体重和10mgIL-18结合分子/kg体重之间，尤其是1mg IL-18结合分子/kg体重和8mg IL-18结合分子/kg体重之间，尤其是1.5mg IL-18结合分子/kg体重和6mg IL-18结合分子/kg体重之间，尤其是在2mg IL-18结合分子/kg体重和4mg IL-18结合分子/kg体重之间。
在本发明的一个具体实施方案中，单剂量可包含2mg IL-18BP/kg体重和3mg IL-18BP/kg体重之间，尤其是2mg IL-18BP/kg体重。
在一个具体实施方案中，本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)，或包含本发明的IL-18结合分子、尤其是IL-18BP(包括其任何功能等同物或功能部分)的组合物，以每24或48小时0.5mg IL-18结合分子/kg体重和5mg IL-18结合分子/kg体重之间的剂量施用，尤其是每48小时施用2mg IL-18结合分子/kg体重的单剂量。
在另一个具体实施方案中，例如在三周内，每隔一天，以2mg/kg体重的单剂量施用人IL-18BP(rhIL-18BP)(包括其任何功能等同物或功能部分)，或包含重组人IL-18BP(rhIL-18BP)(包括其任何功能等同物或功能部分)的组合物。然而，优选的是，根据患者中假定或测定的游离IL-18水平施用IL-18结合分子，尤其是本文提供的IL-18结合蛋白，尤其是施用IL-18分子，IL-18结合蛋白质，直到假定或测定游离IL-18水平低于认为可接受的水平，例如在健康受试者中观察到的水平。
取决于预期用途和应用，本发明的组合物可以包含额外的药用剂(medicinalagent)、药物制剂(pharmaceutical agent)、载体、赋形剂、缓冲剂、分散剂、稀释剂和/或联合治疗剂如抗炎药、支气管扩张药、抗组胺药、减充血药、镇咳药、抗病毒药和/或免疫抑制药和/或抗癌剂如检查点抑制剂等。
在本发明的一个实施方案中，预防性施用本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物。
在本发明的另一个实施方案中，治疗性施用本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物。
在本发明的一个实施方案中，通过全身、鼻内、眼内、玻璃体内、滴眼液、面颊、口腔、经黏膜、气管内、静脉内、皮下、尿道内、直肠内、阴道内、舌下、支气管内、肺内、经皮或肌内施用，对有需要的患者施用本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物。尤其是，该施用通过皮下注射进行。
本发明的和本文在多个实施方案中公开的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物可以作为液体、液体喷雾、微球、半固体、凝胶或粉末提供，用于经黏膜施用，例如鼻内、面颊、口腔经黏膜、气管内、尿道内、阴道内、舌下、支气管内、肺内和/或经皮施用。此外，该组合物可以是用于面颊、口腔经黏膜和/或舌下施用的固体剂型。鼻内、面颊、口腔气管内、尿道内、阴道内、经黏膜和舌下施用导致本文所述组合物在口腔中在体温下崩解，并且任选地可黏附到口腔的身体组织。此外，本文公开的组合物还可包含一种或多种赋形剂、稀释剂、粘合剂、润滑剂、助凝剂、崩解剂、脱敏剂、乳化剂、黏膜粘附剂、增溶剂、悬浮剂、黏度调节剂、离子强化剂、缓冲剂、载体、表面活性剂、香料或其混合物。
在本发明的一个具体方面，将该IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物配制为肠胃外或静脉内溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、生物黏附贴片、滴剂、海绵、薄膜、锭剂、硬糖、糯米纸囊剂、球体、棒棒糖、圆盘状结构、栓剂或喷雾。
由于黏膜有丰富的血管供应，且表皮缺乏角质层，因此经黏膜施用通常很快。这种药物转运通常会使血液浓度迅速升高，并类似地避免了肠肝循环和胃酸的直接破坏，或肠壁和肝脏代谢的部分首过效应。药物通常需要长时间暴露于黏膜表面才能发生显著的药物吸收。
经黏膜途径也可以比口服途径更有效，因为这些途径可以提供相对更快的吸收和治疗作用的开始。此外，经黏膜途径可优选用于治疗难以吞咽片剂、胶囊或其他口服固体的患者，或患有疾病损害肠道吸收的患者。因此，经黏膜施用IL-18结合分子、尤其是IL-18BP，或包含IL-18结合分子、尤其是IL-18BP和可药用载体和/或赋形剂的组合物具有许多优点。
无论是鼻内还是面颊途径，药物吸收可以延迟或延长，或者吸收速度几乎与静脉推注一样快。由于丰富的血液供应的高穿透性，舌下途径可以提供快速起始作用。
鼻内组合物可根据其形式通过任何合适的方法施用。包括微球或粉末的组合物可使用鼻吹入器装置施用。这些装置的实例是本领域技术人员公知的，并且包括商业粉末系统，如Fisons Lomudal系统。吹入器产生一团细的干粉或微球。吹入器优选提供确保施用基本上固定量的组合物的机制。粉末或微球可直接与吹入器一起使用，吹入器配有用于粉末或微球的瓶子或容器。备选地，可以将粉末或微球填充到胶囊如明胶胶囊中，或适于鼻施用的其他单剂量装置。吹入器优选具有用于打开胶囊或其他装置的机制。此外，该组合物可提供活性成分的初始快速释放，随后持续释放活性成分，例如通过提供多于一种类型的微球或粉末。此外，本领域普通技术人员将熟知适用于向鼻腔施用组合物的备选方法。可以使用任何适宜的方法。对于适宜方法的更详细描述，参考EP2112923、EP1635783、EP1648406、EP2112922(其全部内容在此引入作为参考)。
在本发明的一个实施方案中，本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物可以进一步鼻内施用，即通过吸入，并且因此可以以适合于鼻内施用的形式配制，即作为气雾剂、干粉制剂或液体制剂。适宜的药物载体、赋形剂和/或稀释剂的实例在本领域是公知的，包括但不限于树胶、淀粉(例如玉米淀粉、预糊化淀粉)、糖(例如乳糖、甘露醇、蔗糖、右旋糖(dextrose))、纤维素材料(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如聚甲基丙烯酸酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石、或其混合物。
用于液体制剂的可药用载体是水溶液或非水溶液、悬浮液、干粉制剂、乳剂或油。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯如油酸乙酯。油的实例是动物、植物或合成来源的油，例如，花生油、大豆油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、另一种海洋油或来自奶或蛋的脂质。
本发明还涉及经肺施用(transpulmonary administration)，通过作为干粉、气态或挥发性制剂吸入本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物，经呼吸道进入全身循环。由于肺泡和血管上皮膜具有很强的穿透性，血流量充足，而且有非常大的吸附表面，因此吸收速度几乎与可递送入肺泡的制剂的速度一样快。例如，气雾剂可以从压力包装的计量吸入器(MDI)递送。
本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物，通常将以与考虑到所选择的吸入方式和标准药物实践选择的适宜的药物赋形剂、稀释剂或载体的混合物的形式施用。
在本发明的另一个实施方案中，将IL-18结合分子、尤其是IL-18BP或本文提供的组合物配制成干粉，任选地与至少一种微粒可药用载体一起，该微粒可药用载体可以是一种或多种已知为可药用载体的材料，优选选自已知为干粉吸入组合物中的载体的材料，例如糖类，包括单糖、二糖、多糖和糖醇，如阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、核糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、葡聚糖、甘露醇或山梨醇。尤其优选的载体是乳糖，例如乳糖一水合物或无水乳糖。干粉可作为单位剂量包含在例如明胶或塑料的胶囊中，或(例如铝或塑料的)泡罩中，用于干粉吸入装置，该装置可以是单剂量或多剂量装置，优选以剂量单位与载体一起，其量使每个胶囊的粉末总重量达到5mg-50mg。备选地，干粉可包含在适于递送的多剂量干粉吸入(MDDPI)装置中的储库中。
可以使用任何其他治疗有效的给药途径，例如通过上皮或内皮组织吸收或通过基因治疗，其中将编码活性剂的DNA分子对患者施用(例如通过表达载体)，这导致活性剂在体内表达和分泌。
在用于治疗人类和动物(包括禽类、非人灵长类、狗、猫、猪、山羊、绵羊、牛、马、小鼠、大鼠和兔)的人和兽医学中，本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物可用于治疗本文在多个实施方案中描述的癌症。
在一个具体实施方案中，本发明提供本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物，用于治疗本文在多个实施方案中描述的癌症，其中所述受试者是哺乳动物，尤其是其中所述受试者是人。
水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质，如磷酸缓冲盐溶液、水、乳液，如油/水乳液、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含这类载体的组合物可以通过公知的常规方法制剂。适宜的载体可以包括任何材料，其在与本发明的生物活性化合物组合时，该化合物保持生物学活性。
本领域已经做出了努力以化学方式改变皮肤的屏障性质，以允许某些活性剂的穿透，增强所递送的活性剂的有效性，增加递送时间，减少递送的剂量，减少多种递送方法的副作用，减少患者反应，等等。
在这方面，穿透增强剂已用于增加皮肤表面对药物的穿透性，并且通常是质子接受溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)和二甲基乙酰胺。已经研究并报道为有效的其他穿透增强剂包括2-吡咯烷、N,N-二乙基间甲苯酰胺(Deet)、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷、巯基乙醇酸盐、己醇、脂肪酸和酯、吡咯烷酮衍生物、1,3-二氧杂环己烷和1,3-二氧戊环的衍生物、1-N-十二烷基-2-吡咯烷酮-5-羧酸、2-戊基-2-氧代-吡咯烷乙酸、2-十二烷基-2-氧代-1-吡咯烷乙酸、1-氮杂环庚-2-酮-2-十二烷基乙酸以及氨基醇衍生物，包括1,3-二氧杂环己烷的衍生物等。
经黏膜施用的制剂可包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液、干粉制剂和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。经黏膜载体可包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏或固定油。也可以存在防腐剂和其他添加剂，包括例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本发明的药物组合物可包含蛋白质载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选为人类来源的。
本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物可以局部对身体表面施用，并因此以适合局部施用的形式配制。适宜的局部制剂包括凝胶、软膏、乳膏、乳液、滴剂等。对于局部施用，制备本文在多个实施方案中公开的本发明的组合物，并将其作为含有或不含药物载体的生理学上可接受的稀释剂中的溶液、悬浮液或乳液应用。
本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物也可以作为受控释放组合物施用，即其中活性成分在一段施用后时间内释放的组合物。受控或缓释组合物包括亲脂性储库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。在另一个实施方案中，该组合物是立即释放组合物，即其中所有活性成分在施用后立即释放的组合物。
WO 2006/085983中提供了适宜的制剂的其他实例，其全部内容在此引入作为参考。例如，本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物可以作为脂质体制剂提供。用于形成脂质体悬浮液的技术在本领域中是众所周知的。所使用的脂质层可以是任何常规组合物，并且可以含有胆固醇或可以不含胆固醇。脂质体可以通过使用标准超声处理和匀浆技术来减小尺寸。含有本文在多个实施方案中公开的本发明的药物组合物的脂质体制剂可以冻干以产生冻干物，该冻干物可以用可药用载体如水重构，以再生脂质体悬浮液。本文在多个实施方案中公开的本发明的药物组合物可以以适宜的剂量对受试者施用。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如医学领域中众所周知的，任何一个受试者的剂量取决于许多因素，包括受试者体型大小、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、给药时间和途径、一般健康以及同时施用的其他药物。
本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物的剂量将取决于所治疗的病症、所使用的具体组合物以及其他临床因素，如受试者的体重、体型大小和病症、体表面积、待施用的具体化合物或组合物、同时施用的其他药物以及给药途径。
本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物可以与其他生物活性物质和程序组合施用，用于治疗与癌症治疗相关的症状。该其他生物活性物质可以是已经包含本发明的组合物的相同组合物的一部分，其形式为混合物，其中本发明的组合物和该其他生物活性物质在相同的可药用溶剂和/或载体中或与相同的可药用溶剂和/或载体相互混合，或可以作为分开的组合物的部分分开提供，其可以以成套部件(kit of parts)的形式分开或一起提供。在本发明中，该其他生物活性物质可以是例如检查点抑制剂，如CTLA-4、PD-1或PD-L1抑制剂。
本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物可以与一种或多种其他生物活性物质同时地、间歇地或依次地施用。例如，本发明的组合物可以与第一额外的生物活性物质同时施用，或者在施用该组合物之后或之前依次施用第一额外的生物活性物质。如果选择这样的应用方案，其中施用一种以上额外的生物活性物质和至少一种本发明的组合物，则该化合物或物质可以同时部分地施用，部分地以多种组合依次施用。
因此，本发明提供本文在多个实施方案中公开的本发明的IL-18结合分子或包含该IL-18结合分子的组合物的混合物，其任选地以治疗或预防有效量包含一种或多种其他生物活性物质，以及将这种混合物用于预防和/或治疗处理的方法。
该其他生物活性物质或化合物可通过与本发明的组合物相同或相似的机制或通过不相关的作用机制或通过多种相关和/或不相关的作用机制发挥其生物效应。
本文在多个实施方案中公开的本发明的组合物的适宜剂量将取决于受试者的病症、年龄和物种，并且可由本领域技术人员容易地确定。兽医和人类医学中使用的总日剂量将适宜地在0.1至10mg/kg的范围内。
此外，IL-18结合分子、尤其是IL-18BP的功能衍生物可以与聚合物缀合，以改善蛋白质的性质，如稳定性、半衰期、生物利用度、人体耐受性或免疫原性。为了达到此目标，IL-18BP可以例如与聚乙二醇(PEG)连接。聚乙二醇化可以通过例如WO 92/13095中描述的已知方法实施。
因此，在本发明的另一个实施方案中，IL-18BP是聚乙二醇化的。
在本发明的另一个实施方案中，IL-18BP是包含IL-18BP的全部或部分的融合蛋白，其与免疫球蛋白的全部或部分融合，优选与免疫球蛋白的恒定区(Fc)融合，并且其中该融合蛋白仍然能够与IL-18结合。更具体而言，该免疫球蛋白可以是IgG1或IgG2同种型。
在本发明的另一个实施方案中，该IL-18BP聚乙二醇化，与免疫球蛋白的全部或部分融合，优选与免疫球蛋白的恒定区(Fc)融合，并且其中该融合蛋白仍然能够与IL-18结合。更具体而言，该免疫球蛋白可以是IgG1或IgG2同种型。
本领域技术人员将理解，所得到的融合蛋白保留IL-18BP的生物学活性，尤其是与IL-18的结合。该融合可以是直接融合，或者通过短接头肽融合，该短接头肽的长度可以短至1至3个氨基酸残基或更长，例如长度为13个氨基酸残基。该接头可以是例如序列E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或包含在IL-18BP序列和免疫球蛋白序列之间引入的Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met(SEQ ID NO:1)的13个氨基酸的接头序列。所得到的融合蛋白具有改进的性质，如在体液中的停留时间(半衰期)延长、比活性提高、表达水平提高或便于融合蛋白的纯化。
优选地，它与例如人IgG1的重链区如CH2和CH3结构域融合。包含IL-18BP和一部分免疫球蛋白的特异性融合蛋白的产生描述于例如WO99/09063的实施例11中。Ig分子的其他同种型也适合用于产生本发明的融合蛋白，如同种型IgG2或IgG4，或其他Ig类，例如IgM或IgA。融合蛋白可以是单体或多聚体、异源或同源多聚体。
定义
除非下文另有说明，在本申请的范围内使用的技术术语和表述通常被赋予在所属领域中通常应用于它们的含义。
除非上下文另有明确规定，本说明书和所附实施方案中所用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如提到“一种化合物”包括一种或多种化合物。
本文中所用的术语“治疗”通常意味着获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言，该效果可以是治疗性的。本文中所用的术语“治疗”涵盖受试者中疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病，即，与预防在可能易患该疾病的受试者中发生不希望的免疫反应相关；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病消退；(d)逆转疾病症状，即导致受损组织的恢复。
本文所用的表述“IL-18结合蛋白(IL-18BP)”包括全长蛋白以及突变蛋白、片段、肽、功能衍生物、功能片段、部分、环状排列的衍生物、包含IL-18BP的融合蛋白、其同种型或盐，其保留全长参考蛋白的特异性活性，尤其是本文所述的CAR-T调节活性。
本文所用的术语“游离IL-18”是指单体、可溶性和非复合的白介素-18蛋白。
术语“功能”和“活性”在本文中同义地使用，并指经修饰的IL-18结合分子，尤其是经修饰的IL-18BP，或指其部分，其仍然具有与未修饰的或全长的IL-18结合分子、尤其是未修饰的IL-18BP相同的生物学、药理学和治疗特性，并且因此可以在本发明中以与未修饰的或全长的IL-18结合分子、尤其是未修饰IL-18BP相同的方式用于治疗本文公开的疾病和病症。具体而言，“功能”是指经修饰的IL-18结合分子，尤其是IL-18BP，在CAR-T治疗中仍然保留了IL-18结合分子、尤其是IL-18BP的IL-18调节活性，并因此仍然能够最小化或避免CAR-T治疗的副作用，尤其是通过控制或降低接受治疗的患者中游离IL-18的水平。
在本发明的多个实施方案中，术语“IL-18BP”是指人IL-18BP，尤其是重组人IL-18BP，尤其是IL-18BP的同种型a、b、c或d，尤其是同种型a，尤其是同种型c，尤其是如SEQ IDNO 2和SEQ ID NO:3、4和5所示的同种型a、b、c或d，但尤其是如SEQ ID NO:2所示的IL-18BP的同种型a或如SEQ ID NO 4所示的同种型c。
用于本发明目的的“患者”或“受试者”可互换使用，并且意在包括人类和其他动物，尤其是哺乳动物，以及其他生物。因此，该方法适用于人类治疗和兽医应用。在优选实施方案中，该患者或受试者是哺乳动物，而在最优选的实施方案中，该患者或受试者是人。
表述“组合物”和“药物组合物”在本文中可互换使用，并且为了本发明的目的，意指治疗有效的组合物，尤其是治疗有效量的活性成分，即IL-18结合分子，尤其是IL-18BP，任选地，可药用载体和/或赋形剂。
它包括适合用于人类或非人类动物中病症的治愈性治疗、控制、改善、改进或疾病或病症的预防的组合物。因此，它包括用于人类或兽医领域的药物组合物。这种“组合物”的特征在于其包含至少一种IL-18结合分子，尤其是IL-18BP或其生理学上可接受的盐，以及任选的载体或赋形剂，由此该盐以及该载体和赋形剂为用其治疗的目标生物体所耐受。
“治疗有效量”是指对给定病症和施用方案提供治疗效果的量。具体而言，“治疗有效量”是指有效预防、逆转、缓解或改善疾病症状或延长所治疗的受试者(可以是人或非人动物)的生存期的量。治疗有效量的测定在本领域技术人员的技术范围内。具体而言，在本申请中，“治疗或预防有效量”是指蛋白质或肽、突变蛋白、功能衍生物、部分、环状排列的衍生物、融合蛋白、其同种型或盐、以及化合物或药物组合物的量，在对人或动物施用时，其在该人或动物中产生治疗或预防作用。有效量由本领域技术人员按照常规程序容易地确定。本发明的化合物的治疗有效量或剂量可以在宽范围内变化，并且可以以相关领域中已知的方式确定。剂量可以在大范围内变化并且当然必须根据每种具体情况下的个体需求进行调整。
术语“经黏膜”施用是指多种给药途径，其中化合物被身体任何部分的黏膜吸收。经黏膜施用包括但不限于，即鼻内、面颊、口服经黏膜、气管内、尿道内、直肠内、阴道内、舌下、支气管内、肺内和经皮施用。
定义“可药用”意在涵盖任何载体、赋形剂、稀释剂或溶媒，其不会干扰活性成分的生物学活性的有效性，并且对施用的宿主没有毒性。
术语“融合蛋白”是指包含IL-18BP、或病毒IL-18BP或其突变蛋白或片段的多肽，其与另一种蛋白融合，该另一种蛋白例如在体液中具有延长的停留时间。因此，IL-18BP或病毒IL-18BP可以与另一种蛋白、多肽等，例如免疫球蛋白或其片段融合。
这些同种型、突变蛋白、融合蛋白或功能衍生物保留IL-18BP的生物学活性，尤其是与IL-18的结合，并且优选具有基本上至少类似于IL-18BP的活性。理想情况下，与未修饰的IL-18BP相比，这类蛋白质具有甚至增加的生物学活性。优选的活性部分具有比IL-18BP的活性更好的活性，或具有其他优势，如更好的稳定性或更低的毒性或免疫原性，或它们更容易大量生产，或更容易纯化。
术语“白介素-18结合蛋白”(IL-18BP)还包含IL-18BP的功能等同物，包括突变蛋白、功能衍生物、部分、生物活性肽、环状排列的衍生物、融合蛋白、同种型及其盐。
具体而言，IL-18BP的功能等同物可以与SEQ ID NO:2所示的序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，并且其保留参考分子的调节剂活性，优选保留本文所述的IL-18结合特异性和避免或最小化副作用的能力。
本文所用的术语“突变蛋白”指IL-18BP的类似物或病毒IL-18BP的类似物，其中与野生型IL-18BP或病毒IL-18BP相比，天然IL-18BP或病毒IL-18BP的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基替代或缺失，或将一个或多个氨基酸残基添加到IL-18BP或病毒IL-18BP的天然序列中，而不会显著改变所得到的产物的活性。这些突变蛋白通过已知的合成和/或定点诱变技术、高通量诱变、DNA改组、蛋白质进化技术或任何其他适合的已知技术制备。
任何这样的突变蛋白优选具有与IL-18BP的氨基酸序列充分重复的氨基酸序列，或与病毒IL-18BP充分重复的序列，以具有与IL-18BP基本相似的活性。IL-18BP的一种活性是其结合IL-18的能力。只要突变蛋白对IL-18具有实质性的结合活性，其可用于纯化IL-18，如通过亲和层析，因此可认为其具有与IL-18BP基本相似的活性。因此，可以通过常规实验来确定任何给定的突变蛋白是否具有与IL-18BP基本相同的活性，该常规实验包括对这种突变蛋白进行例如简单的夹心竞争测定以确定其是否与适当标记的IL-18结合，如放射免疫测定法或ELISA测定法。
可根据本发明使用的IL-18BP多肽的突变蛋白或病毒IL-18BP的突变蛋白或其编码核酸包括有限组的基本上对应的序列作为取代肽或多核苷酸，其可基于本文提出的教导和指导，由本领域普通技术人员常规获得而无需过度实验。
本发明的突变蛋白的优选变化是所谓的“保守”取代。IL-18BP多肽或蛋白质或病毒IL-18BP的保守氨基酸取代可以包括具有充分相似的物理化学性质的组内的同义氨基酸，该组成员之间的取代将保留分子的生物学功能(Grantham,1974)。显而易见，氨基酸的插入和缺失也可以在不改变其功能的情况下在上文定义的序列中进行，尤其是如果插入或缺失仅涉及少数氨基酸，例如30个氨基酸以下，优选10个氨基酸以下，并且不去除或取代对功能构象至关重要的氨基酸，例如半胱氨酸残基。由这种缺失和/或插入产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明的范围。
本文所用的“功能衍生物”涵盖IL-18BP或病毒IL-18BP及其突变蛋白和融合蛋白的衍生物，这可通过本领域已知的方法从作为残基上的侧链出现的官能团或N或C端基团制备，并且包括在本发明内，只要它们保持药学上可接受的活性，即，它们不破坏与IL-18BP或病毒IL-18BP的活性基本相似的蛋白质的活性，并且不赋予含有它的组合物毒性特性。
这些衍生物可以例如包括聚乙二醇侧链，其可以掩盖抗原位点并延长IL-18BP或病毒IL-18BP在体液中的停留。其它衍生物包括羧基的脂族酯、通过与氨或与伯胺或仲胺反应的羧基的酰胺、与酰基部分形成的氨基酸残基的自由氨基的N-酰基衍生物(例如链烷醇或碳环芳基)或与酰基部分形成的自由羟基(如丝氨酸或苏氨酸残基的羟基)的O-酰基衍生物。
作为IL-18BP或病毒IL-18BP、突变蛋白和融合蛋白的“功能片段”，本发明涵盖IL-18BP蛋白分子的多肽链的任何片段或前体，单独或连同与其相连的相关分子或残基，例如糖或磷酸盐残基，或蛋白分子或糖残基自身的聚集体，条件是该部分具有与IL-18BP基本相似的活性。
本文中的术语“盐”是指IL-18BP分子或其类似物的羧基盐和氨基的酸加成盐。羧基盐可通过本领域已知的方法形成，包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等，以及与有机碱形成的盐，例如与胺形成的盐，如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等。酸加成盐包括例如与无机酸(例如盐酸或硫酸)的盐，以及与有机酸(例如乙酸或草酸)的盐。当然，任何这样的盐都必须保留IL-18BP的生物学活性，例如结合游离IL-18的能力。
IL-18BP的“同种型(Isoforms)”是能够结合IL-18的蛋白质或其片段，其可通过备选性剪接产生。
本文中使用的术语“抑制”、“中和”或“阻断”必须理解为同义词，其意指将分子、反应、相互作用、基因表达、mRNA和/或蛋白质的表达、稳定性、功能或活性减少可测量的量或完全阻止。抑制剂是例如结合、部分或完全阻断刺激、减少、预防、延迟激活、失活、脱敏或下调蛋白质、基因和mRNA稳定性、表达、功能和活性的化合物，例如拮抗剂。
术语“嵌合抗原受体”或备选地“CAR”是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常为两种，在其位于免疫效应细胞中时，对该细胞提供对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性和细胞内信号产生。在一些实施方案中，CAR至少包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文也称为“胞内信号传导结构域”)，该胞质信号传导结构域包含源自下文定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一些实施方案中，该组多肽彼此邻接。在一些实施方案中，该组多肽包括二聚化开关，其在二聚化分子存在时可将多肽彼此偶联，例如可将抗原结合结构域偶联至胞内信号传导结构域。在一个方面，该刺激分子是与T细胞受体复合物相关的ζ链。在一个实施方案中，该胞质信号传导结构域进一步包含一个或多个源自下文定义的至少一个共刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个方面，该共刺激分子选自本文所述的共刺激分子，例如4-1BB(即CD137)、CD27和/或CD28。在一个实施方案中，该CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域包含源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，该CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域包含源自共刺激分子的功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，该CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域包含源自一个或多个共刺激分子的两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，该CAR包含嵌合融合蛋白，该嵌合融合蛋白包含胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域，该胞内信号传导结构域包含源自一个或多个共刺激分子的至少两个功能性信号传导结构域和源自刺激分子的功能性信号传导结构域。在一个实施方案中，该CAR在CAR融合蛋白的氨基端(N端)包含任选的前导序列。在一个实施方案中，该CAR进一步在胞外抗原结合结构域的N端包含前导序列，其中在细胞处理和CAR定位到细胞膜期间，该前导序列任选地从抗原结合结构域(例如scFv)切割。
包含靶向特定肿瘤标记物X(如本文所述的那些)的抗原结合结构域(例如scFv或TCR)的CAR也称为XCAR。例如，包含靶向CD19的抗原结合结构域的CAR称为CD19CAR。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能部分，其通过在细胞内传递信息，来通过产生第二信使或通过响应这些信使而作为效应物发挥作用，经确定的信号传导途径调节细胞活性。
包含抗体或其抗体片段的CAR部分可以以多种形式存在，其中该抗原结合结构域表达为包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体的连续多肽链的一部分(Harlow等,1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等,1989,In:Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等,1988,Science242:423-426)。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一方面，该CAR包含含有scFv的抗体片段。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多已知方案中的任何一种来确定，包括Kabat等(1991),"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD("Kabat"编号方案)、Al-Lazikani等,(1997)JMB 273,927-948("Chothia"编号方案)所述的那些，或其组合。
术语“抗体片段”是指抗体的至少一部分，其保留与抗原表位特异性相互作用(例如通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CHI结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体，如包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段，以及分离的CDR或抗体的其他表位结合片段。还可以将抗原结合片段掺入单结构域抗体、大型抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、纳米抗体(nanobody)、胞内抗体(intrabody)、双体抗体(diabody)、三体抗体(triabody)、四体抗体(tetrabody)、v-NAR和双scFv(参见例如Hollinger和Hudson,Nature Biotechnology 23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植入基于多肽如III型纤连蛋白(Fn3)的支架(参见美国专利号6703199，其描述了纤连蛋白多肽微型抗体)。
术语“scFv”是指包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中该轻链可变区和重链可变区例如通过合成接头(例如短柔性多肽接头)邻接，并且能够表达为单链多肽，并且其中该scFv保持其来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，本文所用的scFv可以具有任一种顺序的VL和VH可变区，例如相对于多肽的N端和C端，该scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。
包含抗体或其抗体片段的CAR部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等,1989,In:Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883；Bird等,1988,Science242:423-426)。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一方面，该CAR包含含有scFv的抗体片段。
本文所用的术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一个实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，它包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列具有对第一表位的结合特异性，该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列具有对第二表位的结合特异性。在一个实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性抗体。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
术语“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种多肽链中的较大者，其通常决定抗体所属的种类。
术语“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种多肽链中的较小者。卡帕(κ)和拉姆达(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体或酵母表达系统表达的抗体。该术语还应解释为指通过合成编码抗体的DNA分子而产生的抗体，该DNA分子表达抗体蛋白，或指定抗体的氨基酸序列，其中该DNA或氨基酸序列使用本领域可用且众所周知的重组DNA或氨基酸序列技术获得。
术语“抗原”或“Ag”是指引发免疫反应的分子。这种免疫反应可以涉及抗体产生，或特异性免疫活性T细胞的激活，或两者兼而有之。本领域技术人员将理解，任何大分子，包括几乎所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组或基因组DNA。本领域技术人员将理解，包含编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码本文所用术语的“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见，本发明包括但不限于使用一个以上基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以多种组合排列以编码引发所希望的免疫反应的多肽。此外，熟练的技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。显而易见，抗原可以合成产生，或者可以源自生物样品，或者可以是多肽以外的大分子。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或具有其他生物成分的流体。
术语“抗癌作用”是指可以通过多种方式表现的生物效应，包括但不限于，例如肿瘤体积减小、癌细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命延长、癌细胞增殖减少、癌细胞存活降低、或与癌症状况相关的多种生理症状的改善。“抗癌作用”还可以表现为肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防癌症发生方面的能力。术语“抗肿瘤作用”是指可以通过多种手段表现的生物效应，包括但不限于，例如肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活降低。
短语“与本文所述肿瘤抗原表达相关的疾病”包括但不限于与本文所述肿瘤抗原表达相关的疾病或与表达本文所述肿瘤抗原的细胞相关的疾病，包括例如增生性疾病，如癌症或恶性肿瘤或癌前状态，如骨髓增生不良、骨髓增生异常综合征或白血病前期；或与表达本文所述肿瘤抗原的细胞相关的非肿瘤相关适应症。在一个方面，与本文所述肿瘤抗原表达相关的癌症是血液学癌。在一个方面，与本文所述肿瘤抗原表达相关的癌症是实体癌症。与本文所述肿瘤抗原表达相关的其他疾病包括但不限于，例如，与本文所述肿瘤抗原表达相关的非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、癌前状态或增生性疾病。与本文所述肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于，例如，自身免疫病(例如狼疮)、炎性疾病(过敏和哮喘)和移植。在一些实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时候表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如，野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施方案中，表达肿瘤抗原的细胞在一个点上产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，随后产生基本上不可检测的肿瘤抗原蛋白。
术语“癌症相关抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指这样的分子(通常是蛋白质、糖类或脂质)，其完全或作为片段(例如MHC/肽)表达在癌细胞表面，并且用于将药剂优先靶向癌细胞。在一些实施方案中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如谱系标志物，例如B细胞上的CD19。在一些实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过量表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比，过量表达1倍、2倍、3倍或更多。在一些实施方案中，肿瘤抗原是在癌细胞中不适当地合成的细胞表面分子，例如，与正常细胞上表达的分子相比，含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，肿瘤抗原将完全或作为片段(例如MHC/肽)专门表达在癌细胞的细胞表面上，而不是合成或表达在正常细胞的表面上。在一些实施方案中，本发明的CAR包括含有结合MHC呈递的肽的抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段)的CAR。通常，源自内源性蛋白质的肽充满主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的口袋，并被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成性表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物是免疫治疗的一类独特的细胞表面靶点。已经描述了在人白细胞抗原(HLA)-Al或HLA-A2的背景下靶向源自病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见例如Sastry等,J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva等,Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等,J Immunol 2010184(4):2156-2165；Willemsen等,Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao等,Sci Transl Med 20135(176):176ra33；Tassev等,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，TCR样抗体可通过筛选文库如人scFv噬菌体展示文库来鉴定。
在本发明的背景下，“肿瘤抗原”或“过度增生性疾病抗原”或“与过度增生性疾病相关的抗原”是指特定过度增生性疾病如癌症的常见抗原。
序列简述
SEQ ID NO 1：hIL-18BP的13个氨基酸的接头序列：
Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met
SEQ ID NO 2：IL-18结合蛋白(hIL-18BP)同种型a的氨基酸序列
TPVSQTTTAA TASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT WPEVEVPLNG TLSLSCVACSRFPNFSILYW LGNGSFIEHL PGRLWEGSTS RERGSTGTQL CKALVLEQLT PALHSTNFSC VLVDPEQVVQRHVVLAQLWA GLRATLPPTQ EALPSSHSSP QQQG
SEQ ID NO 3：IL-18结合蛋白(hIL-18BP)同种型b的氨基酸序列
TPVSQTTTAA TASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT WPEVEVPL SWAEGNLAPHPRSPALQPQQ STAAGLRLST GPAAAQP
SEQ ID NO:4：IL-18结合蛋白(hIL-18BP)同种型c的氨基酸序列
TPVSQTTTAA TASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT WPEVEVPLNG TLSLSCVACSRFPNFSILYW LGNGSFIEHL PGRLWEGSTS RERGSTGTQL CKALVLEQLT PALHSTNFSC VLVDPEQVVQRHVVLAQLWV RSPRRGLQEQ EELCFHMWGK GGLCQSSL
SEQ ID NO:5：IL-18结合蛋白(hIL-18BP)同种型d的氨基酸序列
TPVSQTTTAA TASVRSTKDP CPSQPPVFPA AKQCPALEVT WPEVEVPLNG TLSLSCVACSRFPNFSILYW LGNGSFIEHL PGRLWEGSTS RERGSTGWAE GNLAPHPRSP ALQPQQSTAA GRLSTGPAAAQP
本发明的特征还在于以下附图、附图说明和以下非限制性实施例。
图1：CAR-T细胞诱导的CRS的IL-18依赖性和非依赖性途径。
图2：IL-18增加来自CAR-T细胞的IFN-γ分泌。三天期间来自CAR-T细胞的IFN-γ分泌的动力学。报告了IFN-γ水平对比单用CAR-T细胞观察到的水平的差异的统计显著性(*：p<0.05；**：p<0.005)。
图3：rhIL-18BP废除了IL-18介导的IFN-γ分泌。在每一天归一化为第1天用肿瘤+CAR-T细胞观察到的水平后培养基中IFN-γ水平的累积增加。报告了IFN-γ增加相对于用肿瘤+CAR-T细胞观察到的增加的差异的统计显著性(ns：不显著；*：p<0.05；***：p<0.0005)。
图4：rhIL-18BP显著减少IL-12促进的IFN-γ分泌。在每一天归一化为第1天用肿瘤+CAR-T细胞观察到的水平后培养基中IFN-γ水平的累积增加。报告了IFN-γ增加相对于用肿瘤+CAR-T细胞观察到的增加的差异的统计显著性(*：p<0.05；***：p<0.0005)。
实施例
实施例1在治疗鼠B16F10黑素瘤的CAR-T细胞中产生转基因编码的小鼠IL-18。rhIL-18BP在减轻CAR-T细胞治疗诱导的IL-18驱动的细胞因子释放综合征中的功效。
IL-18信号传导增强TCR信号传导，因此得出结论，它也可以增强CAR-T激活/增殖，因为CAR-T包含用于T细胞激活和增殖的TCR信号传导结构域。但值得注意的是，CAR-T激活增加可以导致抗原特异性T细胞激活过度，也可以导致模拟类似于细胞因子释放综合征的高炎性状态的Ag非特异性激活。
方法
鼠T细胞经工程化以表达鼠IL-18和针对鼠CD19(特异性肿瘤相关抗原)的抗体片段(鼠CD19-IL-18)。将鼠CD19-IL-18CAR-T细胞过继转移至携带表达表面抗原CD19的B16F10黑素瘤的C57BL/6小鼠。CAR-T细胞中IL-18的共表达导致T-bethigh表型的发展，使CAR-T细胞向Th1效应细胞极化，并刺激全身急性炎症反应。
先前已经观察到，在CAR-T细胞转移一周后，小鼠显示血液中非常高的IL-18水平，这与CAR-T细胞的扩增一致，并且随后其降低。与高水平的IL-18一致，小鼠体重下降是细胞因子释放综合征的主要表现，同时伴有不严重的全身炎症表现。
最小化有害副作用的策略是将这种治疗用于实体瘤而不在人类中造成有害并发症的一种有吸引力的方法。
在CAR-T细胞转移后的一些天施用rhIL-18BP令人惊讶地代表了避免有害毒性作用的安全方法。在这方面，在出现副作用时或例如在确定患者循环IL-18水平升高时，rhIL-18BP可以在盐水溶液中按1mg/kg至3mg/kg的剂量静脉内或皮下施用，或静脉内施用一个负荷剂量，然后皮下施用。
实施例2：IL-18依赖性刺激CAR-T细胞诱导的CRS和用IL-18BP缓解
CAR-T细胞治疗被视为一种革命性的癌症治疗；CAR-T细胞治疗的治愈潜力代表了癌症治疗的范式转变。在过去一些年中，该领域取得了快速进展，靶向CD19的CAR-T细胞现已被FDA批准用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤；参见例如Maude SL,Laetsch TW,Buechner J等(2018)“Tisagenlecleucel in children and young adult with B-celllymphoblastic leukemia.”NEngl J Med.378:439-448或Neelapu SS,Locke FL,BartlettNL等(2017)“Axicabtagene ciloleucel CAR-T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma.”N Engl J Med.377:2531-2544。
尽管在缓解率方面取得了有希望的结果，但接受CAR-T细胞输注的患者通常会经历细胞因子释放综合征(CRS)形式的不受控制的免疫激活。这种高炎症反应是一种危及生命的治疗相关毒性，限制了CAR-T细胞治疗的全部治疗潜力。约45％-50％的早期CAR-T细胞试验患者需要重症监护管理。随着CRS管理方面的更多经验和早期干预，这一比率可以降低。
CAR-T细胞输注后CRS的管理目前主要是使用托珠单抗(Tocilizumab)来提供IL-6R阻断。这种治疗改善了CRS症状的管理。尽管如此，IL-6R阻断对CAR-T细胞后神经系统后遗症的影响至今仍不清楚。解释CRS分子基础的一个工作假设是，它是由两种不同的细胞因子信号传导途径(IL-1β/IL-6途径和IL-18/IFN-γ途径)的诱导引起的。到目前为止，专注于第一种途径的治疗方法没有提供完全令人满意的有效性/安全性特征。
IL-18是一种属于IL-1家族的促炎细胞因子，首次鉴定其IFN-γ诱导特性。通过与IL-18结合，IL-18结合蛋白(IL-18BP)中和IL-18，并作为相关免疫反应的关键调节物发挥作用。在健康条件下，所有IL-18都与IL-18BP结合，并且没有或很少有游离的活性IL-18。在患有全身炎性疾病的患者中，IL-18和IL-18BP水平都显著升高，但由于IL-18的提升更高，IL-18BP不能有效地中和IL-18的活性游离形式，这导致游离IL-18的病理性存在。未被IL-18BP失活的游离IL-18持续诱导免疫系统，并可以导致严重的自身炎症状况和CRS，具有潜在的致命后果。
目前正在开发用于治疗严重罕见自身炎性疾病(噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH))的重组人IL-18BP(rhIL-18BP，Tadeking alfa)。HLH是一种高铁蛋白血症性全身炎性疾病，其特征是激活的淋巴细胞和巨噬细胞的不受控增殖，从而引发大量炎性细胞因子的分泌。在HLH患者的病情发展为巨噬细胞激活综合征(MAS)时，在其血清中发现了高水平的IL-18，尤其是游离IL-18；参见Weiss ES,Girard-Guyonvarc'h C,Holzinger D等(2018)“Interleukin-18diagnostically distinguishes and pathogenically promotes humanand murine macrophage activation syndrome.”Blood.131(13):1442-1455。用Tadekingalfa治疗中和了循环的游离IL-18，从而减少和控制IL-18介导的炎症。
用CD19特异性CAR-T细胞治疗的出现CRS的患者存在增加水平的循环细胞因子，其中IFN-γ自基线具有最大相对变化；参见Kalos M,Levine BL,Porter DL等(2011)“T-cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and canestablish memory in patients with advanced leukemia.”Sci Transl Med.3(95):95ra73。特异性CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别导致这些Th1细胞的激活以及IFN-γ和其他可溶性介质分子的分泌。该第一种信号传导涉及细胞与细胞接触，并且是IL-18非依赖性的，参见Rooney C和Sauer T.(2018)“Modelling cytokine release syndrome.”Nat Med.24(6):705-706，而所分泌的介质或与激活的Th1细胞的细胞与细胞接触随后对巨噬细胞的激活释放IL-18，这将接下来触发Th1细胞分泌IFN-γ(图1)。这种信号传导是IL-18依赖性的，并且可以被IL-18BP抑制。此外，IL-18介导的Th1细胞的刺激被辅助分子IL-12优化，IL-12诱导Th1细胞表面IL-18Rβ的表达：IL-18代表对异二聚体IL-18Rαβ的亲和力高于对单体IL-18Rα受体的亲和力，从而稳定其与Th1细胞的结合，并促进IFN-γ的产生；参见Tominaga K,Yoshimoto T,Torigoe K等(2000)“IL-12synergizes with IL-18or IL-1beta for IFN-gamma production from human T-cells.”Int Immunol.12(2):151-160。
这两种途径都促成高水平促炎细胞因子的分泌，包括IL-18，它们的激活可以导致CRS。用Tadeking alfa作为IL-18BP的外源来源管理CAR-T细胞诱导的CRS将恢复IL-18/IL-18BP平衡，并为呈现高水平IL-18的患者提供备选方法。
本研究旨在概述CAR-T细胞的IL-18依赖性刺激，并通过监测激活的CAR-T细胞的IFN-γ分泌来评价rhIL-18BP对CRS的缓解作用。目的是收集证据，证明Tadeking alfa代表了限制CAR-T细胞诱导的CRS相关毒性的治疗选择。
本研究旨在通过监测激活的CAR-T细胞的IFN-γ分泌来跟踪CAR-T细胞刺激。由于IFN-γ是CAR-T细胞诱导的CRS的主要成分之一，这些实验条件提供了一种工具来评价rhIL-18BP对CAR-T细胞治疗后CRS的影响。
CAR-T细胞通过细胞与细胞接触和促炎细胞因子IL-18激活。因此，通过IL-18BP的结合减少游离IL-18有望减少IL-18依赖性CAR-T细胞刺激，从而减少这些CAR-T细胞分泌的IFN-γ。这将带来证据证明，游离IL-18的有效中和减轻了CAR-T细胞介导的CRS，Tadekingalfa构成限制呈现高水平IL-18的CAR-T细胞患者所经历的毒性的一种治疗方法。
在含有或不含rhIL-18(IL-18,100ng/mL,#9124-IL-010,R&D Systems)、rhIL-12(IL-12,10ng/mL,#219-IL-005,R&D Systems)或相对rhIL-18为20倍摩尔过量的rhIL-18BP(IL-18BP,Tadekinig alfa,AB2 Bio)以及这些因子的组合的情况下，按5:1的E:T比将CD19特异性CAR-T细胞(CD19SCFV-CD28-4-1BB-CD3ζCAR-T细胞，#PM-CAR1003-10M，ProMAB)与Raji淋巴瘤靶细胞(#CCL-86，ATCC)共培养。每种条件一式三份进行评估。
在24、48和72小时时间点从每个孔收集细胞培养上清液的等分试样(60μL)，通过ELISA(#EHIFNG，Invitrogen)分析IFN-γ分泌，并用含有相同试剂组合的新鲜培养基替换。根据校准曲线外推IFN-γ的浓度，并计算累积浓度。
表1中报告了IFN-γ的测量浓度以及衍生的计算结果。
培养三天后，与背景水平(仅肿瘤细胞)相比，CAR-T细胞单独培养时不产生显著量的IFN-γ(27.49±0.73pg/mL vs.15.84±2.42pg/mL)。
一旦存在肿瘤细胞，CAR-T细胞产生大量IFN-γ(第1天为6910.5±478.0pg/mL，第3天为32675.1±1449.3pg/mL)。培养物中rhIL-18的存在以更高的速率触发更大的IFN-γ产生，三天后达到70ng/mL以上(图2)。
表1：三天期间(D1；D2和D3)培养基中IFN-γ的浓度和衍生的计算结果。
Figure BDA0004136900260000381
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在每个测试时间点，rhIL-18触发CAR-T和肿瘤细胞共培养产生的IFN-γ的约2倍刺激(图3)。在三天内，IFN-γ水平比基础水平(即不含rhIL-18)平均增加10倍。用rhIL-18BP共处理CAR-T/肿瘤细胞导致IL-18介导的IFN-γ产生的完全抑制(第1天)至92％和79％的减少(分别为第2天和第3天)。
用rhIL-18和rhIL-12共处理CAR-T和肿瘤细胞显著增加了IFN-γ的分泌，在三天内达到基础水平的250倍以上(图4)。加入rhIL-18BP在第1天、第2天和第3天分别使这些水平降低82％、79％和75％。
IFN-γ是一种T细胞介质，在单独培养CAR-T细胞时，不会从CAR-T细胞分泌。在存在肿瘤细胞的情况下，CD19特异性CAR-T细胞产生显著水平的IFN-γ，反映其激活。这种T细胞刺激由通过识别B细胞上的CD19表面抗原进行的细胞与细胞接触启动，并且是IL-18非依赖性的。
加入rhIL-18后，IFN-γ的产生进一步增加，反映了T细胞对这种促炎细胞因子的反应性。从动力学的较陡峭斜率可以看出，与不存在rhIL-18的情况相比，产生速率更大，并且在三天培养后没有达到稳态。即使肿瘤/CAR-T细胞共培养物中IFN-γ的产生在三天内逐渐增加，rhIL-18仍保持恒定的2倍刺激。这有力地支持rhIL-18触发平行信号传导，与细胞与细胞接触所引发的信号传导互补。
用rhIL-18BP共处理导致IL-18介导的IFN-γ产生的刺激在第1天被完全抑制，在第3天仍导致79％降低。
文献中将IL-12描述为IL-18的辅助分子，通过稳定IL-18结合在体内与IL-18协同作用来进一步增加T细胞的激活。实验表明，在肿瘤/CAR-T细胞共培养物中向rhIL-18加入rhIL-12显著提高IFN-γ的产生，并且在加入rhIL-18BP时，这种刺激显著降低(平均80％)。因此，在更接近生理条件的条件下，用rhIL-18BP处理比缺乏rhIL-12的情况下引起类似的T细胞刺激减少。
本研究的实验条件概括了CAR-T细胞的IL-18依赖性刺激，并能够评价rhIL-18BP对CAR-T细胞激活诱导的CRS的缓解作用。其设计涉及CAR-T细胞介导的CRS的主要关键参与者，即CD19特异性CAR-T细胞、Raji B淋巴瘤、T细胞介质IFN-γ、促炎细胞因子IL-18和辅助分子IL-12，两者均由激活的巨噬细胞分泌。
所产生的结果显示，除了肿瘤细胞对CAR-T细胞的IL-18非依赖性低刺激外，还存在由rhIL-18触发并由rhIL-12进一步提高的T细胞的巨大激活。因此，激活的巨噬细胞分泌的高水平游离IL-18的存在进一步刺激CAR-T细胞并加重CRS的程度。这些发现为中和CAR-T细胞治疗后癌症患者血清中过高水平的游离IL-18提供了理论依据。这项研究表明，用rhIL-18BP共处理消除了IL-18介导的CAR-T细胞激活，为Tadeking alfa在CAR-T细胞治疗后出现CRS的患者中的治疗用途提供了证据，目的是中和循环IL-18的不平衡水平。
序列表
<110> AB2生物股份有限公司
<120> 避免或最小化与CAR-T细胞治疗相关的副作用
<130> AD1615 PCT BS
<150> EP 20 18 7684.4
<151> 2020-07-24
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<170> BiSSAP 1.3.6
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<213> 人工序列
<220>
<223> hIL-18BP 13个氨基酸的接头序列
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<213> 哺乳动物
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<223> IL-18结合蛋白(hIL-18BP)的氨基酸序列
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<213> 哺乳动物
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130

Claims (51)

1.IL-18结合分子，用于诊断为患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的患者的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法中，以避免或最小化与该CAR-T疗法相关的副作用。
2.用于权利要求1的用途的IL-18结合分子，其作为患者IL-18水平的调节剂，以避免或最小化与该CAR-T疗法相关的副作用。
3.用于权利要求2的用途的IL-18结合分子，其中所述IL-18水平是游离IL-18的水平。
4.用于权利要求1至3中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中所述IL-18结合分子抑制IFN-γ分泌。
5.用于权利要求1至4中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中所述IL-18结合分子抑制IL-18介导的刺激IFN-γ分泌，该分泌由IL-12进一步提高。
6.用于权利要求1至5中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中与肿瘤抗原表达相关的疾病是增生性疾病、癌前病症、癌症和/或与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症。
7.用于权利要求1至6中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中该患者患有癌症，尤其是血液学癌或实体瘤，尤其是表达肿瘤相关抗原的肿瘤。
8.用于权利要求7的用途的IL-18结合分子，其中该癌症是血液学癌，所述血液学癌选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症中的一种或多种。
9.用于权利要求1至8中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中在CAR-T治疗中使用这样的细胞群体，该细胞群体是经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)，其中该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
10.用于权利要求9的用途的IL-18结合分子，其中该细胞经进一步工程化以表达IL-18。
11.用于权利要求1至10中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中该副作用是由于免疫系统过度调节和/或细胞因子释放综合征。
12.用于权利要求11的用途的IL-18结合分子，其中该副作用选自持续发热、低血压、缺氧(累及肺部)、包括但不限于肝和肾的其他末端器官损伤和功能障碍、血细胞减少、凝血病、噬血细胞增多症以及神经毒性。
13.用于权利要求1至12中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其作为患者游离IL-18水平的调节剂。
14.用于权利要求1至13中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其用于降低患者IL-18水平，尤其是游离IL-18水平。
15.用于权利要求1至14中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其中该患者是动物，尤其是人。
16.用于权利要求1至15中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其为IL-18结合蛋白(IL-18BP)，包括保留该调节剂活性的任何功能等同物或其功能部分。
17.用于权利要求1至15中任一项所述的用途的IL-18结合分子，其为特异性结合游离IL-18但不结合复合物中结合的IL-18的IL-18结合抗体，包括保留该调节剂活性的任何功能等同物或其功能部分。
18.用于权利要求16的用途的IL-18结合分子，其为人IL-18BP(hIL-18BP)，优选地为重组人IL-18BP(rhIL-18BP)，包括保留该调节剂活性的任何功能等同物或其功能部分。
19.用于权利要求18的用途的IL-18结合分子，其中所述人IL-18BP选自人IL-18BP的同种型a、b、c和d，尤其是如SEQ ID NO:2中的同种型a、如SEQ ID NO:3中的同种型b、如SEQ IDNO：4中的同种型c或如SEQ ID NO:5中的同种型d，包括同种型a、b、c和/或d的保留该调节剂活性的任何功能等同物或功能部分。
20.用于权利要求19的用途的IL-18结合分子，其为如SEQ ID NO:2所示的IL-18BP，包括保留该调节剂活性的任何功能等同物或其功能部分，优选其中该功能等同物与SEQIDNO:2所示的序列具有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，并且保留调节剂活性。
21.用于权利要求20的用途的IL-18结合分子，其中所述功能等同物或其功能部分包括保留该调节剂活性的IL-18BP突变蛋白、片段、肽、功能衍生物、功能片段、部分、环状排列的衍生物、包含IL-18BP的融合蛋白、其同种型或盐。
22.组合物，其包含IL-18结合分子，尤其是权利要求16至21中任一项所述的IL-18结合分子，用于诊断为患有与肿瘤抗原表达相关的疾病的患者的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法中，以避免或最小化与该CAR-T疗法相关的副作用，任选地，其中该组合物包含可药用载体和/或溶剂和/或赋形剂。
23.用于权利要求22的用途的组合物，其作为患者IL-18水平的调节剂，以避免或最小化与该CAR-T疗法相关的副作用。
24.用于权利要求22或23的用途的组合物，其中该副作用是由于免疫系统过度调节和/或细胞因子释放综合征。
25.用于权利要求22至24中任一项所述的用途的组合物，其中该疾病是增生性疾病、癌前病症、癌症和与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症。
26.用于权利要求22至25中任一项所述的用途的组合物，其中该患者患有癌症，尤其是血液学癌或实体瘤，尤其是表达肿瘤相关抗原的肿瘤。
27.用于权利要求26的用途的组合物，其中该癌症是血液学癌，所述血液学癌选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症中的一种或多种。
28.用于权利要求22至27中任一项所述的用途的组合物，其中该副作用选自持续发热、低血压、缺氧(累及肺部)、包括但不限于肝和肾的其他末端器官损伤和功能障碍、血细胞减少、凝血病、噬血细胞增多症以及神经毒性。
29.用于权利要求22至28中任一项所述的用途的组合物，其包含：
(i)经工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞群体，其中该CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，以及
(ii)IL-18结合分子，尤其是权利要求15至20中任一项所述的IL-18结合分子。
30.用于权利要求29的用途的组合物，其中(i)的细胞群体经进一步工程化以表达IL-18。
31.用于权利要求22至30中任一项所述的用途的组合物，其中所述IL-18结合蛋白(IL-18BP)进一步包含IL-18BP的N端和/或C端缺失变体。
32.用于权利要求22至31中任一项所述的用途的组合物，其中该患者是动物，尤其是人。
33.用于权利要求22至32中任一项所述的用途的组合物，其以多达40％、尤其是多达30％、尤其是多达20％、尤其是多达15％、尤其是多达10％、尤其是多达7.5％、尤其是多达5％、尤其是多达2.5％、尤其是多达1％、尤其是多达0.5％、尤其是多达0.25％、尤其是多达0.1％、尤其是多达0.05％、尤其是多达0.01％的量包含IL-18BP的N端和/或C端缺失变体。
34.用于权利要求31或33的用途的组合物，其中所述缺失变体包含IL-18BP C端1至5个氨基酸残基之间和/或IL-18BP N端1至30个氨基酸残基之间的缺失。
35.用于权利要求31至34中任一项所述的用途的组合物，其中所述IL-18BP的N端和/或C端缺失变体以多达40％的量、尤其是以2％至35％之间的量存在。
36.权利要求1至21中任一项所述的IL-18结合分子或权利要求22至35中任一项所述的组合物，用于控制和/或调节、尤其是降低患者的IL-18水平，尤其是游离IL-18水平。
37.用于在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法下调节患者IL-18水平以避免或最小化副作用的方法，其包括对有需要的患者施用治疗有效量的IL-18结合分子，尤其是权利要求16至21中任一项所述的IL-18结合分子，或治疗有效量的权利要求22至35中任一项所述的组合物。
38.用于权利要求37的用途的方法，其用于调节，尤其是降低患者IL-18水平，尤其是游离IL-18水平。
39.用于权利要求37或38的用途的方法，其中该患者患有与肿瘤抗原表达相关的疾病，例如增生性疾病、癌前病症、癌症和与肿瘤抗原表达相关的非癌症相关适应症。
40.用于权利要求39的用途的方法，其中该患者患有癌症，尤其是血液学癌或实体瘤，尤其是表达肿瘤相关抗原的肿瘤。
41.用于权利要求40的用途的方法，其中该癌症是血液学癌，所述血液学癌选自慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、B细胞前淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴细胞增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生不良和骨髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症中的一种或多种。
42.用于权利要求37至41中任一项所述的用途的方法，其中该患者是动物，尤其是人。
43.权利要求37至42中任一项所述的方法，其中该CAR-T细胞和该IL-18结合分子或该组合物分别同时对该患者施用。
44.权利要求37至42中任一项所述的方法，其中该CAR-T细胞和该IL-18结合分子或该组合物分别依次对该患者施用。
45.权利要求37至44中任一项所述的方法，其中该IL-18结合分子或该组合物分别作为CAR-T疗法期间的急性干预对该患者施用。
46.用于权利要求7的用途的IL-18结合分子或用于权利要求26的用途的组合物或权利要求40的方法，其中该癌症是实体瘤，尤其选自结肠癌、直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌、小肠癌、食管癌、黑素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症、所述癌症的组合以及所述癌症的转移灶。
47.用于权利要求1至21、36或46中任一项所述的用途的IL-18结合分子或用于权利要求22至35或46中任一项所述的用途的组合物或权利要求37至46中任一项所述的方法，其中使用能够检测体液中的游离IL-18的测定法，确定了该患者体液中游离IL-18的异常水平，尤其是其中该游离IL-18的水平超过健康对照受试者的体液中游离IL-18的水平，尤其是超过5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％，所述测定法包含权利要求16至21中任一项所述的IL-18结合分子。
48.用于权利要求47的用途的IL-18结合分子、用于权利要求47的用途的组合物或权利要求47的方法，其中用于定量体液中游离IL-18水平的测定法包括以下步骤：
a)使疑似含有游离IL-18的体液样品与作为游离IL-18的捕获分子的权利要求16至21中任一项所述的IL-18结合分子接触；
b)允许该IL-18结合分子与游离IL-18结合；和
c)检测IL-18结合分子的结合并确定样品中游离IL-18的量。
49.用于权利要求47或48所述的用途的IL-18结合分子、用于权利要求47或48所述的用途的组合物或权利要求47或48所述的方法，其中该体液选自支气管肺泡灌洗液(BALF)循环液、分泌液、活组织检查和匀浆组织，尤其是血清、尿液、眼泪、唾液、胆汁、汗液、呼气或呼出物、痰液、支气管肺泡液；皮脂、细胞的、腺体、黏膜和组织分泌物。
50.用于权利要求1至21、36或46至49中任一项所述的用途的IL-18结合分子或用于权利要求22至35或46至49中任一项所述的用途的组合物或权利要求37至49中任一项所述的方法，其中该患者的疗法进一步包括使用一种或多种检查点抑制剂。
51.用于权利要求50的用途的IL-18结合分子或用于权利要求50的用途的组合物或权利要求50的方法，其中该检查点抑制剂是CTLA-4抑制剂、PD-1抑制剂或PD-L1抑制剂。
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