CN114555109A - 使用il-33蛋白治疗癌症的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了IL‑33蛋白在治疗、预防或减少癌症发作或转移中的应用，其中向有需要的对象给予治疗有效量的IL‑33蛋白(例如人IL‑33蛋白)，用于治疗癌症的含有IL‑33蛋白的药物组合物，以及能够上调CD40/CD40L信号通路的药剂在治疗癌症中的应用。

Description

使用IL-33蛋白治疗癌症的方法

技术领域

本公开涉及具有治疗用途的白介素33(IL-33)蛋白。具体而言，本公开涉及治疗、预防或减少癌症的发作或转移的方法，其中给予有需要的对象治疗有效量的IL-33蛋白(例如人IL-33蛋白)。

背景技术

生物体(例如人类)可以通过免疫系统来控制或减少癌症和肿瘤。免疫系统包括若干类型的淋巴细胞和骨髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)、嗜酸性粒细胞、T细胞、B细胞和中性粒细胞。这些淋巴细胞和骨髓细胞能产生被称为细胞因子的分泌型信号转导蛋白。这些细胞因子包括例如白介素-33(IL-33)、干扰素-γ(IFNγ)、IL-12和IL-23等。免疫反应包括例如炎症，即免疫细胞在全身或身体特定部位的积聚等。作为对感染因子或异物的反应，免疫细胞会分泌细胞因子，而细胞因子能够调节免疫细胞的增殖、发育、分化或迁移。过度的免疫反应会产生病理后果，如自身免疫性疾病，而免疫反应受损可能导致癌症。免疫系统的抗肿瘤反应包括例如先天性免疫(例如由巨噬细胞、NK细胞和中性粒细胞介导的免疫)和适应性免疫(例如由抗原呈递细胞(APC)、T细胞和B细胞介导的免疫)等(参见例如：Abbas等(编),Cellular and Molecular Immunology,宾州费城W.B.桑德斯公司(W.B.Saunders Co.,Philadelphia,PA)(2000)；Oppenheim和Feldmann(编),CytokineReference,加州圣地亚哥学术出版社(Academic Press,San Diego,CA)，2001)；vonAndrian和Mackay,New Engl.J.Med.343:1020-1034(2000)；Davidson和Diamond,NewEngl.J.Med.345:340-350,(2001))。

细胞因子是免疫反应的强大调节剂，有望能够显著影响免疫肿瘤治疗方法的结局。然而，此前在人类对象中采用细胞因子治疗只产生了有限的疗效，并有显著的毒性。最近的研究表明，“靶向型细胞因子”(例如抗体-细胞因子融合蛋白)可以将细胞因子递送至所需类型的细胞，同时最大限度地减少外周暴露，从而减少毒性(参见例如：Guo等,Cytokine Growth Factor Rev.38:10-21(2017)；JakobisiakM,等,Cytokine GrowthFactor Rev.22(2):99-108(2011)；Robinson,T.&Schluns,K.S.,Immunol.Lett.190:159-168(2017)；Rhode等,Cancer Immunol.Res.4(1):49-60(2016)；Conlon等,JClin.Oncol.33(1):74-82(2015))。因此，开发基于靶向型细胞因子的治疗剂药物对于治疗各种疾病(例如癌症)具有重要价值。

白介素IL-33(IL-1家族的成员)广泛参与Th2型免疫反应。IL-33能与其受体复合物结合，该复合物由ST2(IL-1R受体样1)和IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAcP)组成。然而，越来越多的证据表明，IL-33具有促进Th1型免疫反应的功能，该免疫反应与肿瘤免疫密切相关(参见例如：Schmitz等,Immunity.23:479-490(2005)；Baumann等,Proc.Nat.Acad.Sci.112:4056-4061(2015)；Komai-Koma等,Immunobiology.221:412-417(2016))。

据报道，IL-33过表达或注射IL-33能显著抑制结肠肿瘤的生长(参见例如：Eissmann等,Can.Immu.Res.6:409-421(2018))。IL-33^–/–小鼠更易患结肠炎相关癌症(参见例如：Malik等,J.Clin.Investigation.126:4469-4481(2016))，且敲除CT26结肠肿瘤细胞中的ST2会使肿瘤生长加速(参见例如：O’Donnell等,Brit.J.Can.114:37-43(2016))。这些结果表明，IL-33可以延缓结肠肿瘤的生长。而另一些研究则显示，IL-33在结肠癌(参见例如：Li等,J.Exp.Clin.Can.Res.CR.37:196(2018),an azoxymethane/dextran sodiumsulfate model of colorectal cancer(CRC)，以及Ameri等,Proc.Nat.Acad.Sci.116:2646-2651(2019))和Apc^Min/+小鼠(人类家族性腺瘤性息肉病的一种动物模型)(参见例如：Maywald等,Proc.Nat.Acad.Sci.112:E2487-2496(2015))中发挥了促肿瘤作用。在乳腺癌和肺癌模型中也报道了此类互相矛盾的效应。

CD40属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的成员，在抗原呈递细胞(包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞、单核细胞和B细胞)上表达。CD40的配体是CD40L，主要由活化(CD4⁺和CD8⁺)T细胞、活化NK细胞和活化血小板表达。CD4⁺T细胞上的CD40L和DC上的CD40之间的相互作用能触发DC的成熟，导致主要组织相容性复合体(MHC)和共刺激表达的上调，从而促进初始CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞分别分化为辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。炎症细胞因子的相关释放间接导致NK细胞活化。因此，预计CD40/CD40L轴向激动剂可改善癌症免疫反应(参见例如：Loskog等,Endo,Meta.&Immu.Disorders-Drug Targets7:23-28(2007)；Hassan等,Immunophar.&Immunotox.36:96-104(2014)；Vonderheide等,Can.Cell 33:563-569(2018))。

有必要开发一种采用IL-33蛋白治疗癌症的方法。

发明内容

在一个方面中，本公开提供了一种治疗、预防或减少癌症发作或转移的方法，其包括给予有需要的对象(例如人类)治疗有效量的IL-33蛋白、或具有与之基本相同的相应序列的多肽。

在一个实施方式中，IL-33蛋白是人IL-33。

在另一个实施方式中，人IL-33是重组蛋白。

在某些实施方式中，人IL-33具有SEQ ID NO:1的序列。

在某些实施方式中，本文所涉及的癌症选自下组：选自下组的实体肿瘤：胰腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、肝细胞癌(HCC)、鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、胃癌、生殖细胞瘤、小儿肉瘤、鼻腔/鼻窦自然杀伤细胞淋巴瘤、黑色素瘤、皮肤癌、骨癌、宫颈癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、睾丸癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、输尿管癌、阴茎癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、儿童实体瘤、环境诱发的癌症、病毒相关的癌症和病毒源性癌症；或选自下组的血液癌症：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤、和缓型骨髓瘤、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、晚期、转移性、难治性和/或复发性恶性血液病，以及上述恶性血液病的任何组合。

在另一个实施方式中，癌症选自肝细胞癌(HCC)、肺癌、胃癌、结肠癌和前列腺癌。

在一个实施方式中，癌症为肝细胞癌(HCC)。

在另一个实施方式中，癌症为肺癌。

在另一个实施方式中，肺癌为Lewis肺癌。

在又一个实施方式中，癌症为胃癌。

在某些实施方式中，该方法还包括给予至少一种抗癌物质(anticancer entity)。

在另一个实施方式中，所述至少一种抗癌物质选自下组：细胞因子、免疫细胞因子、TNFα、PAP抑制剂、溶瘤病毒、激酶抑制剂、ALK抑制剂、MEK抑制剂、IDO抑制剂、GLS1抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、CART细胞或T细胞疗法、TLR激动剂、肿瘤疫苗，以及选自下述抗体：抗CTLA-4抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗4-1BB抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗IL-7Rα(CD127)抗体、抗IL-8抗体、抗IL-15抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体、抗CD47抗体、抗CSF1R抗体、抗CSF1抗体、抗IL-7R抗体、抗MARCO抗体、抗CXCR4抗体、抗VEGF抗体，抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体、抗TNFR1抗体、抗TNFR2抗体、抗CD3双特异性抗体、抗CD19抗体、抗CD20、抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗ICOS抗体、抗CD22抗体、抗CD52抗体、抗CCR4抗体、抗CCR8抗体，抗CD200R抗体、抗VISG4抗体、抗CCR2抗体、抗LILRb2抗体、抗CXCR4抗体、抗CD206抗体、抗CD163抗体、抗KLRG1抗体、抗FLT3抗体、抗B7-H4抗体、抗B7-H3抗体、KLRG1抗体、BTN1A1抗体和抗GITR抗体。

在第二方面，本公开提供了一种用于治疗、预防或减少癌症发作或转移的组合物，该组合物包含：作为活性成分的IL-33蛋白或具有与之基本相同的相应序列的多肽、以及至少一种药学上可接受的载剂。

在一个实施方式中，IL-33蛋白是人IL-33蛋白。

在第三方面，本公开提供了一种治疗、预防或减少癌症发作或转移的方法，所述方法包括给予有需要的对象(例如人类)治疗有效量的能够上调CD40/CD40L信号转导通路的药剂或具有与之基本相同的相应序列的多肽。

在一个实施方式中，能够上调CD40/CD40L信号转导通路的药剂是IL-33蛋白。

在又一个实施方式中，IL-33蛋白是人IL-33蛋白。

在另一个实施方式中，人IL-33是重组人IL-33。

在某些实施方式中，所涉及的癌症如上文所述。

附图说明

图1显示IL-33蛋白抑制Hepa 1-6HCC的生长。

图2A和图2B显示IL-33蛋白抑制LLC肺癌的生长。

图3显示IL-33蛋白抑制MFC胃癌的生长。

图4A和图4B显示IL-33蛋白限制RM-1前列腺癌的生长。

图5A和图5B显示，IL-33对小鼠结肠癌的作用呈时间依赖性。

图6显示IL-33蛋白对小鼠结肠癌的作用受初始治疗时间的影响。

图7A至图7F显示IL-33蛋白显著抑制CT26小鼠结肠肿瘤的生长以及肺转移和肝转移。

图8A至图8C显示IL-33蛋白在体内激活多种免疫细胞。

图9A至图9C显示IL-33蛋白诱导的抗肿瘤免疫需要CD4⁺T细胞，但不需要Treg或嗜酸性粒细胞。

图10A至图10D显示在肿瘤微环境中，IL-33蛋白促进CD4⁺T细胞和DC上的CD40L、CD40和MHC-II的表达。

图11A至图11C显示IL-33蛋白具有抗肿瘤作用，并通过CD40/CD40L信号转导通路激活CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞。

图12A至图12E显示IL-33蛋白经由ST2发挥其抗肿瘤活性，并能刺激CD4⁺T细胞表达ST2。

图13A至图13E显示内源性IL-33不能增强抗肿瘤免疫。

具体实施方式

除非另有说明，以下术语应理解为具有以下含义：

在本文中(包括权利要求书中)，单词的单数形式(例如“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”)涵盖其相应的复数指代，除非上下文中另有明确规定。

术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，均指代任何长度的氨基酸链。该氨基酸链可以是直链或支链，可包含修饰氨基酸，且/或可被非氨基酸中断。该术语还包括经天然修饰或干预修饰的氨基酸链；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、或任何其他操作或修饰，例如与标记组分的偶联。上述定义还包括其他修饰，例如含有一种或多种氨基酸类似物(例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本技术领域已知的其他修饰。据目前了解，多肽可以呈现为单链或联合链。

“抗体”是一种免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点来特异性结合到靶标，例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所用，本术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括上述抗体中能与完整抗体竞争特异性结合的任何抗原结合部分、包含抗原结合部分的融合蛋白、以及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，除非另有说明。抗原结合部分包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv、结构域抗体(dAb，例如鲨鱼和骆驼抗体)、包含互补决定区(CDR)的片段、单链可变片段抗体(scFv)、大抗体、微抗体、内抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv，以及包含足以与多肽特异性抗原结合的至少一部分免疫球蛋白的多肽。抗体可以属于任何类别，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同类别。免疫球蛋白可分为五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类别部分可进一步分为亚类(同型)，例如IgG-i、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2。与不同类别的免疫球蛋白相对应的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。

分子的“活性”可涉及例如分子与配体或与受体的结合能力、催化活性、刺激基因表达或细胞信号传导、分化或成熟的能力、抗原活性、以及调节其他分子活性的能力。分子的“活性”也可指调节或维持细胞间相互作用(例如粘附)的活性，或维持细胞结构(例如细胞膜或细胞骨架)的活性。

术语“给药/给予”和“治疗/处理”，在应用于动物、人、实验对象、细胞、组织、器官或生物液体时，指的是外源性药物、治疗剂、诊断剂、化合物或组合物与动物、人、对象、细胞、组织、器官或生物液体的接触。“给药/给予”和“治疗/处理”可以指代例如治疗、安慰剂、药代动力学、诊断、研究和实验的方法。“细胞处理”包括试剂与细胞的接触、以及试剂与液体(该液体与细胞接触)的接触。“给药/给予”和“治疗/处理”也指体外和离体细胞处理，例如，通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞对细胞进行处理。术语“治疗/处理”，在应用于人类、动物或研究对象时，指医疗性治疗、防止或预防性措施、以及研究和诊断应用。

本公开的组合物和方法包括具有指定序列的多肽和核酸、或具有与之基本相同或相似序列(例如与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高相同度的序列)的多肽和核酸。术语“基本相同”在描述氨基酸序列时指的是：第一氨基酸序列包含足够或最少数量的氨基酸残基i)与第二氨基酸序列中的对齐氨基酸残基相同、或ii)为第二氨基酸序列中的对齐氨基酸残基的保守取代，使得第一和第二氨基酸序列可以具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含与参考序列(例如本文提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的共同结构域的氨基酸序列。

术语“基本相同”在描述核苷酸序列时指的是：第一核酸序列包含与第二核酸序列中的对齐核苷酸相同的足够或最少数量的核苷酸，使得第一和第二核苷酸序列可编码具有共同功能活性的多肽、或编码具有共同结构的多肽结构域或具有共同功能的多肽活性。例如，与参考序列(例如本文提供的序列)具有至少约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。

“药学上有效量”包括足以改善或预防某种疾病症状或体征的剂量。药学上有效量也指足以实现诊断或便于诊断的剂量。针对不同具体患者或动物对象，有效量可能有所不同，影响因素包括例如治疗的病症、患者整体健康状况、给药方法途径和剂量以及副作用的严重程度等。药学上有效量可以是在不出现显著副作用或毒性作用的前提下的最大剂量或给药方案。该有效性将导致诊断测量或参数改善至少5％，如至少10％、又如至少20％、又如至少30％、又如至少40％、又如至少50％、又如至少60％、又如至少70％、又如至少80％、以及甚至如至少90％，其中将100％定义为正常对象所示的诊断参数。IL-33蛋白的药学上有效量可为例如足以减小肿瘤体积、抑制肿瘤生长、或预防或减少转移的量。

术语“药学上可接受的”指的是：适于与人类和动物的组织接触的化合物、材料、组合物和/或剂型，其不会产生过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称。

术语“对象”是指温血动物，例如人类，其可从治疗中获得生物学、医学或生活质量方面的益处。对象可以是哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于：人类、黑猩猩、猿、猴、牛、马、绵羊、山羊、猪；兔、狗、猫、大鼠、小鼠、豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于：鸟类、鱼类等。在一个实施方式中，对象是人类。其可以是已被诊断患有本文涉及的疾病或病症而需要治疗的人。

“外源性”是指在生物体、细胞或人体以外产生的物质，视具体情况而定。“内源性”是指在细胞、生物体或人体内产生的物质，视具体情况而定。

“抗癌物质(anticancer entity)”是指具有抗癌作用的任何药物物质。抗癌物质可以选自例如下述物质：细胞因子、免疫细胞因子、TNFα、PAP抑制剂、溶瘤病毒、激酶抑制剂、ALK抑制剂、MEK抑制剂、IDO抑制剂、GLS1抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、CART细胞或T细胞疗法、TLR激动剂、或肿瘤疫苗，或选自下述抗体：抗CTLA-4抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗4-1BB抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗IL-7Rα(CD127)抗体、抗IL-8抗体、抗IL-15抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体、抗CD47抗体、抗CSF1 R抗体、抗CSF1抗体、抗IL-7R抗体、抗MARCO抗体、抗CXCR4抗体、抗VEGF抗体，抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体、抗TNFR1抗体、抗TNFR2抗体、抗CD3双特异性抗体、抗CD19抗体、抗CD20、抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗ICOS抗体、抗CD22抗体、抗CD52抗体、抗CCR4抗体、抗CCR8抗体，抗CD200R抗体、抗VISG4抗体、抗CCR2抗体、抗LILRb2抗体、抗CXCR4抗体、抗CD206抗体、抗CD163抗体、抗KLRG1抗体、抗FLT3抗体、抗B7-H4抗体、抗B7-H3抗体、KLRG1抗体、BTN1A1抗体和抗GITR抗体。

本公开提供了使用IL-33蛋白治疗增生性疾病(例如癌症)的方法。具体而言，IL-33蛋白可以提高CD4⁺T细胞和DC上的CD40L和CD40的表达，从而显著改善癌症治疗的效果。

本文提供了能够上调CD40/CD40L信号转导通路的IL-33蛋白。

在一个方面中，本公开提供了小鼠成熟IL-33(mIL-33)核苷酸，其具有以下序列：

ATGAGTATTCAGGGTACCAGTCTGCTGACCCAAAGTCCGGCAAGTCTGAGCACCTATAACGATCAGAGCGTTAGCTTTGTCCTGGAAAACGGTTGCTACGTCATCAACGTTGACGATAGCGGTAAAGACCAGGAACAGGATCAGGTTCTGCTGCGTTATTACGAAAGTCCGTGTCCGGCAAGTCAATCTGGCGACGGCGTTGACGGCAAAAAAGTCATGGTCAACATGAGCCCGATCAAAGACACCGATATCTGGCTGCACGCGAACGACAAAGATTATTCTGTTGAACTGCAACGCGGCGACGTTAGTCCGCCGGAACAGGCGTTTTTCGTGCTGCACAAAAAATCCAGCGACTTCGTCTCCTTCGAGTGCAAAAATCTGCCGGGTACCTACATCGGCGTTAAAGATAACCAGCTGGCACTGGTCGAAGAAAAAGACGAGAGCTGCAACAACATCATGTTCAA ACTGAGCAAAATCTAA

如本文所公开，为使mIL-33适于在大肠杆菌宿主中表达，对其编码序列进行了优化，并将ATG(下划线)添加到其N-末端。

在一些实施方式中，mIL-33包含以下氨基酸序列：

MSIQGTSLLTQSPASLSTYNDQSVSFVLENGCYVINVDDSGKDQEQDQVLLRYYESPCPASQSGDGVDGKKVMVNMSPIKDTDIWLHANDKDYSVELQRGDVSPPEQAFFVLHKKSSDFVSFECKNLPGTYIGVKDNQLALVEEKDESCNNIMFKLSKI

在第二方面，本公开提供了人成熟IL-33(hIL-33)核苷酸，其具有以下序列：

ATGAGTATTACCGGCATCAGCCCGATTACCGAATATCTGGCAAGCCTGAGCACCTACAACGATCAAAGCATCACCTTTGCGCTGGAAGACGAAAGCTACGAGATCTACGTCGAGGACCTGAAAAAAGACGAGAAAAAAGACAAAGTCCTGCTGAGCTACTACGAAAGCCAGCATCCGAGTAACGAATCTGGCGACGGGGTTGACGGTAAAATGCTGATGGTTACCCTGAGTCCGACCAAAGATTTCTGGCTGCACGCGAACAACAAAGAACACAGCGTCGAACTGCACAAATGCGAAAAACCGCTGCCGGATCAGGCGTTTTTCGTGCTGCATAACATGCACAGCAACTGCGTCTCCTTTGAGTGCAAAACCGATCCGGGCGTTTTTATTGGCGTCAAAGACAACCACCTGGCGCTGATCAAAGTTGATAGCTCCGAAAACCTGTGCACCGAAAACATCCTGTT CAAACTGAGCGAGACCTAA

如本文所公开，为使hIL-33适于在大肠杆菌宿主中表达，对其编码序列进行了优化，并将ATG(下划线)添加到其N-末端。

在一些实施方式中，hIL-33包含以下氨基酸序列：

SEQ ID NO:1

MSITGISPITEYLASLSTYNDQSITFALEDESYEIYVEDLKKDEKKDKVLLSYYESQHPSNESGDGVDGKMLMVTLSPTKDFWLHANNKEHSVELHKCEKPLPDQAFFVLHNMHSNCVSFECKTDPGVFIGVKDNHLALIKVDSSENLCTENILFKLSET

以下实施例有助于充分理解本公开的范围，而并非将本公开限制在具体实施例范围内。

实施例

1.IL-33治疗Hepa 1-6(肝细胞癌，HCC)荷瘤小鼠

为了评价外源性IL-33蛋白对HCC的作用，使用Hepa 1-6HCC模型进行了剂量-效应关系研究。在Hepa 1-6皮下荷瘤小鼠模型中，接受10μg/kg、30μg/kg或90μg/kg mIL-33(重组IL-33)的小鼠的肿瘤体积均远低于DPBS(Dulbeco磷酸盐缓冲盐水)溶剂对照组的肿瘤体积(P<0.001，图1)。此外，与10μg/kg或30μg/kg mIL-33治疗组相比，90μg/kg mIL-33治疗组的肿瘤体积显著减小(P<0.05，图1)。结果表明，IL-33蛋白可高效抑制小鼠Hepa 1-6HCC的生长，且该作用呈剂量依赖性，即抗肿瘤作用随着mIL-33蛋白剂量的增加而增强。

图1显示，IL-33蛋白抑制Hepa 1-6HCC的生长。对C57BL/6小鼠皮下注射4×10⁶个Hepa 1-6HCC细胞。从第5天开始至试验结束，分别向小鼠皮下注射10μg/kg、30μg/kg或90μg/kg的mIL-33蛋白，每天一次。从接种肿瘤细胞后第7天开始，每2天测量一次肿瘤体积。DPBS是溶剂对照组，数据显示为平均值±SEM(n＝每组6只小鼠)。^*P<0.05，^***P<0.001。

2.IL-33治疗LLC(Lewis肺癌)荷瘤小鼠

在小鼠LLC肺癌(属于非小细胞肺癌，NSCLC)转移模型中，IL-33转基因小鼠的存活率显著高于对照组的存活率。然而，在人NSCLC肿瘤异种移植模型中，通过阻断IL-33，肿瘤生长显示出降低趋势。

为进一步证实外源性IL-33蛋白对肺癌的作用，采用LLC皮下荷瘤小鼠模型进行了剂量-效应关系研究。如图2A和2B所示，注射30μg/kg或90μg/kg的mIL-33的小鼠的肿瘤体积和重量均远低于DPBS组的肿瘤体积和重量(体积，P<0.001；重量，P<0.001，图2A和图2B)。同时，与DPBS组相比，10μg/kg mIL-33治疗组的肿瘤体积和重量均明显降低(体积，P<0.001；重量，P<0.05，图2A和图2B)。此外，与30μg/kg mIL-33治疗组相比，90μg/kg mIL-33治疗组中肿瘤体积和重量均显著降低(体积，P<0.01；重量，P<0.05，图2A和图2B)，但10μg/kg mIL-33治疗组中肿瘤体积和重量显著增加(体积，P<0.001；重量，P<0.01，图2A和图2B)。这些数据表明，IL-33蛋白显著抑制了小鼠LLC肺癌的生长，且该抑制作用呈剂量依赖性，即抗肿瘤活性随着mIL-33蛋白剂量的增加而提高。

图2A和图2B显示IL-33蛋白抑制了LLC肺癌的生长。对C57BL/6小鼠皮下注射4×10⁶个LLC肺癌细胞。从第5天开始至试验结束，分别向小鼠皮下注射10μg/kg、30μg/kg或90μg/kg的mIL-33蛋白，每天一次。从接种肿瘤细胞后第7天开始，每2天测量一次肿瘤体积。在接种LLC后第21天处死小鼠，采集肿瘤组织并称重。DPBS是溶剂对照组，数据显示为平均值±SEM(n＝每组8-10只小鼠)。^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

3.IL-33治疗MFC(小鼠前胃癌)荷瘤小鼠

在已建立的MFC皮下荷瘤小鼠模型中进行了相关研究。如图3所示，与DPBS溶剂组相比，在接受10μg/kg、30μg/kg或90μg/kg的mIL-33蛋白的小鼠中，肿瘤体积显著减小(P<0.05，图3)。结果表明，IL-33蛋白显著抑制了小鼠MFC胃癌的生长，这一抑制效果在较低IL-33蛋白水平下(10μg/kg)即可达到。

图3显示，IL-33蛋白抑制了MFC胃癌的生长。对BALB/c小鼠皮下注射4×10⁶个MFC胃癌细胞。从第5天开始至试验结束，分别向小鼠皮下注射10μg/kg、30μg/kg或90μg/kg的mIL-33，每天一次。从接种肿瘤细胞后第7天开始，每2天测量一次肿瘤体积。DPBS是溶剂对照组，数据显示为平均值±SEM(n＝每组9只小鼠)。^*P<0.05。

4.IL-33治疗RM-1(前列腺癌)荷瘤小鼠

为评价IL-33对前列腺癌的影响，采用RM-1皮下荷瘤小鼠模型进行了剂量-效应研究。研究发现，DPBS溶剂对照组、10μg/kg mIL-33治疗组和30μg/kg mIL-33治疗组之间肿瘤体积和重量无显著差异，但均显著高于90μg/kg mIL-33治疗组的肿瘤体积和重量(体积，P<0.001；重量，P<0.001，图4A和图4B)。结果表明，IL-33蛋白能显著抑制RM-1前列腺癌的生长，但需要在IL-33蛋白的较高剂量下(90μg/kg)才能发挥这种抗肿瘤作用。

图4A和图4B显示IL-33蛋白限制了RM-1前列腺癌的生长。对C57BL/6小鼠皮下注射2×10⁶个RM-1前列腺癌细胞。从第5天开始至试验结束，分别向小鼠皮下注射10μg/kg、30μg/kg或90μg/kg的mIL-33蛋白，每天一次。从接种肿瘤细胞后第7天开始，每2天测量一次肿瘤体积。在接种RM-1后第23天处死小鼠，采集肿瘤组织并称重。DPBS是溶剂对照组，数据显示为平均值±SEM(n＝每组8-9只小鼠)。^***P<0.001。

5.IL-33对小鼠结肠癌的作用呈时间依赖性

在CT26结肠癌皮下荷瘤小鼠模型中，在接种肿瘤细胞后第5天注射mIL-33蛋白。给药天数分别设定为3天(第5天至第7天)、6天(第5天至第7天)或9天(第5天至第13天)。如图5A和图5B所示，与给药3天或6天的mIL-33治疗组相比，DPBS溶剂组中的肿瘤体积和重量均显著增加(体积，P<0.01；重量，P<0.01，图5A和图5B)，而在给药9天的mIL-33治疗组中，肿瘤体积和重量显著降低(体积，P<0.001；重量，P<0.01，图5A和图5B)。这些结果表明，IL-33蛋白可以有效抑制小鼠结肠癌的生长。尽管给药3天的mIL-33治疗组和给药6天的mIL-33治疗组之间的抗肿瘤作用无显著差异，但是当治疗期延长至9天时，这种抑制作用大大增加。数据显示，IL-33蛋白可以快速激活抗肿瘤免疫反应，但其作用强度呈时间依赖性，即这种作用可以随着治疗时间的延长而增强。

图5A和图5B显示，IL-33对小鼠结肠癌的作用呈时间依赖性。对BALB/c小鼠皮下注射1×10⁶个CT26结肠癌细胞。从第5天开始，至第7天、第10天或第13天，分别向小鼠皮下注射360μg/kg的mIL-33蛋白，每天一次。从接种肿瘤细胞后第7天开始，每2天测量一次肿瘤体积。在接种CT26后第27天处死小鼠，采集肿瘤组织并称重。溶剂对照组在第5天至第13天期间注射DPBS。数据显示为平均值±SEM(n＝每组6-8只小鼠)。^**P<0.01，^***P<0.001。

6.IL-33对小鼠结肠癌的作用受初始治疗时间的影响

在CT26结肠癌皮下荷瘤小鼠模型中，分别从第5天(第5天至第13天)、第10天(第10天至第18天)或第15天(第15天至第23天)开始连续9天给药mIL-33蛋白(90μg/kg，每日一次)。与从第10天开始给药的mIL-33治疗组相比，DPBS溶剂组中的肿瘤体积显著增加(P<0.05，图6)，而在从第5天开始给药的mIL-33治疗组中，肿瘤体积显著减小(P<0.01，图6)。与从第5天开始注射的mIL-33治疗组相比，从第15天开始注射的mIL-33治疗组的肿瘤生长在mIL-33给药后迅速减缓，并且在第21天之后显示出相似的趋势，表明这两种给药方案对肿瘤生长具有相似的作用。此外，从第15天开始给药的mIL-33治疗组和从第10天开始给药的mIL-33治疗组的肿瘤体积之间没有显示出显著差异，但是从第15天开始给药的mIL-33治疗组中肿瘤体积有降低趋势(图6)。这些结果表明，IL-33蛋白对小鼠结肠癌的抑制作用与初始给药时间有关。在肿瘤进展的“早期”(第5天)或“后期”(第15天)，IL-33蛋白能更有效、更持久地激活抗肿瘤免疫反应，但在肿瘤进展的“中期”(第10天)，其抗肿瘤作用相对较弱。

图6显示，IL-33蛋白对小鼠结肠癌的作用受初始治疗时间的影响。对BALB/c小鼠皮下注射1×10⁶个CT26结肠癌细胞。从第5天、第10天或第15天开始，分别向小鼠皮下注射90μg/kg的mIL-33，持续9天，每天一次。从接种肿瘤细胞后第7天开始，每2天测量一次肿瘤体积。溶剂对照组在第5天至第23天期间注射DPBS。数据显示为平均值±SEM(n＝每组7-8只小鼠)。^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

7.IL-33治疗有效抑制CT26小鼠结肠肿瘤生长及肺转移和肝转移

为了阐明IL-33对小鼠CT26结肠皮下肿瘤以及肺转移和肝转移的作用，在皮下荷瘤小鼠模型(图7A)和肺转移模型(图7C，图7D)中，在注射CT26细胞的当天，将mIL-33蛋白皮下注射入小鼠。为了防止由小鼠抓伤伤口引起的手术伤口感染，肝转移模型中mIL-33蛋白的初始给药时间延迟到接种CT26后第8天(图7E，图7F)。在剂量-效应关系实验中，当肿瘤可见时(在CT26接种后第5天开始)，小鼠接受mIL-33蛋白注射，这对于临床应用可能更有意义(图7B)。

在CT26皮下荷瘤小鼠模型中，mIL-33蛋白组的肿瘤生长速率显著低于PBS(磷酸盐缓冲盐水)对照组的肿瘤生长率(P<0.001，图7A)。通过剂量-效应关系研究，已证实IL-33蛋白对CT26皮下结肠癌具有抗肿瘤作用。研究发现IL-33蛋白介导的抗肿瘤活性呈剂量依赖性。随着mIL-33蛋白剂量的增加，肿瘤生长减慢，肿瘤重量下降(图7B)。在CT26肺转移和肝转移模型中，与PBS对照相比，在mIL-33蛋白组中肺和肝表面的转移结节数量显著减少(肺转移，P<0.001；肝转移，P<0.05；图7C、图7E)。H&E染色分析证实了这一点(图7D、图7F)。这些数据表明，IL-33蛋白可以抑制CT26结肠癌细胞的生长以及肺转移和肝转移。

图7A至图7F显示，IL-33蛋白显著抑制了CT26小鼠结肠肿瘤的生长以及肺转移和肝转移。图7A和图7B涉及皮下CT26荷瘤小鼠模型。图7C和图7D涉及肺转移模型，其中7C显示了可见肿瘤结节的数量(左图)和转移肺组织的照片(右图)。图7D涉及H&E染色的肺组织的代表性显微照片(500μm)。图7E和图7F涉及肝转移模型，其中图7E显示了可见肿瘤结节的数量(左图)和转移肝组织的照片(右图)。图7F显示了H&E染色的肝组织的代表性显微照片(500μm)。使用PBS治疗的小鼠作为对照组。数据显示为平均值±SD(n＝每组5只至8只小鼠)。ns：无显著差异。^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

8.IL-33调节多种免疫反应

评估了IL-33在肿瘤进展的不同阶段在脾和肿瘤组织中对各种免疫细胞的作用。接种CT26细胞2周后，在mIL-33组中观察到显著的脾肿大(P<0.001，图8A)。与PBS组相比，在mIL-33组中，脾CD3⁺T、CD4⁺T、CD69⁺CD8⁺T(活化的CD8⁺T)、NK和CD69⁺NK(活化的NK)细胞的数量显著增加(P<0.001)，而脾CD8⁺T细胞的数量显著减少(P<0.05)(图8B，左图)。此外，mIL-33蛋白显著增加了脾Treg(P<0.01)和PD-1⁺CD8⁺T细胞(P<0.001)的数量(图8B，左图)。这些数据显示，当CT26皮下结肠肿瘤发展至2周时，IL-33对多种免疫细胞(如免疫系统激活相关细胞)具有增殖和激活作用。

在接种4周后的CT26荷瘤小鼠的脾脏中，mIL-33组中CD3⁺T细胞(P<0.05)和CD69⁺CD8⁺T细胞(P<0.001)的数量显著高于PBS组(图8B，右图)。类似地，mIL-33蛋白治疗显著增加了Treg的数量(P<0.001)、耗竭CD8⁺T细胞(PD-1^高Eomes^高CD8⁺)(P<0.01)和PD-1⁺CD8⁺T细胞(P<0.05)(图8B，右图)。这些结果表明，当CT26肿瘤发展至4周时，IL-33激活了CD8⁺T细胞，但这种免疫系统正向刺激会逐渐减弱。

随后还研究了肿瘤微环境中各种免疫细胞的变化。在接种CT26细胞2周后，与注射PBS的小鼠相比，注射mIL-33的小鼠显示，CD45⁺细胞中肿瘤浸润CD69⁺NK细胞(P<0.05)和嗜酸性粒细胞(P<0.05)的比例显著增加，但CD45⁺细胞中肿瘤浸润Treg(P<0.01)、巨噬细胞(P<0.05)和髓源性抑制细胞(MDSC)(P<0.05)的比例显著减少(图8C，左图)。在接种CT26细胞4周后，mIL-33蛋白显著增加了CD45⁺细胞中肿瘤浸润CD8⁺T细胞(P<0.01)、嗜酸性粒细胞(P<0.001)和DC(P<0.05)的比例，同时显著降低了CD45⁺细胞中肿瘤浸润Treg(P<0.01)的比例(图8C，右图)。这些数据表明，与在脾脏中的作用相似，IL-33蛋白可影响CT26肿瘤微环境中多种免疫细胞的组成比例。当CT26肿瘤发展至2周时，IL-33的抗肿瘤作用与Treg的减少和CD69⁺NK细胞的增加有关。然而，当肿瘤发展至4周时，与其他免疫细胞相比，CD8⁺T细胞和嗜酸性粒细胞的比例变化更显著。

IL-33蛋白影响了脾脏和肿瘤组织中多种免疫细胞的数量和比例。

图8A至图8C显示，IL-33蛋白在皮下CT26荷瘤小鼠模型中激活了体内多种免疫细胞。在接种CT26后第0天(0周)、第14天(2周)或第28天(4周)处死小鼠。图8A显示了脾细胞数量。图8B显示了脾免疫细胞的流式细胞分析。图8C显示了肿瘤浸润免疫细胞的流式细胞分析。注射PBS的小鼠作为对照组。耗竭T细胞为PD-1^高Eomes^高CD8⁺，复活化(reinvigorated)T细胞为PD-1^中T-bet^高CD8⁺。数据显示为平均值±SD(n＝每组5只至6只小鼠)。^*P＜0.05，^**P＜0.01，***P＜0.001。

9.在IL-33介导的抗肿瘤效应中发挥重要作用的是CD4⁺T细胞，而非Treg或嗜酸

性粒细胞

为了明确IL-33蛋白的抗肿瘤活性与CD4⁺T细胞、Treg或嗜酸性粒细胞之间的关系，使用抗体在体内耗竭上述细胞。结果显示，抗CD4抗体的同种型(同型)+mIL-33组的肿瘤生长和重量低于抗CD4抗体(抗CD4)+mIL-33组的肿瘤生长和重量(体积，P<0.01；重量，P<0.05)，但与抗CD25抗体(Treg细胞特异性耗竭)(抗CD25)+mIL-33组或抗Siglec-F抗体(嗜酸性粒细胞特异性耗竭)(抗Siglec-F)+mIL-33组相比，肿瘤生长和重量无显著差异(图9A，图9B)。

这些数据显示，在IL-33蛋白介导的抗肿瘤免疫中，CD4⁺T细胞发挥了重要的作用，而Treg和嗜酸性粒细胞对该抗肿瘤免疫影响不大。值得注意的是，抗CD4+mIL-33组的肿瘤生长(P<0.01)和重量(P<0.05)低于同型+PBS组的肿瘤生长和重量(图9A、图9B)。由此可知，除了CD4⁺T细胞外，IL-33蛋白还可通过其他信号发挥其抗肿瘤作用。

根据其表达的细胞因子和转录因子，CD4⁺T细胞可分为多种亚型。CD4⁺T细胞的不同亚型在肿瘤免疫中具有不同的功能。因此，使用RT-qPCR研究了IL-33蛋白作用于哪种类型的CD4⁺T细胞。如图9C所示，mIL-33组的IFN-γ表达水平明显高于对照组的表达水平(P<0.001)，T-bet也趋向于上调。然而，IL-4、GATA-3、TGF-β和IL-22的表达水平在上述两组之间无差异。这些结果表明，IL-33蛋白可促进Th1细胞的激活，而不是Th2、Th9和Th22细胞。

图9A至图9C显示，IL-33蛋白诱导的抗肿瘤免疫需要CD4⁺T细胞，而非Treg或嗜酸性粒细胞。图9A至图9C显示了皮下CT26荷瘤小鼠模型。在PBS或mIL-33治疗后第19天处死小鼠。图9A显示了肿瘤体积。图9B显示了肿瘤重量。图9C显示了对于肿瘤组织中Th1、Th2、Th9和Th22相关细胞因子和转录因子的mRNA表达所进行的RT-qPCR分析。将靶基因表达归一化为GAPDH的表达。包括了抗CD4抗体的同型对照。数据为平均值±SD(n＝每组4只至6只小鼠)。ns：无显著差异。^*P＜0.05，^**P＜0.01，***P＜0.001。

10.在肿瘤微环境中，IL-33可调节CD4⁺T细胞和DC上CD40L、CD40和MHC-II的表达水平

对IL-33蛋白对CD4⁺T细胞和DC的影响进行了进一步的研究。

采用RT-qPCR和流式细胞仪来分析哪种类型的MHC、共刺激分子和细胞因子会受到IL-33蛋白的影响。来自mIL-33组中肿瘤组织的CD40L(P<0.01)、MHC-II(P<0.05)和IL-2(P<0.01)的表达水平显著高于对照组(图10A)。与PBS对照组相比，在mIL-33组中，肿瘤浸润淋巴细胞上CD40L的百分比(P<0.01，图10B)和肿瘤浸润CD4⁺T细胞上CD40L的MFI有所增加(P<0.05，图10C)。类似地，mIL-33组中肿瘤浸润DC上的CD40(P<0.05，图10D，上图)和MHC-II(P<0.05，图10D，下图)的比例显著高于对照PBS组。这些结果表明，IL-33蛋白通过调节CD40L、CD40和MHC-II的表达水平参与了CD4⁺T细胞和DC的免疫激活。

图10A至图10D显示，IL-33蛋白促进了肿瘤微环境中CD4⁺T细胞和DC上CD40L、CD40和MHC-II的表达。图10A至图10D显示了皮下CT26荷瘤小鼠模型。在PBS或mIL-33治疗后第19天处死小鼠。图10A显示了对于肿瘤组织中CD40L、CD40、MHC-II、MHC-I、CD80、IL-2、IL-12、IL-15和IL-21的mRNA表达所进行的RT-qPCR分析。将靶基因表达归一化到GAPDH的表达。图10B显示了肿瘤浸润淋巴细胞上CD40L表达的流式细胞分析。代表性点图(左图)和定量数据(右图)。图10C显示了肿瘤浸润CD4⁺T细胞上CD40L的MFI。代表性直方图(上图)、定量数据(下图)。图10D显示了肿瘤浸润DC上CD40和MHC-II表达的流式细胞分析。代表性点图(左图)和定量数据(右图)。对照组小鼠注射PBS。数据为平均值±SD(n＝每组4只至6只小鼠)。^*P<0.05，^**P<0.01。

11.阻断CD40/CD40L信号转导可减弱IL-33的抗肿瘤活性

通过小鼠体内中和实验来评价抗CD40L抗体对IL-33蛋白诱导的抗肿瘤活性的影响。在CT26荷瘤小鼠(图11A至图11C)中，与同型+mIL-33组相比，在抗CD40L+mIL-33组中，肿瘤生长(P<0.01，图11A)和重量(P<0.01，图11B)显著增加，肿瘤浸润IFN-γ⁺CD4⁺T细胞(P<0.001)、IFN-γ⁺CD8⁺T细胞(P<0.001)和IFN-γ⁺NK细胞(P<0.01)的百分比显著降低(图11C)。这些数据显示，CD40/CD40L通路参与了IL-33蛋白介导的抗肿瘤免疫，并在IL-33蛋白诱导的CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞活化中发挥作用。

值得注意的是，抗CD40L+mIL-33组的肿瘤生长(P<0.001)和重量(P<0.001)显著低于同型+PBS组的肿瘤生长和重量(图11A、图11B)。然而，与抗CD40L+mIL-33组相比，同型+PBS组中肿瘤浸润IFN-γ⁺CD4⁺T细胞(P<0.05)和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞(P<0.001)的比例显著升高(图11C)。因此，IL-33蛋白可能可以通过其他类型的免疫细胞或信号转导通路发挥其抗肿瘤功能。

图11A至图11C显示，IL-33蛋白通过CD40/CD40L信号通路发挥抗肿瘤作用并激活CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞。图11A至图11C显示了皮下CT26荷瘤小鼠模型。在PBS或mIL-33治疗后第21天处死小鼠。图11A显示了肿瘤体积。图11B显示了肿瘤重量。图11C显示了肿瘤浸润CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞上INF-γ表达的流式细胞分析。代表性点图(左图)和定量数据(右图)。包括了抗CD40L抗体的同型对照。数据为平均值±SD(n＝每组4只至9只小鼠)。ns：无显著差异。^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

12.IL-33的抗肿瘤免疫作用呈ST2依赖性

为确定IL-33蛋白介导的抗肿瘤活性和免疫反应是否依赖于其天然受体ST2，采用ST2^–/–荷瘤模型小鼠观察IL-33蛋白的抗肿瘤作用。在CT26细胞皮下荷瘤模型中发现，在注射PBS的WT(WT-PBS)、ST2^–/–-mIL-33和ST2^–/–-PBS组之间，肿瘤生长和重量无显著差异，但却显著高于WT-mIL-33组(肿瘤生长，P<0.001；重量，P<0.01或P<0.001；图12A)。这些结果表明，IL-33蛋白的抗肿瘤作用依赖于其受体ST2。

WT-mIL-33组中脾脏IFN-γ⁺CD4⁺T细胞(P<0.001)、IFN-γ⁺CD8⁺T细胞(P<0.001)、IFN-γ⁺NK细胞(P<0.001)和TGF-β⁺Treg(P<0.001)的比例高于WT-PBS组的比例，而这些细胞的比例在ST2^–/–-mIL-33和ST2^–/–-PBS组之间无显著差异(图12B和图12C)。这些数据表明，IL-33蛋白依赖受体ST2来激活CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、NK细胞和Treg。

此外，WT-PBS组中脾脏CD4⁺T细胞上ST2的表达比率显著高于ST2^–/–-PBS组(P<0.01)和ST2^–/–-mIL-33组(P<0.01)的比率，但显著低于WT-mIL-33组的比率(P<0.001)(图12D和图12E)。这些数据表明，ST2由CD4⁺T细胞表达，并由IL-33正向调节。由此可推测，IL-33蛋白通过ST2直接激活CD4⁺T细胞，并且该输出通过正反馈回路逐渐增强。此外，推测CD8⁺T细胞和NK细胞几乎不表达ST2，可由IL-33蛋白诱导(WT-PBS对比WT-mIL-33；ST2^–/–-PBS对比ST2^–/–-mIL-33；图12D和图12E)。与CD4⁺T细胞相似，WT-PBS组中脾脏Treg上ST2的表达比率显著高于ST2^–/–-PBS组(P<0.05)和ST2^–/–-mIL-33组(P<0.05)的比率，且呈现出低于WT-mIL-33组比率的趋势(图12D和图12E)。这些结果表明，IL-33蛋白可能可以通过ST2直接影响Treg的免疫调节功能。

图12A至图12E显示，IL-33蛋白通过ST2发挥抗肿瘤活性，并刺激CD4⁺T细胞表达ST2。图12A至图12E显示了皮下CT26荷瘤小鼠模型。在PBS或mIL-33治疗后第13天处死小鼠。图12A显示了肿瘤体积(左图)和肿瘤重量(右图)。图12B至图12E显示了对于脾CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞上INF-γ和ST2的表达以及脾Treg上TGF-β和ST2的表达所进行的流式细胞分析。图12B和图12D显示了代表性点图。图12C和图12E显示了定量数据。数据为平均值±SD(n＝每组5只至6只小鼠)。ns：无显著差异。^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

13.内源性IL-33对肿瘤生长和免疫反应没有影响

上述实验显示，外源性IL-33蛋白具有抗肿瘤免疫作用；然而，尚不清楚内源性IL-33蛋白是否也具有类似的作用。在MC38细胞皮下荷瘤模型中，WT-PBS组和IL-33^–/–-PBS组之间的肿瘤重量无显著差异(图13A，下图)。然而，注射外源性mIL-33蛋白后，肿瘤体积和重量显著减小(WT-PBS对比WT-mIL-33，P<0.001；IL-33^–/–-PBS对比IL-33^–/–-mIL-33，P<0.001；图13A)。这些结果表明，内源性IL-33蛋白可能对肿瘤生长没有影响。

在脾脏中，WT-PBS和IL-33^–/–-PBS组之间的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞比例无显著差异，但显著低于相应的mIL-33组(WT-PBS对比WT-mIL-33，P<0.05；IL-33^–/–-PBS对比IL-33^–/–-mIL-33，P<0.01；图7B，上图)。此外，内源性和外源性IL-33蛋白在脾脏CD8⁺T细胞的ST2表达上无显著差异(图13B，下图)。在肿瘤组织中，IFN-γ⁺CD4⁺T细胞比例在WT-PBS和IL-33^–/–-PBS组之间相似，但在注射mIL-33后显著增加(WT-PBS对比WT-mIL-33，P<0.01；IL-33^–/–-PBS对比IL-33^–/–-mIL-33，P<0.01；图13C，上图)。同样，IFN-γ⁺NK细胞比例在WT-PBS和IL-33^–/–-PBS组之间相似，但在mIL-33治疗后显著升高(WT-PBS对比WT-mIL-33，P<0.01；IL-33^–/–-PBS对比IL-33^–/–-mIL-33，P<0.001；图13C，下图)。这些数据表明，内源性IL-33蛋白可能对CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞的激活无显著影响，这与外源性IL-33蛋白有很大不同。

与ST2^–/–小鼠实验的结果一致，外源性mIL-33蛋白显著促进了肿瘤浸润CD4⁺T细胞上的ST2表达(WT-PBS对比WT-mIL-33，P<0.001；IL-33^–/–-PBS对比IL-33^–/–-mIL-33，P<0.01；图13D)，但不影响肿瘤浸润NK细胞上的ST2表达(图13D)。在IL-33^–/–小鼠中，内源性IL-33蛋白的耗竭并未显著影响肿瘤浸润CD4⁺T细胞和NK细胞上的ST2表达(图13D)。IL-33^–/-小鼠和WT小鼠的血清IL-33水平非常低，但在注射mIL-33的0.5小时、1小时和2小时后显著增加(图13E)。内源性IL-33蛋白水平非常低，难以检测，因此可能不会产生免疫反应，也不会影响肿瘤生长以及CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞和NK细胞上IFN-γ和ST2的表达。

图13A至图13E显示，内源性IL-33蛋白不能增强抗肿瘤免疫。图13A至图13D显示了皮下MC38荷瘤小鼠模型。在PBS或mIL-33治疗后第17天处死小鼠。图13A显示了肿瘤体积(上图)和肿瘤重量(下图)。图13B显示了脾CD8⁺T细胞上INF-γ和ST2表达的流式细胞分析。代表性点图(左图)和定量数据(右图)。图13C显示了来自肿瘤的CD4⁺T细胞和NK细胞上INF-γ表达的流式细胞分析。代表性点图(左图)和定量数据(右图)。图13D显示了来自肿瘤的CD4⁺T细胞和NK细胞上ST2表达的流式细胞分析。图13E显示了IL-33^–/–小鼠、WT小鼠和WT-IL33小鼠的血清IL-33水平。数据为平均值±SD(n＝每组4只至6只小鼠)。ns：无显著差异。^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

I.一般方法

本公开中使用了已知的分子生物学标准方法。(参见例如：Maniatis,等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)(1982)；Sambrook和Russell,Molecular Cloning,第三版,冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，(2001)；Wu,Recombinant DNA,卷217,加利福尼亚州圣地亚哥学术出版社公司(Academic Press,SanDiego,CA.)(1993))。标准方法也公开于Ausubel,等,Current protocol in MolecularBiology，卷1-4，约翰威利父子公司，纽约州纽约(John Wiley and Sons，Inc.New York，N.Y.)(2001)，其描述了细菌细胞中的克隆和DNA突变(第1卷)，哺乳动物细胞和酵母中的克隆(第2卷)，蛋白质表达(第3卷)和生物信息学(第4卷)。

包括免疫沉淀、层析、电泳、离心和结晶在内的蛋白质纯化方法是本技术领域中的已知方法。(参见例如：Coligan,等,Current Protocols in Protein Science,卷1,约翰威利父子公司，纽约州纽约(2000))。化学分析、化学修饰、翻译后修饰和融合蛋白生成也是本技术领域中的已知方法。(参见例如：Coligan,等,Current Protocols in ProteinScience,卷2,约翰威利父子公司，纽约州纽约(2000)；Ausubel,等,Current Protocols inMolecular Biology,卷3,约翰威利父子公司，纽约州纽约，pp.16.0.5-16.22.17(2001)；圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,Co)Products for Life ScienceResearch,St.Louis,Mo.)(2001),pp.45-89；安玛西亚法玛西亚生物技术公司(AmershamPharmacia Biotech),BioDirectory,Piscataway,N.J.(2001),pp.384-391)。表征配体/受体相互作用的标准技术是本技术领域中的已知方法。(参见例如：Coligan,等,CurrentProtocols in Immunology,卷4,纽约约翰威利公司(John Wiley,Inc.,NY),(2001))。

癌症治疗和诊断的研究模型是本技术领域中已知的。(参见例如：Alison(编),TheCancer Handbook,密苏里州圣路易斯的格罗夫字典公司(Grove's Dictionaries,Inc.,St.Louis,MO.)(2001)；Oldham(编),Principles of Cancer Biotherapy,第三版，马萨诸塞州索厄姆市的卢克沃学术出版社(Kluwer Academic Publ.,Hingham,MA)(1998)；Devita等(编),Cancer:Principles and Practice of Oncology,第六版,宾州费城的Lippincott公司(2001)；Holland等(编),Holland-Frei Cancer Medicine,宾州费城的BC Decker公司(2000)；Garrett和Sell(编),Cellular Cancer Markers,新泽西州托托瓦的胡马纳出版社(Humana Press,Totowa,N.J.)(1995)；MacKie,Skin Cancer,第二版,圣路易斯的Mosby公司(1996)；Moertel,New Engl.J.Med.330:1136-1142(1994)；Engleman,Semin.Oncol.30(3Suppl.8):23-29(2003)；Mohr,等,Onkologie 26:227-233(2003))。

II.材料和方法

小鼠

BALB/c(野生型，WT)和C57BL/6(野生型，WT)小鼠从上海斯莱克实验动物有限公司(中国上海)获得。ST2^–/–小鼠(BALB/c背景)，最初从医学研究委员会分子生物学实验室(英国剑桥)获得，由复旦大学基础医学院(中国上海)王彦青博士惠赠。IL-33^–/–小鼠(C57BL/6背景)从上海模式生物中心(中国上海)获得。所有实验均使用6周龄至8周龄的雄性小鼠。所有动物实验均经上海交通大学动物护理与使用委员会(中国上海)授权。

肿瘤细胞

CT26结肠癌细胞购自ATCC(Rockville，MD，美国)，并在RPMI 1640完全培养基(含10％胎牛血清，FBS)中培养。MC38结肠腺癌细胞从Biovector NTCC(中国北京)获得，并保存在DMEM完全培养基(含10％FBS)中。RPMI 1640、DMEM和FBS均购自Gibco(Grand Island，美国)。

mIL-33和hIL-33的表达、纯化、鉴定及生物活性测定

对成熟mIL-33和成熟hIL-33的编码序列进行优化，并亚克隆至表达载体pET-43.1a(+)，然后分别转化到BL21中表达。为获得高表达水平的可溶性IL-33，对诱导温度和诱导时间的表达条件进行了优化。最后用1mM IPTG(Sigma-Aldrich，美国)在25℃条件下诱导表达6小时。成熟mIL-33(Ser 109-IIe 266)和成熟hIL-33(Ser 112-Thr270)的理论等电点分别为4.52和4.80，均属于酸性蛋白。因此，我们首先利用阴离子交换色谱(QSepharose^TM Fast Flow)来分离mIL-33和hIL-33。为了进一步纯化，我们采用凝胶过滤(Superdex 26/60 75pg)，并获得大量纯度大于90％的靶蛋白。

随后，通过蛋白质印迹法测定靶蛋白的特异性。纯化的mIL-33和hIL-33可以特异性结合小鼠天然可溶性受体ST2融合蛋白(mST2-Fc，BioLegend，San Diego，CA，美国)。此外，使用ELISA进行了mIL-33和hIL-33与mST2-Fc结合的亲和力分析。随着mST2-Fc浓度的增加，包被mIL-33或hIL-33的孔的检测值逐渐增加，而包被1％BSA的孔的检测值无显著变化。上述数据表明，已成功获得无任何纯化标签的靶蛋白。

IL-33可诱导Raw264.7小鼠巨噬细胞和P815小鼠肥大细胞瘤细胞分别分泌mTNF-α和mIL-6。基于该发现，对纯化的mIL-33和hIL-33进行了生物活性分析。mIL-33诱导的mTNF-α和mIL-6的EC₅₀值分别为10.0ng/mL和1.5ng/mL。hIL-33诱导的mTNF-α和mIL-6的EC₅₀值分别为801.0ng/mL和392.7ng/mL。这些数据表明，纯mIL-33和纯hIL-33均具有生物活性。

重组小鼠IL-33(mIL-33)的生成和生物活性分析

经纯化的mIL-33蛋白通过蛋白质印迹法和酶联免疫分析(ELISA)进行鉴定。

为了检测mIL-33的生物活性，将5×10⁴个Raw264.7和4×10³个P815细胞(均来自中国科学院干细胞库)分别接种到96孔板的每个孔中。将板静置1小时。然后，弃去上清液，加入200μL含不同浓度mIL-33的RPMI 1640(Raw264.7)或DMEM(P815)完全培养基。在37℃、5％CO₂条件下孵育18小时(Raw264.7)或48小时(P815)后，收集细胞培养上清液，并通过ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN,美国)来评估小鼠TNF-α(Raw264.7)和IL-6(P815)的表达。

小鼠肿瘤模型与mIL-33治疗

为建立皮下荷瘤小鼠模型，对BALB/c或ST2^–/–小鼠皮下接种1×10⁶个CT26细胞，对C57BL/6或IL-33^–/–小鼠皮下注射2×10⁶个MC38细胞。从肿瘤可见之日起，每两天监测一次肿瘤体积(mm³)。肿瘤接种后2周至4周处死小鼠。收集肿瘤并称重。为诱导肺转移，将100μLPBS中的3×10⁵个CT26细胞经静脉(i.v.)注入BALB/c小鼠尾静脉中。在肝转移模型中，将50μL PBS中的5×10⁴个CT26细胞注射到BALB/c小鼠的脾被膜中。在接种CT26细胞后第14天(肺)或第17天(肝)，通过比较可见肿瘤结节的数量或苏木精-伊红(H&E)染色结果，评估转移程度。

在皮下荷瘤小鼠模型中，测试了mIL-33治疗的两种给药方法。其一，从肿瘤细胞接种后第0天开始至第14天，向小鼠皮下注射100μg/kg的mIL-33，每天两次(图1A)。其二，从肿瘤细胞接种后第5天(可见肿瘤)开始直到试验结束，向小鼠皮下注射90μg/kg的mIL-33，每天一次。在随后的实验中(图2至图7)，采用第二种方法给药。

对于肺转移模型，从接种日开始，向小鼠皮下注射mIL-33(100μg/kg)，每天两次。对于肝转移模型，在接种后第8天，向小鼠皮下注射100μg/kg的mIL-33(每天两次)。推迟首次给药时间主要是为了防止小鼠抓伤伤口(脾脏接种肿瘤细胞需要切皮与缝合)，避免引起感染。

抗体和流式细胞分析

使用下列荧光染料偶联的抗小鼠抗体进行流式细胞分析：抗CD16/32抗体(2.4G2)、抗CD3抗体(145-2C11)、抗CD49b抗体(DX5)、抗CD8抗体(53-6.7)、抗CD4抗体(GK1.5)、抗CD25抗体(PC61.5)、抗CD45抗体(30-F11)、抗CD69抗体(H1.2F3)、抗Foxp3抗体(FJK-16s)、抗T-bet抗体(4B10)、抗Eomes抗体(Dan11mag)、抗PD-1抗体(RMP1-30)、抗Gr1抗体(RB6-8C5)、抗Siglec-F抗体(E50-2440)、抗CD11b抗体(M1/70)、抗CD11c抗体(N418)、抗F4/80抗体(BM8)、抗CD40抗体(3/23)、抗CD40L抗体(MR1)、抗MHCII抗体(M5/114.15.2)、抗IFN-γ抗体(XMG1.2)、抗TGF-β抗体(TW7-16B4)和抗ST2抗体(DIH9)。这些抗体及其匹配的同型对照购自BD Biosciences(Franklin Lakes，New Jersey，美国)、eBioscience(SanDiego，CA，美国)或BioLegend(San Diego，CA，美国)。

制备了来自脾和肿瘤组织的单细胞悬液。根据制造商的说明使用了转录因子缓冲液套装(BD Biosciences)，用于细胞内染色。使用了细胞刺激鸡尾酒试剂(加蛋白转运抑制剂)(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)，用于IFN-γ、TGF-β和CD40L检测。分别使用LSRFortessa^TM仪器(BD Biosciences)和FlowJo(Tree Star Inc.，Ashland，Oregon，美国)进行流式细胞分析和数据分析。

体内细胞耗竭和定量逆转录(RT-q)PCR

为耗竭CD4⁺T细胞或Treg(CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺)，每3天给小鼠腹腔注射一次200μg抗CD4抗体(GK1.5，BioXcell，West Lebanon，NH，美国)或抗CD25抗体(PC-61.5.3，BioXcell)。通过每隔一天腹腔注射15μg抗Siglec-F抗体(MAB17061，R&D Systems)来耗竭嗜酸性粒细胞。使用IgG2b(LTF-2，BioXcell)作为同型对照，所有抗体均溶于PBS，在mIL-33治疗前一天注射。

使用TRIzol试剂(Invitrogen)从同型(IgG2b)+PBS组和同型+mIL-33组的CT26肿瘤组织中提取总RNA，并使用PrimeScript^TM RT Master Mix(Takara，中国大连)进行逆转录(n＝每组4只小鼠)。RT-qPCR引物(见补充表1)由Invitrogen(中国上海)合成。使用TBGreen Premix Ex TaqII(Takara，中国大连)在Applied Biosystems StepOnePlus仪器上进行三次独立的相对mRNA水平测定。将GAPDH用作参考基因。使用2^–ΔΔCt法测定相对mRNA水平。

单克隆抗体阻断实验

为了阻断CD40/CD40L信号转导通路，每3天给小鼠腹腔注射200μg抗CD40抗体(MR-1，BioXcell，West Lebanon，NH，美国)。使用仓鼠IgG(仓鼠IgG f(ab’)2片段，BioXcell)作为同型对照，所有抗体均溶于PBS，在mIL-33治疗前一天注射。

血清IL-33水平的ELISA测定

按照制造商的说明，使用小鼠IL-33ELISA试剂盒(R&D Systems)测定IL-33^–/–小鼠、野生型(WT，C57BL/6)小鼠和给予IL-33(WT-IL-33)的小鼠的血清IL-33水平。通过90μg/kg mIL-33皮下给药治疗WT-IL-33小鼠，0.5小时、1小时和2小时后处死，并收集血清。

统计分析

数据表示为平均值±标准差(SD)。采用双尾Student未配对t检验比较两组间的平均值(转移灶数量或细胞数量、肿瘤重量、血清IL-33水平、流式细胞分析中的细胞比率或平均荧光强度(MFI))。使用重复测量ANOVA比较各组之间的肿瘤体积。将P<0.05作为统计显著性标准。所有数据均采用SPSS v.18.0(IBM，Armonk，NY，美国)或GraphPad Prism 5软件(San Diego，CA，美国)处理。

Claims (26)

1.一种治疗、预防或减少癌症发作或转移的方法，所述方法包括给予有需要的对象治疗有效量的人IL-33蛋白、或具有与之基本相同的相应序列的多肽。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述IL-33蛋白为人IL-33。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述人IL-33为重组人IL-33。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述人IL-33具有SEQ ID NO:1的序列。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述对象为人类。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症选自下组：

选自下组的实体肿瘤：胰腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、肝细胞癌(HCC)、鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、胃癌、生殖细胞瘤、小儿肉瘤、鼻腔/鼻窦自然杀伤细胞淋巴瘤、黑色素瘤、皮肤癌、骨癌、宫颈癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、睾丸癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、输尿管癌、阴茎癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、儿童实体瘤、环境诱发的癌症、病毒相关的癌症和病毒源性癌症；或

选自下组的血液癌症：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤、和缓型骨髓瘤、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、晚期、转移性、难治性和/或复发性恶性血液病，以及上述恶性血液病的任何组合。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述癌症选自下组：肝细胞癌(HCC)、肺癌(优选LLC，Lewis肺癌)、胃癌、结肠癌和前列腺癌。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症为肝细胞癌(HCC)。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症为肺癌。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述肺癌为Lewis肺癌。

11.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症为胃癌。

12.如权利要求1所述的方法，进一步包括给予至少一种抗癌物质。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述抗癌物质选自下组：细胞因子、免疫细胞因子、TNFα、PAP抑制剂、溶瘤病毒、激酶抑制剂、ALK抑制剂、MEK抑制剂、IDO抑制剂、GLS1抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、CART细胞或T细胞疗法、TLR激动剂、或肿瘤疫苗，或选自下组的抗体：抗CTLA-4抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗4-1BB抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIM3抗体、抗LAG3抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗IL-7Rα(CD127)抗体、抗IL-8抗体、抗IL-15抗体、抗HVEM抗体、抗BTLA抗体、抗CD40抗体、抗CD40L抗体、抗CD47抗体、抗CSF1 R抗体、抗CSF1抗体、抗IL-7R抗体、抗MARCO抗体、抗CXCR4抗体、抗VEGF抗体，抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体、抗TNFR1抗体、抗TNFR2抗体、抗CD3双特异性抗体、抗CD19抗体、抗CD20抗体、抗Her2抗体、抗EGFR抗体、抗ICOS抗体、抗CD22抗体、抗CD52抗体、抗CCR4抗体、抗CCR8抗体，抗CD200R抗体、抗VISG4抗体、抗CCR2抗体、抗LILRb2抗体、抗CXCR4抗体、抗CD206抗体、抗CD163抗体、抗KLRG1抗体、抗FLT3抗体、抗B7-H4抗体、抗B7-H3抗体、KLRG1抗体、BTN1A1抗体和抗GITR抗体。

14.一种用于治疗、预防或减少癌症发作或转移的组合物，所述组合物包含：作为活性成分的人IL-33蛋白或具有与之基本相同的相应序列的多肽、以及至少一种药学上可接受的载剂。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述IL-33蛋白为人IL-33蛋白。

16.一种治疗、预防或减少癌症发作或转移的方法，所述方法包括向有需要的对象给予治疗有效量的能够上调CD40/CD40L信号转导通路的药剂或具有与之基本相同的相应序列的多肽。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述能够上调CD40/CD40L信号转导通路的药剂为IL-33蛋白。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述IL-33蛋白为人IL-33蛋白。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述人IL-33为重组人IL-33。

20.如权利要求16所述的方法，其中所述对象为人类。

21.如权利要求16所述的方法，其中所述癌症为选自下组的实体肿瘤：胰腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、肝细胞癌(HCC)、鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、胃癌、生殖细胞瘤、小儿肉瘤、鼻腔/鼻窦自然杀伤细胞淋巴瘤、黑色素瘤、皮肤癌、骨癌、宫颈癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、睾丸癌、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、输尿管癌、阴茎癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱轴肿瘤、脑癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、儿童实体瘤、环境诱发的癌症、病毒相关的癌症和病毒源性癌症；或

选自下组的血液癌症：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓系白血病(CML)、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤、和缓型骨髓瘤、意义未明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、晚期、转移性、难治性和/或复发性恶性血液病，以及上述恶性血液病的任何组合。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述癌症选自下组：肝细胞癌(HCC)、肺癌、胃癌、结肠癌和前列腺癌。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述癌症为肝细胞癌(HCC)。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述癌症为肺癌。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述肺癌为Lewis肺癌。

26.如权利要求22所述的方法，其中所述癌症为胃癌。

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