CN116183935A

CN116183935A - 一种用于预测肝门部胆管癌预后的分子标志物及其应用

Info

Publication number: CN116183935A
Application number: CN202310233174.1A
Authority: CN
Inventors: 刘增利; 姜远辉; 邱博; 郑立杰
Original assignee: Qilu Hospital of Shandong University Qingdao
Current assignee: Qilu Hospital of Shandong University Qingdao
Priority date: 2023-03-13
Filing date: 2023-03-13
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2043-03-13
Also published as: CN116183935B

Abstract

本发明公开了一种用于预测肝门部胆管癌预后的分子标志物及其应用，涉及生物医药技术领域；所述分子标志物为叉头框蛋白N2。本发明还公开了检测叉头框蛋白N2表达量的试剂在制备诊断肝门部胆管癌预后的产品中的应用。本发明通过实验发现，FOXN2低表达的肝门部胆管癌患者的总体生存率明显低于FOXN2高表达患者。说明FOXN2可以作为预测肝门部胆管癌预后的分子标志物。本发明为预测肝门部胆管癌预后提供了新的标志物，这对于准确预测患者的预后风险及丰富胆管癌治疗策略具有重要意义。

Description

一种用于预测肝门部胆管癌预后的分子标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于预测肝门部胆管癌预后的分子标志物及其应用。

背景技术

胆管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是指起源于胆道系统并表达有胆管细胞标志物的上皮细胞恶性肿瘤。根据其发病的解剖学部位不同，胆管癌又分为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，iCCA)、肝门部胆管癌(perihilarcholangiocarcinoma，pCCA)以及远端胆管癌(distal cholangiocarcinoma，dCCA)。其中，pCCA指发生在二级胆管到胆囊管与肝总管汇合处的胆管癌，其发病率最高，占所有部位胆管癌的50％以上。

几十年来，肝门部胆管癌的总体预后几乎停滞不前。因其早期临床症状不明显，通常在胆道阻塞继而出现黄疸、腹痛等症状时才得以诊断，使得大部分患者失去了根治性手术的机会。在化疗方面，目前较为公认的是以吉西他滨联合顺铂为主的系统性化疗，但晚期肝门部胆管癌患者应用该化疗方案的五年生存率却低于5％。对于进展期的胆管癌，目前尚无标准化和公认的能够延长生存时间的化疗方案。种种因素导致了肝门部胆管癌患者的预后极差。因此，寻找能够预测肝门部胆管癌预后的新的标志物，对于准确预测患者的预后风险并及时给予干预具有重要意义。

FOXN2(Forkhead box N2，叉头框蛋白N2)是FOX转录因子家族的重要成员之一，作为一种肿瘤抑制因子已被证实在多种人类恶性肿瘤中发挥关键作用。如FOXN2能够抑制肺癌的肿瘤发生和放疗的耐药性，FOXN2的下调提示乳腺癌预后不良等。以上特点使得FOXN2具有成为恶性肿瘤预后分子标志物的潜能。然而，FOXN2在肝门部胆管癌中的作用尚未阐明，FOXN2与肝门部胆管癌患者预后的关系也没有相关研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于预测肝门部胆管癌预后的分子标志物及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现FOXN2低表达的肝门部胆管癌患者的总体生存率明显低于FOXN2高表达患者，因此FOXN2可以作为预测肝门部胆管癌预后的分子标志物，这对于准确预测患者的预后风险及丰富肝门部胆管癌治疗策略具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于预测肝门部胆管癌预后的分子标志物，所述分子标志物为叉头框蛋白N2。

进一步地，所述叉头框蛋白N2的表达量与肝门部胆管癌患者的预后良好呈负相关。

本发明还提供检测叉头框蛋白N2表达量的试剂在制备诊断肝门部胆管癌预后的产品中的应用。

进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。

本发明还提供一种诊断肝门部胆管癌预后的产品，包括检测叉头框蛋白N2表达量的试剂。

进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开了生物标志物在预测肝门部胆管癌预后中的应用。本发明通过实验发现，FOXN2低表达的肝门部胆管癌患者的总体生存率明显低于FOXN2高表达患者。说明FOXN2可以作为预测肝门部胆管癌预后的分子标志物。本发明为预测肝门部胆管癌预后提供了新的标志物，这对于准确预测患者的预后风险及丰富胆管癌治疗策略具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为利用免疫组化评分及生存状态绘制的123例pCCA患者的ROC曲线；

图2为利用免疫组化检测的123例pCCA患者组织样本中FOXN2蛋白的表达量；

图3为FOXN2蛋白表达量与pCCA患者样本判别的总生存期(OS)的生存曲线图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1用于预测胆管癌预后的分子标志物FOXN2表达测定

使用重组Anti-FOXN2抗体(ab236385)，对肝门部胆管癌组织芯片行免疫组化染色(IHC)，检测FOXN2蛋白表达。

1、人类胆管癌组织芯片的来源

收集了山东大学齐鲁医院自2010年1月至2020年12月确诊为肝门部胆管癌的病理石蜡标本共123例。这些患者全部接受肝门部胆管癌根治性切除术，且术后恢复顺利。所有入组的术后病理均由山东大学齐鲁医院病理科至少2名医师重新确认。

入组标准：

(1)术前结合腹部增强CT、MRI或MRCP等影像学检查、实验室检查及体格检查等证实为肝门部胆管癌，肿瘤位于肝门部，即位于二级胆管到胆囊管与肝总管汇合处之间的区域。

(2)肿瘤已排除远处转移及局部其他脏器浸润。

(3)患者一般情况良好，无心、肺、肾、脑等重要器官严重器质性病变而影响手术实施及术后恢复。

(4)手术方式为肝门部胆管癌根治术，即肿瘤行R0切除，上下切缘均及淋巴结活检均为阴性。手术成功，无严重术后并发症，术后恢复顺利，且未进行与原发疾病相关的二次手术。

(5)有明确的临床资料、术后随访资料以及术后生存时间，其术后生存时间大于3个月。

排除标准：

(1)术前行相关辅助治疗，如放化疗等。

(2)既往有上腹部手术史。

(3)术中因大出血或心跳骤停等意外而行姑息性手术或终止手术者。

(4)术中因查见局部脏器浸润或腹腔广泛脏器转移而行姑息性手术者。

(5)术后因手术相关并发症或其他非手术意外而死亡者，或术后生存期小于3个月。

(6)术后常规病理证实为非肝门部胆管腺癌，如鳞癌、腺鳞癌或肉瘤等。

2、组织芯片的制备

将所收集的石蜡标本进行病理定位后利用打孔机制成直径为1.5mm的组织芯片，其具体步骤如下：

(1)每个石蜡样本采集1个孔，共需123个孔。载玻片事先经多聚赖氨酸处理。

(2)根据HE染色切片对石蜡标本中具有代表性的点进行标记，找到典型的肿瘤组织，为后续打孔做好准备。

(3)在模具中倒入已融化态的石蜡，冷却后用细针打孔机整齐打孔，制成孔径为1.5mm的组织芯片受体蜡块。

(4)根据病理定位结果，在供体蜡块上用细针打孔机采集组织芯片，孔径为1.5mm。

(5)将采集到的组织芯片转移到受体蜡块相应的孔中，排列整齐并进行编号。

(6)将上一步组装完成的组织芯片蜡块置于55℃温箱中静置约8min，待蜡块处于半熔融状态时取出，置于室温下冷却。待受体蜡块与新插入的组织芯片溶为一体后，置于4℃冰箱中保存备用。

(7)在切片前将组织芯片蜡块在冰上预冷约20min后，在切片机上进行适当修正，直到切到完整的全部组织为止，切忌出现漏点、残点等现象。快速连续制作成4μm切片，后将切片转移至45℃的温水中，待其自然展开后，将其小心贴在经多聚赖氨酸处理过的载玻片上，室温晾干。60℃烤片3min，置于-20℃冰箱中保存备用(也可进行蜡封后置于4℃冰箱中保存备用)。

(8)组织芯片制完成后，在进行免疫组化(IHC)前，先使用伊红和苏木素染色(HE染色)进行组织学鉴定，以明确是否为肿瘤组织。

3、IHC具体操作步骤：

(1)将制备完成的组织芯片置于烤箱中58-60℃烤片45min，使组织紧密粘贴于载玻片，防止发生脱片。

(2)顺序经体积分数为100％、95％、85％、75％的梯度酒精溶液各水化5min，自来水冲洗5min，后蒸馏水洗3min，放入高压锅中进行热抗原修复10min，温度为100℃。

(3)在组织芯片上滴加体积分数3％的H₂O₂，室温下孵育15min，用以消除组织中的内源性过氧化物酶活性。

(4)后滴加体积分数为5％的正常山羊血清，置于37℃培养箱中静置20min。随后滴加浓度为1:100的一抗即FOXN2抗体(Abcam，Cat.No.ab236385)，置于4℃培养箱中过夜。

(5)将过夜后的组织芯片用PBS缓冲液冲洗3次，每次为5min。随后滴加50μL生物素标记的山羊二抗(ABclonal，Cat.No.AS003)，置于37℃培养箱孵育30min。

(6)滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素工作液，并用DAB试剂于室温下显色。置于光学显微镜下进行观察，严格控制反应时间，3min后用自来水终止显色反应。

(7)最后用苏木素复染3min。切片经体积分数为75％、85％、95％、100％的梯度酒精脱水干燥。自然风干后切片。最后在组织芯片上滴加中性树胶，加盖玻片，封固。

4、IHC评分方法：

使用Pannoramic MID软件对整张组织芯片进行扫描，IHC用Quant Center软件进行IHC结果的量化，将染色强度分为弱、中、强两种层次，并计算各染色的面积。

IHC评分＝(低表达的细胞面积占比×100)+(中表达的细胞面积占比×200)+(高表达的细胞面积占比×300)。

其中，低表达：细胞核无着色或呈微弱不完整淡黄着色；中表达：呈完整但不均匀的棕黄着色；高表达：呈强而完整的棕褐着色。

5、根据FOXN2的IHC评分预测肝门部胆管癌患者预后

根据测得的IHC评分及患者生存状态绘制ROC曲线(P＝0.021，AUC＝37.7)，结果见图1。

根据ROC曲线中特异性和敏感性之和最高的点(cut-off＝56.1)，通过Cut-off值进行二分类，将队列分为FOXN2低表达组(low FOXN2，n＝65)和FOXN2高表达组(highFOXN2，n＝58)。比较癌组织与配对的癌旁正常组织IHC评分差异，结果见图2。通过Kaplan-Meier法行生存分析，结果见图3。

如图3所示，在肝门部胆管癌中FOXN2蛋白的表达量与患者的预后良好呈负相关，即FOXN2高表达的患者总体生存趋势高于FOXN2低表达患者，其3年总体生存率(3-yearoverall survival)有较为明显差异，表明该模型能够有效预测患者的预后。利用单、多变分析揭示预后预测价值，结果见表1。

表1 pCCA患者临床病理特征的预后意义

注:HR＝风险比；p^a：log-rank检验；p^b：Cox回归风险模型。

如表1所示，临床病理学特征对总体预后有显着影响。Cox多变量回归分析显示，FOXN2是肝门部胆管癌患者预后的独立危险因素(HR＝0.51，95％CI：0.28-0.93，P＝0.028)。

根据上述研究和分析结果，可以得出以下进行胆管癌预后评估的方法：

S1：取肝门部胆管癌患者术后癌组织样本，进行样品实验前处理；

S2：利用免疫组化对癌组织样本中FONX2蛋白表达量进行检测，计算其IHC评分；

S3：预测肝门部胆管癌患者的预后情况：FONX2高表达(IHC评分≥56.1)，患者预后较好，FONX2低表达(IHC评分＜56.1)，患者预后较差。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种用于预测肝门部胆管癌预后的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为叉头框蛋白N2。

2.根据权利要求1所述的分子标志物，其特征在于，所述叉头框蛋白N2的表达量与肝门部胆管癌患者的预后良好呈负相关。

3.检测叉头框蛋白N2表达量的试剂在制备诊断肝门部胆管癌预后的产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。

5.一种诊断肝门部胆管癌预后的产品，其特征在于，包括检测叉头框蛋白N2表达量的试剂。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。