CN116144793A - 一种基于基因分型鉴定滩羊与非滩羊的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于基因分型鉴定滩羊与非滩羊的方法。本发明方法包括：检测待测羊的基因组中特定SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊对应于所述特定SNP位点组合的基因型；然后按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊对应于所述特定SNP位点组合的基因型符合滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊对应于所述特定SNP位点组合的基因型符合非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。本发明成功获得用于鉴定滩羊与非滩羊的SNP位点组合，为今后滩羊的鉴定、保种、以及遗传育种提供支撑。

Description

一种基于基因分型鉴定滩羊与非滩羊的方法
本申请是申请号为201810409670.7、申请日为2018年5月2日、发明创造名称为“一种基于基因分型鉴定滩羊与非滩羊的方法”的分案申请
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于基因分型鉴定滩羊与非滩羊的方法。
背景技术
近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在生物物种鉴定中也取得了长足的进展。基因检测技术以其几乎可以对所有的生物类材料进行鉴定而被广泛应用于动植物物种鉴定。基因检测技术鉴定动植物物种是物种识别中发展最快、准确率最高的技术手段。
全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行全基因组范围的测序，随着测序成本降低和已知基因组序列的物种增多，重测序已经成为动植物育种研究中最为有效的方法之一。Sequenom SNP分型技术通过引物延伸反应原理进行，将灵敏的PCR扩增和可靠的MALDI-TOF质谱技术相结合，实现基因分型检测，此技术特别适合对全基因组研究发现的结果进行验证。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于基因分型鉴定滩羊与非滩羊的方法。
第一方面，本发明要求保护一种基于基因分型鉴定滩羊与非滩羊的方法。
本发明所提供的基于基因分型鉴定滩羊与非滩羊的方法，可为如下任一种：
第一种，基于11组SNP位点组合进行鉴定的方法。该方法具体可包括如下步骤：检测待测羊的基因组中11组SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊对应于所述11组SNP位点组合的11个基因型；然后按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊对应于所述11组SNP位点组合的11个基因型均符合相应组SNP位点组合的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊对应于所述11组SNP位点组合的11个基因型均符合相应组SNP位点组合的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
所述11组SNP位点组合为如下(a1)-(a11)；(a1)-(a11)所示的11组SNP位点组合所对应的非滩羊标准基因型和滩羊标准基因型依次分别为(b1)-(b11)。即(a1)所示的SNP位点组合所对应的非滩羊标准基因型和滩羊标准基因型为(b1)；(a2)所示的SNP位点组合所对应的非滩羊标准基因型和滩羊标准基因型为(b2)；……(a11)所示的SNP位点组合所对应的非滩羊标准基因型和滩羊标准基因型为(b11)。
(a1)含有5个SNP位点，分别为CM001598.2:69009397、CM001602.2:49927473、CM001603.2:38707088、CM001603.2:46619514和CM001606.2:34435705；
(a2)含有5个SNP位点，分别为CM001582.2:86006851、CM001598.2:69009397、CM001600.2:45516740、CM001601.2:47737780和CM001603.2:46619514；
(a3)含有5个SNP位点，分别为CM001582.2:86006851、CM001583.2:42344562、CM001584.2:11650210、CM001584.2:12200323和CM001588.2:9423474；
(a4)含有5个SNP位点，分别为CM001592.2:57058734、CM001595.2:48968164、CM001598.2:69009397、CM001601.2:47737780和CM001603.2:38707088；
(a5)含有5个SNP位点，分别为CM001585.2:30868868、CM001589.2:75561002、CM001590.2:56924859、CM001598.2:69009397和CM001606.2:34435705；
(a6)含有5个SNP位点，分别为CM001585.2:30868868、CM001588.2:84941340、CM001598.2:45312379、CM001598.2:69009397和CM001603.2:46619514；
(a7)含有5个SNP位点，分别为CM001585.2:30868868、CM001588.2:84941340、CM001594.2:45477903、CM001594.2:80961940和CM001603.2:38707088；
(a8)含有5个SNP位点，分别为CM001585.2:30868868、CM001588.2:84941340、CM001593.2:1397868、CM001595.2:14087769和CM001602.2:49927473；
(a9)含有5个SNP位点，分别为CM001585.2:30868868、CM001588.2:84941340、CM001592.2:34421625、CM001592.2:53664048和CM001595.2:48968164；
(a10)含有5个SNP位点，分别为CM001584.2:79082958、CM001584.2:157466635、CM001601.2:47737780、CM001602.2:49927473和CM001603.2:38707088；
(a11)含有5个SNP位点，分别为CM001584.2:79082958、CM001585.2:5250467、CM001588.2:84941340、CM001595.2:43390933和CM001595.2:48968164；
所述11组SNP位点组合中的各SNP位点的物理位置是基于滩羊全基因组标准序列比对确定的，所述滩羊全基因组标准序列的版本号为Ovis.Aries V4.0；共29个SNP位点，具体如下：
CM001582.2:86006851位于1号染色体上第86006851位，其脱氧核苷酸为G或T；
CM001583.2:42344562位于2号染色体上第42344562位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001584.2:11650210位于3号染色体上第11650210位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001584.2:12200323位于3号染色体上第12200323位，其脱氧核苷酸为C或G；
CM001584.2:79082958位于3号染色体上第79082958位，其脱氧核苷酸为A或G；
CM001584.2:157466635位于3号染色体上第157466635位，其脱氧核苷酸为C或T；
CM001585.2:5250467位于4号染色体上第5250467位，其脱氧核苷酸为C或G；
CM001585.2:30868868位于4号染色体上第30868868位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001588.2:9423474位于7号染色体上第9423474位，其脱氧核苷酸为A或C；
CM001588.2:84941340位于7号染色体上第84941340位，其脱氧核苷酸为A或C；
CM001589.2:75561002位于8号染色体上第75561002位，其脱氧核苷酸为C或G；
CM001590.2:56924859位于9号染色体上第56924859位，其脱氧核苷酸为A或G；
CM001592.2:34421625位于11号染色体上第34421625位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001592.2:53664048位于11号染色体上第53664048位，其脱氧核苷酸为A或G；
CM001592.2:57058734位于11号染色体上第57058734位，其脱氧核苷酸为C或G；
CM001593.2:1397868位于12号染色体上第1397868位，其脱氧核苷酸为A或G；
CM001594.2:45477903位于13号染色体上第45477903位，其脱氧核苷酸为A或G；
CM001594.2:80961940位于13号染色体上第80961940位，其脱氧核苷酸为A或C；
CM001595.2:14087769位于14号染色体上第14087769位，其脱氧核苷酸为A或T；
CM001595.2:43390933位于14号染色体上第43390933位，其脱氧核苷酸为A或G；
CM001595.2:48968164位于14号染色体上第48968164位，其脱氧核苷酸为T或G；
CM001598.2:45312379位于17号染色体上第45312379位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001598.2:69009397位于17号染色体上第69009397位，其脱氧核苷酸为A或C；
CM001600.2:45516740位于19号染色体上第45516740位，其脱氧核苷酸为A或C；
CM001601.2:47737780位于20号染色体上第47737780位，其脱氧核苷酸为A或G；
CM001602.2:49927473位于21号染色体上第49927473位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001603.2:38707088位于22号染色体上第38707088位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001603.2:46619514位于22号染色体上第46619514位，其脱氧核苷酸为A或G；
CM001606.2:34435705位于25号染色体上第34435705位，其脱氧核苷酸为C或G；
当然，在实际操作过程中所采用的所述滩羊全基因组标准序列的版本号不局限为Ovis.Aries V4.0这一种，不论采用哪种所述滩羊全基因组标准序列的版本号，只要是涉及的SNP位点与本发明以上所述29个SNP位点相同，均落入本发明的保护范围。
(b1)非滩羊标准基因型为如下任一：CC_TT_CC_AA_CG；CC_TC_CC_AA_GG；CC_TT_CC_AA_GG；CC_TC_TC_AA_GG；AC_TT_CC_AA_GG；AC_TT_CC_AA_CG；CC_CC_CC_AA_CG；AC_CC_TC_AA_GG；AC_CC_CC_AA_CG；CC_CC_CC_AA_GG；CC_TC_TC_AA_CG；CC_TT_TC_AA_GG；CC_TC_CC_AA_CG；CC_TT_TC_AA_CG；滩羊标准基因型为如下任一：CC_CC_TT_AA_CG；AA_CC_CC_AA_CG；CC_TC_TT_AA_CG；CC_CC_CC_GA_CC；AC_TC_TC_AA_CG；AC_CC_TC_AA_CG；CC_CC_TC_AA_CC；AC_TC_CC_AA_GG；AA_CC_TC_GA_CG；CC_CC_CC_GG_CG；AA_CC_CC_GG_CC；AC_CC_TC_GA_GG；AA_CC_TC_AA_CC；CC_CC_TT_GA_GG；AC_CC_CC_AA_CC；AC_CC_TC_GA_CC。
(b2)非滩羊标准基因型为如下任一：TT_CC_CC_GG_AA；TT_AC_CC_GG_AA；TT_CC_CC_AG_AA；TT_AC_AC_AG_AA；TT_CC_AC_AG_AA；TT_CC_AC_GG_AA；TT_CC_CC_AA_AA；滩羊标准基因型为如下任一：TT_AA_AC_AG_GA；TT_CC_AA_AG_AA；GT_AC_CC_AG_AA；TT_AC_AC_GG_AA；GG_AC_AC_GG_GA；TT_AC_CC_AG_AA；GT_AC_AC_AG_AA；GG_CC_CC_AG_GG；GG_AC_AC_AA_GA；TT_CC_AC_GG_GA；GT_AA_AC_AG_AA；GG_CC_AA_AA_GA；GT_AC_AC_AG_GA；TT_AC_AC_AA_GA；TT_CC_AC_AG_GA。
(b3)非滩羊标准基因型为如下任一：TT_TC_TT_CG_AC；TT_TT_TT_GG_AC；TT_TC_TT_GG_CC；TT_CC_CT_GG_CC；TT_TT_CT_GG_CC；TT_TT_TT_GG_CC；TT_CC_TT_GG_CC；TT_TT_TT_CG_CC；TT_TC_CT_GG_CC；TT_TC_TT_CG_CC；TT_TC_TT_GG_AC；GT_TT_TT_GG_CC；滩羊标准基因型为如下任一：TT_CC_CT_CG_CC；TT_TC_CC_GG_CC；TT_TT_CT_CC_CC；GT_CC_CT_CG_AC；GG_CC_TT_GG_AC；GT_CC_TT_GG_CC；TT_CC_TT_CG_AC；GG_TT_CC_CC_AA；TT_CC_CT_GG_AC；TT_CC_CC_CG_AA；GT_CC_CT_CG_CC。
(b4)非滩羊标准基因型为如下任一：CC_GT_CC_GG_CC；GC_TT_CC_GG_CC；GG_TT_CC_AG_TC；GG_GT_AC_GG_CC；GC_GT_CC_GG_CC；GC_TT_CC_AG_TC；CC_GT_AC_AG_CC；GC_TT_CC_GG_TC；GG_TT_AC_GG_TC；GG_TT_CC_GG_CC；CC_TT_CC_AG_CC；CC_TT_AC_GG_CC；GC_TT_CC_AG_CC；CC_TT_CC_GG_CC；CC_TT_CC_GG_TC；GC_GT_CC_AA_TC；GG_TT_CC_AG_CC；GG_GT_CC_GG_CC；GC_GT_CC_GG_TC；滩羊标准基因型为如下任一：CC_GT_AA_AG_TC；GC_GT_AC_GG_CC；GC_GT_AC_AG_TC；CC_GT_AA_AA_CC；GC_GG_AA_AG_TC；CC_GT_AC_AG_TT；CC_GG_CC_AA_CC；GC_GG_AC_GG_TC；CC_TT_AC_GG_TT；CC_GT_AC_AG_TC；CC_GG_CC_AG_TC；CC_GG_AC_AG_TC；CC_TT_CC_AG_TT；CC_GT_CC_AG_CC；CC_GG_AA_AG_CC；CC_TT_AC_AA_TC；CC_GG_AA_AG_TC；CC_GT_CC_AA_TT；CC_GG_AC_AG_TT；CC_GT_AC_AA_CC；CC_GT_AC_AA_TC；CC_TT_AC_AG_CC。
(b5)非滩羊标准基因型为如下任一：CC_GG_AA_CC_CG；CC_GG_GA_AC_GG；CC_GG_GA_CC_GG；CC_CC_GA_CC_CG；CC_CC_AA_CC_GG；TC_GG_GG_AC_GG；CC_CG_GG_CC_CG；CC_CG_GA_CC_GG；TC_CG_GA_AC_CG；CC_CG_GA_CC_CG；TC_CG_GA_AC_GG；CC_CG_GG_CC_GG；TC_CG_AA_CC_GG；CC_CG_AA_CC_GG；CC_GG_GG_CC_GG；CC_GG_GA_AC_CG；TC_GG_GG_CC_GG；TC_GG_GG_CC_CG；TC_GG_GA_CC_CG；TC_CG_GG_CC_CG；TC_GG_GA_CC_GG；滩羊标准基因型为如下任一：TC_CG_GA_AC_CC；TC_CC_GA_CC_CG；TT_CG_AA_AA_CG；CC_CC_AA_CC_CC；TT_CG_GA_AC_CG；TC_CC_GA_AC_CG；TT_CC_AA_CC_CC；TC_CG_AA_CC_CG；TC_CG_GA_CC_CG；TC_GG_GA_AC_GG；CC_CC_AA_CC_CG；TT_CG_GA_AA_CC；CC_CC_AA_AA_GG；TT_CC_GA_AC_CG；CC_CC_GA_AC_CC。
(b6)非滩羊标准基因型为如下任一：CC_CA_CC_CC_AA；TC_AA_TC_CC_AA；CC_AA_CC_AC_AA；CC_CA_TC_CC_AA；CC_CA_TT_CC_AA；TC_CA_CC_AC_AA；CC_AA_CC_CC_AA；CC_AA_TC_CC_AA；TC_AA_CC_CC_AA；TC_CC_TC_CC_AA；CC_AA_TT_CC_AA；CC_CC_TC_CC_AA；TC_CA_CC_CC_AA；滩羊标准基因型为如下任一：TC_CA_TC_AA_GA；TC_AA_TT_CC_AA；TT_CC_TC_AA_AA；TT_AA_TT_AC_GA；TC_CA_TC_CC_AA；TC_AA_TC_AC_GA；TC_CC_TC_AC_AA；TC_AA_TT_AC_AA；TT_CC_CC_CC_AA；TC_AA_TC_AC_AA；TC_CA_TT_AC_GA；CC_CA_TT_CC_GA；TT_CC_TT_AA_AA；TC_CC_TC_CC_GA；TT_CC_TC_AC_GA；CC_CA_TT_AC_AA。
(b7)非滩羊标准基因型为如下任一：CC_CA_GG_AA_CC；TC_AA_GG_CA_CC；CC_CA_GG_AA_TC；TC_CA_GG_AA_CC；CC_AA_GG_CA_CC；TC_CA_GG_CA_CC；TC_AA_GG_CA_TC；CC_AA_GG_CA_TC；CC_CA_GG_CC_CC；CC_AA_GG_AA_CC；CC_CA_AG_AA_TC；TC_CC_GG_CA_CC；TC_AA_GG_AA_TC；TC_CA_AG_AA_CC；CC_CC_GG_AA_CC；TC_AA_AG_AA_CC；滩羊标准基因型为如下任一：TC_CA_AG_AA_TC；TC_AA_AG_AA_TC；TT_AA_GG_AA_TC；TT_CC_AG_AA_CC；TT_CC_GG_AA_TC；TT_AA_AG_AA_TC；TC_CA_AA_AA_TT；TC_CA_AA_AA_CC；TC_CC_AG_AA_TC；TC_CA_GG_AA_TC；TC_CA_GG_AA_TT；TT_CC_AG_AA_TC；TC_CC_AG_AA_CC；CC_CA_AG_AA_CC。
(b8)非滩羊标准基因型为如下任一：CC_CA_GG_AA_TT；CC_AA_GG_AA_TC；CC_CA_AG_AA_TT；CC_CA_GG_TT_TC；CC_CA_AG_AA_TC；TC_CA_AG_TA_TT；CC_AA_AG_TT_CC；CC_AA_AG_TA_TC；CC_AA_AA_TA_CC；TC_AA_AG_TT_CC；CC_AA_GG_TT_TC；TC_AA_GG_AA_TT；CC_AA_GG_TT_CC；CC_AA_AG_TA_CC；TC_AA_AG_TT_TC；CC_CA_AG_TT_CC；CC_AA_AG_TT_TC；CC_AA_AG_AA_CC；CC_AA_GG_AA_CC；CC_CA_GG_TA_TC；TC_CC_GG_AA_TT；TC_AA_GG_TA_CC；TC_AA_AG_AA_TC；CC_AA_GG_TT_TT；CC_AA_GG_TA_TT；CC_AA_AA_TA_TC；CC_CA_GG_TT_TT；CC_CC_GG_TA_CC；TC_AA_GG_TA_TC；TC_CA_GG_TT_TC；CC_AA_GG_TA_TC；TC_AA_AG_AA_TT；滩羊标准基因型为如下任一：TC_CA_AA_AA_TC；TC_CA_AG_AA_CC；TC_AA_AG_TA_CC；TT_CC_AA_AA_TC；TT_AA_AA_AA_CC；TC_AA_AG_TA_TC；TC_CC_AG_AA_CC；TC_CA_GG_AA_CC；TC_CA_AG_AA_TC；TC_AA_AG_AA_CC；TT_CC_GG_AA_CC；TC_CC_AA_AA_CC；CC_CA_AA_AA_TC；TT_CC_AA_AA_CC；TT_AA_GG_AA_CC；CC_CA_GG_AA_CC。
(b9)非滩羊标准基因型为如下任一：CC_CA_TT_GG_GT；TC_AA_TT_GG_GT；CC_AA_TT_AG_GT；TC_CA_TT_GG_GT；CC_AA_TT_GG_GT；CC_AA_CT_GG_TT；CC_AA_TT_GG_TT；TC_AA_TT_AG_GT；TC_AA_TT_GG_TT；CC_CA_TT_GG_TT；CC_CA_TT_AG_TT；TC_CC_TT_GG_TT；CC_CC_TT_AG_GT；TC_CA_TT_AG_TT；滩羊标准基因型为如下任一：TC_CA_TT_AG_GT；TT_AA_CT_AG_GT；TT_CC_TT_AG_GG；TC_AA_TT_AG_TT；TC_AA_TT_GG_GG；TT_CC_CT_AG_GG；TC_CA_TT_GG_TT；TC_CA_CT_GG_GT；CC_CA_TT_AG_GG；TT_CC_CT_AA_GG；TC_CC_CT_AG_GG；TC_CC_CT_AG_GT；TT_AA_TT_AA_TT；TT_CC_TT_AA_GT；CC_CA_CT_AG_TT。
(b10)非滩羊标准基因型为如下任一：AA_CC_GG_TT_CC；AA_CT_GG_TT_CC；GA_CT_GG_TT_CC；GA_CC_AG_TC_TC；GA_CC_AG_CC_CC；GA_CT_GG_TC_TC；GA_CC_GG_TC_CC；AA_CT_GG_CC_CC；GA_CT_AG_CC_CC；AA_CT_AG_CC_CC；GA_TT_GG_CC_CC；AA_CC_AG_CC_CC；AA_CT_AG_TC_TC；AA_CT_GG_TC_TC；GG_TT_GG_TT_CC；GA_TT_AA_TT_TC；GG_CC_AG_TC_CC；GA_CC_AG_TT_CC；GA_CT_AG_TC_CC；AA_CC_GG_CC_CC；GA_TT_GG_TC_CC；AA_CC_GG_TC_CC；GA_CT_GG_TC_CC；AA_CC_GG_TT_TC；滩羊标准基因型为如下任一：GA_CT_AG_TC_TC；AA_TT_GG_CC_CC；GA_CT_AG_CC_TT；GG_TT_AG_TC_TT；GG_TT_GG_TC_TT；GG_CT_GG_TC_CC；GG_CT_AA_CC_CC；GG_CT_GG_TC_TC；GG_CT_GG_TC_TT；AA_TT_AG_CC_TC；GA_CT_GG_CC_TC；GA_TT_AG_CC_TC；AA_CT_AA_CC_TC；AA_CT_AG_TC_CC；GG_TT_AG_CC_TC；GG_TT_AG_CC_CC；GG_CT_AG_CC_CC；GG_CT_AA_CC_TC；GG_TT_GG_TC_TC；GG_TT_AA_CC_CC；GA_TT_AA_CC_TC；GA_TT_AG_CC_CC。
(b11)非滩羊标准基因型为如下任一：AA_GC_CA_AG_GT；GA_GC_AA_AG_GT；GG_GC_AA_GG_GT；AA_CC_CA_AG_TT；GA_GC_CA_AG_TT；AA_CC_CA_GG_GT；GA_GC_AA_GG_GT；GA_CC_AA_AA_GT；GA_CC_AA_AG_TT；AA_GG_AA_AG_TT；GA_CC_AA_GG_TT；AA_GG_AA_GG_TT；AA_CC_AA_GG_TT；GA_GC_AA_GG_TT；AA_GC_AA_GG_TT；AA_GC_CA_AG_TT；AA_CC_AA_AG_TT；GA_GC_AA_AG_TT；AA_GC_AA_AG_TT；AA_CC_CA_GG_TT；GA_CC_CC_AG_TT；AA_CC_AA_AA_TT；GG_CC_AA_GG_TT；GA_CC_CA_AG_GT；AA_CC_CC_AG_GT；GA_CC_AA_AA_TT；AA_CC_AA_GG_GT；滩羊标准基因型为如下任一：AA_GC_AA_GG_GT；AA_GC_CC_AG_GT；GA_GC_CA_AA_GT；GA_GG_CA_AG_TT；GA_GG_AA_AG_GG；AA_GG_CC_AG_GG；GG_GC_CC_AA_GT；GG_GC_CA_AG_GT；GG_GC_CC_AA_GG；GG_GC_CA_AA_TT；GA_GC_CA_AG_GG；GG_GC_CC_AG_GG；GG_CC_CC_AA_GG；GG_GC_CC_AG_GT；GA_GC_CA_AG_GT；GA_GC_CC_AG_GT；AA_GG_CC_GG_GT。
以上(b1)-(b11)中所示的基因型表示为X1X2_X3X4_X5X6_X7X8_X9X10，其中X1至X10均表示A或C或T或G，X1X2表示SNP位点组合中第一个SNP位点处的核苷酸(如AA表示该SNP位点处的核苷酸为A的纯合型；如AT表示该SNP位点处的核苷酸为A和T的杂合型)，X3X4表示该SNP位点组合中第二个SNP位点处的核苷酸，……，X9X10表示该SNP位点组合中第五个SNP位点处的核苷酸。
第二种，基于1组SNP位点组合进行鉴定的方法。该方法具体可为如下任一：
(1)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a1)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b1)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b1)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
(2)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中所述所述(a2)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合所述所述(b2)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合所述所述(b2)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
(3)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中所述所述(a3)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合所述所述(b3)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合所述所述(b3)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
(4)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中所述所述(a4)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合所述所述(b4)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b4)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
(5)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a5)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b5)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b5)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
(6)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a6)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b6)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b6)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
(7)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a7)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b7)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b7)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
(8)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a8)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b8)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b8)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
(9)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a9)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b9)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b9)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
(10)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a10)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b10)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b10)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
(11)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a11)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b11)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b11)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊。
第二方面，本发明要求保护一种基于基因分型鉴定滩羊的方法。
本发明所提供的基于基因分型鉴定滩羊的方法，可为如下任一种：
第一种，基于11组SNP位点组合进行鉴定的方法。该方法可包括如下步骤：检测待测羊的基因组中11组SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊对应于所述11组SNP位点组合的11个基因型；如果所述待测羊对应于所述11组SNP位点组合的11个基因型均符合相应组SNP位点组合的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
其中，所述11组SNP位点组合为前文所述的(a1)-(a11)；(a1)-(a11)所示的11组SNP位点组合所对应的滩羊标准基因型依次分别为前文所述的(b1)-(b11)中的滩羊标准基因型。
第二种，基于1组SNP位点组合进行鉴定的方法。该方法具体可为如下任一：
(1)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a1)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b1)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
(2)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a2)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b2)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
(3)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a3)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b3)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
(4)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a4)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b4)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
(5)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a5)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b5)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
(6)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a6)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b6)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
(7)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a7)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b7)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
(8)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a8)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b8)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
(9)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a9)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b9)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
(10)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a10)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b10)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
(11)包括如下步骤：检测待测羊的基因组中前文所述(a11)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合前文所述(b11)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
在第一方面和第二方面所述的方法中，所述待测羊具体可为滩羊或非滩羊(如蒙古羊)。
在第一方面和第二方面所述的方法中，检测所述待测羊的基因组中SNP位点处的核苷酸的具体方法可为全基因组重测序法。进一步地，用于进行所述全基因组重测序法的DNA样本取自于所述待测羊的血液或耳组织。
第三方面，本发明还要求保护如下几种应用。
第一种，用于检测羊基因组中前文所述的11组SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸的物质(或者用于检测羊基因组中前文所述的29个SNP位点处的核苷酸的物质)在鉴定滩羊和/或非滩羊中的应用，或者在制备用于鉴定滩羊和/或非滩羊的试剂盒中的应用。
第二种，用于检测羊基因组中前文所述的11组SNP位点组合中任意一组的各SNP位点处的核苷酸的物质鉴定滩羊和/或非滩羊中的应用，或者在制备用于鉴定滩羊和/或非滩羊的试剂盒中的应用。
在上述两应用中，所述物质具体可为针对待检测SNP位点所设计的PCR引物和/或测序引物。
进一步地，用于检测所述CM001582.2:86006851的引物为SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示两条单链DNA；用于检测所述CM001583.2:42344562的引物为SEQ ID No.4和SEQID No.5所示两条单链DNA；用于检测所述CM001584.2:11650210的引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示两条单链DNA；用于检测所述CM001584.2:12200323的引物为SEQ IDNo.10和SEQ ID No.11所示两条单链DNA；用于检测所述CM001584.2:79082958的引物为SEQID No.13和SEQ ID No.14所示两条单链DNA；用于检测所述CM001584.2:157466635的引物为SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示两条单链DNA；用于检测所述CM001585.2:5250467的引物为SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示两条单链DNA；用于检测所述CM001585.2:30868868的引物为SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示两条单链DNA；用于检测所述CM001588.2:9423474的引物为SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示两条单链DNA；用于检测所述CM001588.2:84941340的引物为SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示两条单链DNA；用于检测所述CM001589.2:75561002的引物为SEQ ID No.31和SEQ ID No.32所示两条单链DNA；用于检测所述CM001590.2:56924859的引物为SEQ ID No.34和SEQ ID No.35所示两条单链DNA；用于检测所述CM001592.2:34421625的引物为SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示两条单链DNA；用于检测所述CM001592.2:53664048的引物为SEQ ID No.40和SEQ ID No.41所示两条单链DNA；用于检测所述CM001592.2:57058734的引物为SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示两条单链DNA；用于检测所述CM001593.2:1397868的引物为SEQ ID No.46和SEQ IDNo.47所示两条单链DNA；用于检测所述CM001594.2:45477903的引物为SEQ ID No.49和SEQID No.50所示两条单链DNA；用于检测所述CM001594.2:80961940的引物为SEQ ID No.52和SEQ ID No.53所示两条单链DNA；用于检测所述CM001595.2:14087769的引物为SEQ IDNo.55和SEQ ID No.56所示两条单链DNA；用于检测所述CM001595.2:43390933的引物为SEQID No.58和SEQ ID No.59所示两条单链DNA；用于检测所述CM001595.2:48968164的引物为SEQ ID No.61和SEQ ID No.62所示两条单链DNA；用于检测所述CM001598.2:45312379的引物为SEQ ID No.64和SEQ ID No.65所示两条单链DNA；用于检测所述CM001598.2:69009397的引物为SEQ ID No.67和SEQ ID No.68所示两条单链DNA；用于检测所述CM001600.2:45516740的引物为SEQ ID No.70和SEQ ID No.71所示两条单链DNA；用于检测所述CM001601.2:47737780的引物为SEQ ID No.73和SEQ ID No.74所示两条单链DNA；用于检测所述CM001602.2:49927473的引物为SEQ ID No.76和SEQ ID No.77所示两条单链DNA；用于检测所述CM001603.2:38707088的引物为SEQ ID No.79和SEQ ID No.80所示两条单链DNA；用于检测所述CM001603.2:46619514的引物为SEQ ID No.82和SEQ ID No.83所示两条单链DNA；用于检测所述CM001606.2:34435705的引物为SEQ ID No.85和SEQ ID No.86所示两条单链DNA。
更进一步地，用于检测所述CM001582.2:86006851的引物还包括SEQ ID No.3所示的单链DNA；用于检测所述CM001583.2:42344562的引物还包括SEQ ID No.6所示的单链DNA；用于检测所述CM001584.2:11650210的引物还包括SEQ ID No.9所示的单链DNA；用于检测所述CM001584.2:12200323的引物还包括SEQ ID No.12所示的单链DNA；用于检测所述CM001584.2:79082958的引物还包括SEQ ID No.15所示的单链DNA；用于检测所述CM001584.2:157466635的引物还包括SEQ ID No.18所示的单链DNA；用于检测所述CM001585.2:5250467的引物还包括SEQ ID No.21所示的单链DNA；用于检测所述CM001585.2:30868868的引物还包括SEQ ID No.24所示的单链DNA；用于检测所述CM001588.2:9423474的引物还包括SEQ ID No.27所示的单链DNA；用于检测所述CM001588.2:84941340的引物还包括SEQ ID No.30所示的单链DNA；用于检测所述CM001589.2:75561002的引物还包括SEQ ID No.33所示的单链DNA；用于检测所述CM001590.2:56924859的引物还包括SEQ ID No.36所示的单链DNA；用于检测所述CM001592.2:34421625的引物还包括SEQ ID No.39所示的单链DNA；用于检测所述CM001592.2:53664048的引物还包括SEQ ID No.42所示的单链DNA；用于检测所述CM001592.2:57058734的引物还包括SEQ ID No.45所示的单链DNA；用于检测所述CM001593.2:1397868的引物还包括SEQ ID No.48所示的单链DNA；用于检测所述CM001594.2:45477903的引物还包括SEQ ID No.51所示的单链DNA；用于检测所述CM001594.2:80961940的引物还包括SEQ ID No.54所示的单链DNA；用于检测所述CM001595.2:14087769的引物还包括SEQ ID No.57所示的单链DNA；用于检测所述CM001595.2:43390933的引物还包括SEQ ID No.60所示的单链DNA；用于检测所述CM001595.2:48968164的引物还包括SEQ ID No.63所示的单链DNA；用于检测所述CM001598.2:45312379的引物还包括SEQ ID No.66所示的单链DNA；用于检测所述CM001598.2:69009397的引物还包括SEQ ID No.69所示的单链DNA；用于检测所述CM001600.2:45516740的引物还包括SEQ ID No.72所示的单链DNA；用于检测所述CM001601.2:47737780的引物还包括SEQ ID No.75所示的单链DNA；用于检测所述CM001602.2:49927473的引物还包括SEQ ID No.78所示的单链DNA；用于检测所述CM001603.2:38707088的引物还包括SEQ ID No.81所示的单链DNA；用于检测所述CM001603.2:46619514的引物还包括SEQ ID No.84所示的单链DNA；用于检测所述CM001606.2:34435705的引物还包括SEQ ID No.87所示的单链DNA。
第三种，羊基因组中前文所述11组SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸的多态性(或者羊基因组中前文所述的29个SNP位点处的核苷酸的多态性)在鉴定滩羊和/或非滩羊的中的应用。
第四种，羊基因组中前文所述的11组SNP位点组合中任意一组的各SNP位点处的核苷酸的多态性在鉴定滩羊和/或非滩羊的中的应用。
第四方面，本发明要求保护如下(B1)或(B2)所示的成套引物：
(B1)用于检测羊基因组中前文所述11组SNP位点组合中各SNP位点处核苷酸的成套引物；
(B2)用于检测羊基因组中前文所述11组SNP位点组合中任意一组的各SNP位点处的核苷酸的成套引物。
其中，用于检测各SNP位点的引物如前文所述(详见表2)。
本发明通过对50只滩羊和50只非滩羊进行全基因组重测序，得到29个位点，然后通过R编程分析，得到5分型结果基因型(鉴定率为85％以上)。然后通过1000份滩羊和1000份非滩羊进行sequenom验证，结果显示均与判定结果相符合。本发明成功获得用于鉴定滩羊与非滩羊的SNP位点组合，为开发滩羊品种鉴定芯片，更为今后滩羊的鉴定、保种、以及遗传育种提供支撑。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、全基因组重测序获得鉴定滩羊与非滩羊的5分型结果基因型
供试样本：50只滩羊(来自宁夏盐池县)和50只非滩羊(来自宁夏、内蒙等地)。
以供试羊的血液或耳组织为样品，提取基因组DNA，然后采用全基因组重测序的方法，得到29个SNP位点，然后通过R编程分析，得到5分型结果基因型(表1)。
其中，SNP位点挑选方法如下：首先标记出所有P值<-8的位点，然后手动的观察是否有连续的染色体区域(连锁不平衡区域)。至少有超过4个连续位点时才认定为连续区域。位点挑选原则为：1)首先选择那些在连续区域内P值<-8的位点中的最显著位点。2)其次选择那些P值<-8，但没在连续区域的位点中的最显著位点；3)选择那些较大的连续区域，但是却没有P值<-8的位点中的最显著位点。
全基因组重测序的方法具体如下：提取基因组DNA，利用Covaris进行随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段(0.2～5Kb)，加上接头，进行cluster制备(Illumina HiseqX10)，最后利用Paired-End(Illumina Hiseq X10)的方法对插入片段进行重测序。
29个SNP位点的物理位置是基于滩羊全基因组标准序列比对确定的，所述滩羊全基因组标准序列的版本号为Ovis.Aries V4.0；具体如下：
CM001582.2:86006851位于1号染色体上第86006851位，其脱氧核苷酸为G或T；
CM001583.2:42344562位于2号染色体上第42344562位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001584.2:11650210位于3号染色体上第11650210位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001584.2:12200323位于3号染色体上第12200323位，其脱氧核苷酸为C或G；
CM001584.2:79082958位于3号染色体上第79082958位，其脱氧核苷酸为A或G；
CM001584.2:157466635位于3号染色体上第157466635位，其脱氧核苷酸为C或T；
CM001585.2:5250467位于4号染色体上第5250467位，其脱氧核苷酸为C或G；
CM001585.2:30868868位于4号染色体上第30868868位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001588.2:9423474位于7号染色体上第9423474位，其脱氧核苷酸为A或C；
CM001588.2:84941340位于7号染色体上第84941340位，其脱氧核苷酸为A或C；
CM001589.2:75561002位于8号染色体上第75561002位，其脱氧核苷酸为C或G；CM001590.2:56924859位于9号染色体上第56924859位，其脱氧核苷酸为A或G；CM001592.2:34421625位于11号染色体上第34421625位，其脱氧核苷酸为T或C；CM001592.2:53664048位于11号染色体上第53664048位，其脱氧核苷酸为A或G；CM001592.2:57058734位于11号染色体上第57058734位，其脱氧核苷酸为C或G；CM001593.2:1397868位于12号染色体上第1397868位，其脱氧核苷酸为A或G；CM001594.2:45477903位于13号染色体上第45477903位，其脱氧核苷酸为A或G；CM001594.2:80961940位于13号染色体上第80961940位，其脱氧核苷酸为A或C；CM001595.2:14087769位于14号染色体上第14087769位，其脱氧核苷酸为A或T；CM001595.2:43390933位于14号染色体上第43390933位，其脱氧核苷酸为A或G；CM001595.2:48968164位于14号染色体上第48968164位，其脱氧核苷酸为T或G；CM001598.2:45312379位于17号染色体上第45312379位，其脱氧核苷酸为T或C；CM001598.2:69009397位于17号染色体上第69009397位，其脱氧核苷酸为A或C；CM001600.2:45516740位于19号染色体上第45516740位，其脱氧核苷酸为A或C；CM001601.2:47737780位于20号染色体上第47737780位，其脱氧核苷酸为A或G；CM001602.2:49927473位于21号染色体上第49927473位，其脱氧核苷酸为T或C；CM001603.2:38707088位于22号染色体上第38707088位，其脱氧核苷酸为T或C；CM001603.2:46619514位于22号染色体上第46619514位，其脱氧核苷酸为A或G；CM001606.2:34435705位于25号染色体上第34435705位，其脱氧核苷酸为C或G；
表1、鉴别滩羊与非滩羊5分型位点基因型
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Figure SMS_2
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Figure SMS_5
注：各组中5个SNP位点的基因型均表示为X1X2_X3X4_X5X6_X7X8_X9X10，其中X1至X10均表示A或C或T或G，X1X2表示该组中第一个SNP位点处的核苷酸(如AA表示该SNP位点处的核苷酸为A的纯合型；如AT表示该SNP位点处的核苷酸为A和T的杂合型)，X3X4表示该组中第二个SNP位点处的核苷酸，……，X9X10表示该组中第五个SNP位点处的核苷酸。
实施例2、验证滩羊与非滩羊的5分型结果基因型
验证用样本：1000份滩羊和1000份非滩羊。
以验证用羊的血液或耳组织为样品，提取基因组DNA，然后进行Sequenom验证。
其中，Sequenom验证具体操作步骤如下：
1.引物设计
使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并交由生物公司合成。
2.DNA质检
待实验样本用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调整到50ng/μl，转移至96孔板，-20℃储存备用。
3.引物稀释
(1)每个SNP，有三条引物(表2)，将这三条引物的编号标记在引物合成管的管盖上。
表2、每个SNP的引物信息
Figure SMS_6
Figure SMS_7
(2)Forward PCR引物、Reverse PCR引物先离心空甩后加水，加水量与OD值相关(引物管和引物设计表均有标识)，每1OD加36μl水。加水后室温放置30min后震荡混匀备用。
(3)每个Well中多重SNP的Forward PCR引物、Reverse PCR引物混合时计算方法：每个SNP的Forward PCR引物、Reverse PCR引物各取2.5μl加水量(μl)＝500-重数*2.5*2(重数：well中SNP个数)
4.PCR扩增
PCR扩增采用多重PCR技术，在384孔板中进行，每个反应体系总体积为5μl。
(1)在一个新的2.0ml EP管中配制PCR master mix溶液，具体如表3所示。
表3、PCR master mix溶液
体积(μL)
10×PCR Buffer 0.5
MgCl2(25mM) 0.4
dNTP mix(25mM) 0.1
HotStar Taq(5U/μL) 0.2
水 1.8
PCR primer mix 1
总体积 4
(2)将配制好的PCR master mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为4μL，在384孔板的每个加样孔中加入PCR master mix液。该384孔板即为PCR反应板。
(3)取出已经制备好的DNA样品96孔板，使用8通道加样器，调节加样体积为1μL，加至相对应的384PCR反应板，贴上封口膜，震荡混匀后空甩。
(4)在兼容384孔板的PCR仪上设定PCR反应条件如表4所示。
表4、PCR反应条件
Figure SMS_8
5.PCR产物碱性磷酸酶处理
(1)在PCR反应结束后，384反应板取出并空甩。
(2)配制碱性磷酸酶处理反应液，SAP Mix，具体如表5所示。
表5、碱性磷酸酶处理反应液SAP Mix
SAP Mix 对每个反应(μL)
水 1.53
SAP Buffer(10x) 0.17
SAP酶(1.7U/ul) 0.3
总体积 2
(3)将配制好的SAP mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为2μL，将SAP Mix加入384孔PCR反应板。贴上封口膜，震荡混匀后空甩。反应体系总体积为7μl(其中PCR产物5μl，SAP混合液2μl)。
(4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件如表6所示。
表6、PCR反应条件
温度(℃) 时间(分钟) 循环
37 40 1
85 5 1
4 ∞ 1
启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理反应。
6.单碱基延伸
(1)在碱性磷酸酶处理结束后，将384反应板取出后空甩，在进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。
(2)配制单碱基延伸反应液，EXTEND Mix，如表7所示。(注意：Extend primer Mix与Well数一定要对应正确)
表7、单碱基延伸反应液EXTEND Mix
EXTEND Mix 对每个反应(μL)
Water 0.619
Extend primer Mix 0.94
iPLEX Buffer plus 0.2
iPLEX terminator 0.2
iPLEX enzyme 0.041
总体积 2
(3)将配制好的EXTEND mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用，使用8通道加样器，调节加样体积为2μL，将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7μl及EXTEND Mix液2μl，总体系9ul。
(4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件，如表8所示。
表8、PCR反应条件
Figure SMS_9
启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
7.树脂纯化
将反应产物加16μl水进行稀释，稀释后使用树脂进行脱盐。
8.芯片点样
将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。
9.质谱检测
上机进行质谱检测，并收集数据。
结果显示，该方法的鉴定率在85％以上(表示：100只待测羊按照该方法进行鉴定，有85只以上能够鉴定出结果)，具体如表9所示。滩羊和非滩羊表1中所示的SNP位点组合基因型均在表1的所示的相应基因型范围之内，其比例详见表10。
表9、本发明方法的鉴定率
SNP位点组合 非滩羊鉴定率 滩羊鉴定率
组1 85％ 89％
组2 87％ 91％
组3 88％ 90％
组4 86％ 90％
组5 87％ 90％
组6 88％ 91％
组7 86％ 88％
组8 87％ 93％
组9 86％ 87％
组10 86％ 89％
组11 88％ 89％
表10滩羊与非滩羊Sequenom SNP检测结果(5分型位点基因型所占比例)
Figure SMS_10
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Figure SMS_11
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Figure SMS_12
注：表中的基因型表示方法同表1。
表9所示结果表明实施例1所得的表1所示的验证滩羊与非滩羊的5分型结果基因型准确可靠。本发明成功获得用于鉴定滩羊与非滩羊的SNP位点组合，为今后滩羊的鉴定、保种、以及遗传育种提供支撑。

Claims (8)

1.一种基于基因分型鉴定滩羊与非滩羊的方法，包括如下步骤：检测待测羊的基因组中如下(a3)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；然后按照如下确定所述待测羊是否为滩羊：如果所述待测羊的基因型符合如下(b3)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊；如果所述待测羊的基因型符合如下(b3)中的非滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为非滩羊；
(a3)含有5个SNP位点，分别为CM001582.2:86006851、CM001583.2:42344562、CM001584.2:11650210、CM001584.2:12200323和CM001588.2:9423474；
其中，各SNP位点的物理位置是基于滩羊全基因组标准序列比对确定的，所述滩羊全基因组标准序列的版本号为Ovis.Aries V4.0；
CM001582.2:86006851位于1号染色体上第86006851位，其脱氧核苷酸为G或T；
CM001583.2:42344562位于2号染色体上第42344562位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001584.2:11650210位于3号染色体上第11650210位，其脱氧核苷酸为T或C；
CM001584.2:12200323位于3号染色体上第12200323位，其脱氧核苷酸为C或G；
CM001588.2:9423474位于7号染色体上第9423474位，其脱氧核苷酸为A或C；
(b3)非滩羊标准基因型为如下任一：TT_TC_TT_CG_AC；TT_TT_TT_GG_AC；TT_TC_TT_GG_CC；TT_CC_CT_GG_CC；TT_TT_CT_GG_CC；TT_TT_TT_GG_CC；TT_CC_TT_GG_CC；TT_TT_TT_CG_CC；TT_TC_CT_GG_CC；TT_TC_TT_CG_CC；TT_TC_TT_GG_AC；GT_TT_TT_GG_CC；滩羊标准基因型为如下任一：TT_CC_CT_CG_CC；TT_TC_CC_GG_CC；TT_TT_CT_CC_CC；GT_CC_CT_CG_AC；GG_CC_TT_GG_AC；GT_CC_TT_GG_CC；TT_CC_TT_CG_AC；GG_TT_CC_CC_AA；TT_CC_CT_GG_AC；TT_CC_CC_CG_AA；GT_CC_CT_CG_CC。
2.一种基于基因分型鉴定滩羊的方法，包括如下步骤：检测待测羊的基因组中权利要求1中所述(a3)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸，确定所述待测羊的基因型；如果所述待测羊的基因型符合权利要求1中所述(b3)中的滩羊标准基因型，则所述待测羊为或候选为滩羊。
3.用于检测羊基因组中权利要求1中所述(a3)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸的物质鉴定滩羊和/或非滩羊中的应用，或者在制备用于鉴定滩羊和/或非滩羊的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述物质为针对待检测SNP位点所设计的PCR引物和/或测序引物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：用于检测所述CM001582.2:86006851的引物为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示两条单链DNA；
用于检测所述CM001583.2:42344562的引物为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示两条单链DNA；
用于检测所述CM001584.2:11650210的引物为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示两条单链DNA；
用于检测所述CM001584.2:12200323的引物为SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示两条单链DNA；
用于检测所述CM001588.2:9423474的引物为SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示两条单链DNA。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：用于检测所述CM001582.2:86006851的引物还包括SEQ ID No.3所示的单链DNA；
用于检测所述CM001583.2:42344562的引物还包括SEQ ID No.6所示的单链DNA；
用于检测所述CM001584.2:11650210的引物还包括SEQ ID No.9所示的单链DNA；
用于检测所述CM001584.2:12200323的引物还包括SEQ ID No.12所示的单链DNA；
用于检测所述CM001588.2:9423474的引物还包括SEQ ID No.27所示的单链DNA。
7.用于检测羊基因组中权利要求1中所述(a3)所示的SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸的成套引物；
用于检测各SNP位点的引物如权利要求5或6中所述。
8.羊基因组中权利要求1中所述(a3)所示SNP位点组合中各SNP位点处的核苷酸的多态性在鉴定滩羊和/或非滩羊的中的应用。
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