CN116137894A - 用于确定早产风险的方法 - Google Patents

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拉姆库马尔·梅农
里普达曼·辛格
帕尔·舍尔德·詹森
英加·巴施·克里斯滕森
洛特·哈特
卡塔琳娜·基勒里奇·拉文
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University of Texas System
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Abstract

本发明包括一种基于孕妇血液样本中特异性羊膜和/或绒毛膜细胞的存在和/或增加量来确定早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加的方法。

Description

用于确定早产风险的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年6月10日提交的美国临时申请No.63/037,212的权益，将其全部内容作为参考纳入本文。
技术领域
本发明涉及一种基于孕妇血液样本中特异性羊膜和/或绒毛膜细胞的存在和/或增加量来确定早产、相关临床状况、早产、和/或相关临床状况的风险增加的方法。
联邦资助研究的声明
无。
背景技术
在不限制本发明范围的情况下，其背景是结合早产(PTB)来描述的。
早产，也称为未成熟生产，指婴儿在胎龄37+0周前出生。婴儿至少有50％存活机会的最早胎龄称为生存极限。随着早产儿的护理得到改善，存活极限已降至约24周胎龄。然而，早产与婴儿残疾风险的显著增加是相关的，风险越高，胎龄越低。因此，尽可能地推迟/防止孕妇在早产风险增加的情况下生产/分娩是非常重要的。
早产的确切原因很难确定，可能是多因素的。已被确定为增加早产风险的危险因素包括：糖尿病、高血压、怀孕一个以上婴儿、肥胖或体重不足、一些阴道感染、吸烟和心理压力等。
与早产相关的并发症包括脑瘫、发育迟缓、听力问题和视力问题等。在正常的人类胎儿中，一些器官系统在34至37孕周之间成熟，胎儿在这一时期结束时达到充分成熟。受早产影响较大的主要器官之一是肺。肺是在子宫中最后成熟的器官之一，正因为如此，许多早产婴儿在其生命的最初几天和几周都是靠呼吸机度过的。胎龄37周附近出生的早产儿，如果他们的肺已经发育出足够的表面活性剂，使肺在呼吸之间保持扩张，则通常不会有与早产有关的问题。早产的后遗症可以通过使用药物加速胎儿的成熟而在较小程度上减少，然而通过推迟分娩或完全防止早产，可以在更大程度上使其减少。在这方面，至关重要的是能够识别早产风险(增加)的孕妇，以便能够提供治疗。
一项此类专利是授予Lo等人的美国专利No.10,240,199，标题为“通过大规模并行RNA测序进行母体血浆转录组分析”。人们认为这些发明人教导了用于诊断妊娠相关疾病、确定等位基因比率、确定母体或胎儿对循环转录的贡献、和/或使用来自怀孕女性受试者的样本来识别母体或胎儿标志物、以及使用基因来诊断怀孕女性受试者中的妊娠相关疾病的方法。
另一项此类专利是授予Taylor等人的美国专利No.9,417,249，标题为“用于预测和降低早产风险的方法”。这些发明人被认为教导了用于预测孕妇受试者中的早产风险、用于识别早产风险增加的受试者的方法，用于选择参与临床研究的受试者以及用于降低受试者中的早产风险的方法。这些方法包括提供来自受试者的样本并检测以下一项或多项的水平：生长停滞特异性蛋白1(GASI)、来自4号染色体蛋白(AR4)/脆性X智力低下2(FMR2)家族成员3(AFF3)的ALLI融合基因、转甲状腺素蛋白(TTR)、雷诺丁(ryanodine)受体1(RYRI)、E26转化特异性变体6(ETV6)、claudin-10、锌指蛋白23(ZNF23)、XXVIIa1型胶原(COL27AI)、Kazrin亚型-1、角蛋白相关蛋白10-9(KRTAPIO-9)、亨廷顿蛋白(HTT)、微管相关蛋白9(MAP9)、含卷曲螺旋结构域蛋白13(CCD13)、肌醇己二磷酸和二磷酸肌醇五磷酸激酶亚型2(HISPPDI)、免疫球蛋白γ-3链C(IGHG3)、富含半胱氨酸和组氨酸的蛋白1(CYHRI)和XP002348181。
然而，尽管取得了这些进展，仍需要强有力的方法和标志物用于识别怀孕期间可能出现并发症的患者。
发明内容
本发明涉及上述识别早产风险增加的孕妇的重要问题。这对于推迟分娩或预防早产，或提供所需的专门护理以限制早产相关并发症是至关重要的。
羊膜绒毛膜在妊娠和分娩期间起着重要作用。胎膜微破裂是导致人类分娩的过程之一。本发明人出人意料地发现，在早产风险增加或有早产或胎膜早破的孕妇血液中的特定羊膜和/或绒毛膜细胞之间存在相关性。胎膜中的微破裂可导致来自这些膜的细胞侵入母体血液。因此，早期检测母体血液中的这些细胞可以用于识别有早产风险的妊娠。
基于这一发现，本发明人开发了一种基于所述孕妇血液样本中所述羊膜和/或绒毛膜细胞的存在和/或增加量来确定早产或早产风险增加的方法。
在一种实施方式中，本发明包括一种确定早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供从孕妇分离的血液样本或其部分，和(b)确定该血液样本或其部分中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在或特征；其中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在或特征表指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。在一个方面，通过检测一种或多种特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物来确定羊膜和/或绒毛膜细胞的存在。在另一方面，特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中与从孕妇分离的血液样本或其部分相比存在表达差异。在另一方面，该羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差异为至少5，至少10或至少15。在另一个方面，该方法包括步骤：a)提供从孕妇分离的血液样本或其部分，(b)使该样品与(i)针对羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的配体或(ii)包括与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补的至少10个连续核苷酸的杂交探针接触；和(c)检测(a)的血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物；其中羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的存在指示孕妇早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。在另一方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、IGFPB3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2、GPX8、MUC16、KRT5、TSPAN1、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1FN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、KRT17、PDLIM4、COL17A1、DKK3、PLS3、DPYSL3、TPPP3、SHROOM3、THY1、DCN、DIO2、IGFBP2、SPARCL1、NNMT、LPHN3、PEG3、FLT1、NPR3、AOC1、ITGB8、RXFP1、SPOCK1、CYP11A1、COL4A2、CNR1、SEMA3A、SERPINE1、IL1R1、FBLN1、UCHL1、RAI2、TGM2、PRLR、FSTL3、BCAR1、THSD4、FERMT2、PKP2、P4HA2、TEAD1和AQPEP。在另一方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自MUC16、UPK1B、EMP1、PVRL4、THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR1、PRLR、IGF2、IGFBP3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2和GPX8。在另一方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自MUC16、UPK1B、EMP1、PVRL4、THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR1和PRLR。在另一方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自MUC16、UPK1B、EMP1和PVRL4。在另一方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR1和PRLR。在另一方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、IGFBP3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2和GPX8。在另一方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自MUC16、UPK1B、EMP1、GPX8、FLT1/VEGFR1、RXFP1、CNR1和PRLR。在另一方面，该方法进一步包括检测上皮细胞标志物，例如选自CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK9、CK10、CK12、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18和CK19的标志物。在另一方面，该方法进一步包括检测母体标志物，例如选自CD14和CD45的标志物。在另一方面，该方法进一步包括检测间质标志物，例如选自至少一种波形蛋白的标志物。另一方面，与早产相关的临床状况是先兆子痫。在另一方面，该方法进一步包括：确定血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量，并将该羊膜和/或绒毛膜细胞的量与对照进行比较；其中所述血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量高于对照中的量指示该孕妇早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。在另一方面，对照中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量是一个预先确定的值。在另一方面，该方法进一步包括：确定血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量，并将该羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量与对照进行比较；其中所述血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量高于对照中的量指示该孕妇早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。在另一方面，对照中羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量是一个预先确定的值。在另一方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是在蛋白质水平和/或RNA水平上检测的。在另一方面，血液样本是从妊娠20周后的孕妇中分离。在另一方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物存在于细胞膜和/或细胞内。在另一方面，来自孕妇的血液样本是全血。在另一方面，其中向孕妇提供治疗，以最大限度地减少早产的风险或改善早产的后果，例如让该个体住院治疗。
在另一种实施方式中，本发明包括一种用于识别从孕妇获得的血液样本中的胎儿标志物的检测，包括：从孕妇获得血液样本；以及确定血液样本或其部分中羊膜和/或绒毛膜细胞中的一种或多种生物标志物的存在，所述标志物选自IGF2、IGFPB3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2、GPX8、MUC16、KRT5、TSPAN1、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、FN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、KRT17、PDLIM4、COL17A1、DKK3、PLS3、DPYSL3、TPPP3、SHROOM3、THY1、DCN、DIO2、IGFBP2、SPARCL1、NNMT、LPHN3、PEG3、FLT1、NPR3、AOC1、ITGB8、RXFP1、SPOCK1、CYP11A1、COL4A2、CNR1、SEMA3A、SERPINE1、IL1R1、FBLN1、UCHL1、RAI2、TGM2、PRLR、FSTL3、BCAR1、THSD4、FERMT2、PKP2、P4HA2、TEAD1或AQPEP。在另一种实施方式中，本发明包括一种用于识别从孕妇获得的血液样本中的胎儿标志物的检测，包括：确定从孕妇获得的血液样本中羊膜和/或绒毛膜细胞中的一种或多种生物标志物的存在，其中该一种或多种生物标志物选自IGF2、IGFPB3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2、GPX8、MUC16、KRT5、TSPAN1、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、FN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、KRT17、PDLIM4、COL17A1、DKK3、PLS3、DPYSL3、TPPP3、SHROOM3、THY1、DCN、DIO2、IGFBP2、SPARCL1、NNMT、LPHN3、PEG3、FLT1、NPR3、AOC1、ITGB8、RXFP1、SPOCK1、CYP11A1、COL4A2、CNR1、SEMA3A、SERPINE1、IL1R1、FBLN1、UCHL1、RAI2、TGM2、PRLR、FSTL3、BCAR1、THSD4、FERMT2、PKP2、P4HA2、TEAD1或AQPEP。在一个方面，羊膜和/或绒毛膜细胞的存在指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
在另一种实施方式中，本发明包括一种识别怀孕期间需要减少体力活动和/或卧床休息的患者的方法，包括：进行检测用于识别从患者获得的血液样本中的胎儿标志物，其包括：从患者获得血液样本；确定血液样本或其部分中羊膜和/或绒毛膜细胞中一种或多种生物标志物的存在，该生物标志物选自IGF2、IGFPB3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2、GPX8、MUC16、KRT5、TSPAN1、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、FN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、KRT17、PDLIM4、COL17A1、DKK3、PLS3、DPYSL3、TPPP3、SHROOM3、THY1、DCN、DIO2、IGFBP2、SPARCL1、NNMT、LPHN3、PEG3、FLT1、NPR3、AOC1、ITGB8、RXFP1、SPOCK1、CYP11A1、COL4A2、CNR1、SEMA3A、SERPINE1、IL1R1、FBLN1、UCHL1、RAI2、TGM2、PRLR、FSTL3、BCAR1、THSD4、FERMT2、PKP2、P4HA2、TEAD1或AQPEP，其中带有一种或多种生物标志物的羊膜和/或绒毛膜细胞的存在指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加；以及指导该病人减少体力活动和/或卧床休息。在另一种实施方式中，本发明包括一种识别怀孕期间需要减少体力活动和/或卧床休息的患者的方法，包括：进行检测用于识别从患者获得的血液样本中的胎儿标志物，包括：确定从患者获得的血液样本中一种或多种生物标志物的存在，其中该一种或多种生物标志物选自IGF2、IGFPB3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2、GPX8、MUC16、KRT5、TSPAN1、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、FN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、KRT17、PDLIM4、COL17A1、DKK3、PLS3、DPYSL3、TPPP3、SHROOM3、THY1、DCN、DIO2、IGFBP2、SPARCL1、NNMT、LPHN3、PEG3、FLT1、NPR3、AOC1、ITGB8、RXFP1、SPOCK1、CYP11A1、COL4A2、CNR1、SEMA3A、SERPINE1、IL1R1、FBLN1、UCHL1、RAI2、TGM2、PRLR、FSTL3、BCAR1、THSD4、FERMT2、PKP2、P4HA2、TEAD1或AQPEP，在血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞中，其中带有一种或多种生物标志物的羊膜和/或绒毛膜细胞的存在指示该孕妇早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加；以及指导该病人减少体力活动和/或卧床休息。在一个方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是在蛋白质水平和/或RNA水平上检测的。在另一方面，血液样本分离自妊娠20周后的孕妇。在另一方面，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物存在于细胞膜中。在另一方面，来自孕妇的血液样本是全血。
一种试剂盒，包括一种或多种试剂，用于检测血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、49、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63种或表1中的所有标志物。
附图简要说明
为了更全面地理解本发明的特点和优点，现参考本发明的具体实施方式以及附图，其中：
图1概述了本发明从母体血液样本中分离胎膜细胞的步骤。
图2A显示了使用胎膜细胞特异性抗体在母体血液中识别的胎膜候选细胞。图2B显示了通过X-YFISH确认的相同细胞。
图3A和3B显示了人原代羊膜上皮细胞(AEC)中膜特异性标志物的表达。免疫染色显示AEC共表达上皮标志物细胞角蛋白-18和间质标志物波形蛋白，而“膜”标志物则见于细胞和核膜与细胞质上。图3A以绿色显示AEC表达了所有三种膜特异性标志物，图3B以红色显示另外五种膜标志物。荧光图像是在20X拍摄的。这些图显示了三个独立实验的一个代表性图像。
图4显示了人原代绒毛膜滋养层(CTC)中膜特异性标志物的表达。免疫染色显示CTC主要表达上皮标志物细胞角蛋白-18(绿色)，而非间质标志物波形蛋白，而“膜”标志物显示为红色。荧光显微镜显示CTC表达了所有八种膜特异性标志物。荧光图像是在20X拍摄的。蓝色—DAPI、红色—感兴趣的绒毛膜标志物、黄色—波形蛋白，以及绿色—细胞角蛋白-18。该图显示了三个独立实验的一个代表性图像。
具体实施方式
虽然下文详细讨论了本发明各种实施方式的实施和应用，但应该理解的是，本发明提供了许多适用的发明概念，其可以体现于各种各样具体的环境中。这里讨论的具体实施方式只是说明了实施和应用本发明的具体方法，并不限定本发明的范围。
为了便于理解本发明，下文对一些术语进行了定义。本文定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员普遍理解的含义。诸如“一”、“一个”和“该”等术语并非仅指单数实体，而是包括可用于示例说明的具体实例的一般类别。本文的术语被用来描述本发明的具体实施方式，但它们的使用并不限制本发明，权利要求书中所概述的除外。
本发明涉及一种从孕妇的血液样本中确定/预测早产或早产风险增加的方法。该方法依赖于这样的发现：可通过特异性细胞标志物来检测的限定的羊膜和/或绒毛膜细胞，在即将分娩的孕妇血液中存在的量增加。因此，这些细胞的存在作为早产以及与早产相关的临床状况(如先兆子痫)的早期标志。
羊膜在妊娠和分娩过程中起主要作用，胎膜的微破裂是导致人类分娩的过程之一。本发明提供的确定早产及其风险的方法是基于这样的认识，即胎膜的破裂也会导致来自这些膜的细胞侵入母体血液中。因此，对母体血液中这些细胞的早期检测可用于识别有早产风险的妊娠。
本发明提供了一种重要的工具，用于识别此类早产风险增加的孕妇，从而允许对孕妇进行治疗，以最大限度地减少早产的风险降或改善早产的后果，例如让该个体住院治疗。
确定早产的方法。羊膜和/或绒毛膜细胞。
在一种实施方式中，提供了一种确定/预测早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加的方法，该方法包括步骤：(a)提供从孕妇分离的血液样本或其部分，和(b)确定血液样本或其部分中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在；其中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
在一种实施方式中，提供了一种确定/预测早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加的方法，该方法包括步骤：(a)确定孕妇或其部分血液样本中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在；其中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
在一种实施方式中，该方法进一步包括：(a)确定血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量，和(b)将羊膜和/或绒毛膜细胞的量与对照进行比较，其中血液样本或其部分中羊膜和/或绒毛膜细胞的量高于对照中的量指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
对照中羊膜和/或绒毛膜细胞的量可以是一个预先确定的值。在一种实施方式中，对照中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量是没有早产风险的孕妇血液中羊膜细胞和/或绒膜细胞的量。在一种实施方式中，对照中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量是基于一组没有早产风险的孕妇血液中羊膜细胞和/或绒毛膜细胞的平均量的预先确定的值。
如本文所用，术语“羊膜”指在胚胎最初形成时覆盖胚胎的膜。它进一步包含羊水，并为发育中的胚胎或胎儿提供保护环境。
如本文所用，术语“细胞标志物”指细胞表面标志物和细胞内标志物，它们是在细胞表面和细胞内表达的蛋白质，并作为特定细胞类型的标志物。细胞标志物在细胞间和细胞内的交流和识别中起着作用。这些细胞标志物对每一种细胞都是特异性的，因此可作为工具用于根据细胞膜上和细胞内存在的细胞标志物来识别细胞。
如本文所用，术语“绒毛膜”指围绕胚胎的最外层胎膜。绒毛膜由两层组成：外层由滋养层形成，内层由体细胞中胚层形成；内层与羊膜接触。
如本文所用，术语“杂交探针”指能够与编码给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因杂交的一种核酸序列。杂交探针包括与该基因互补的核苷酸。杂交探针可用报告染料进行标记。当杂交探针与基因杂交时，实现了血液样本中基因的识别。杂交探针可在DNA水平或RNA水平上检测基因。
如本文所用，短语“早产风险增加”指相对于正常的健康妊娠而言，在37周胎龄前分娩的风险增加的情况。例如，早产风险的增加指在37周胎龄前分娩的风险大于1％，例如大于10％。
如本文所用，术语“配体”指对给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物具有亲和力的化合物(例如小分子、蛋白质、核酸、适配体、肽、碳水化合物等)。配体，例如抗体，可包括一个可检测的标志物，例如报告染料、荧光体或酶。当配体与细胞标志物结合时，实现了对血液样本中细胞标志物的识别。
如本文所用，术语“log2倍差(folddifference)”指给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在两个样本之间的表达差异，以log2为单位。例如，如果第一样本中的量是第二样本中量的两倍，则log2倍差为1。同样地，log2倍差为10意味着第一样本的细胞标志物的量是第二样本的1024倍。
在一种实施方式中，从孕妇分离的血液样本或其部分中给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量与对照中的量之间的log2倍差为至少5，指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
在一种实施方式中，从孕妇分离的血液样本或其部分中给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量与对照中的量之间的log2倍差为至少8，指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
在一种实施方式中，从孕妇分离的血液样本或其部分中给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量与对照中的量之间的log2倍差为至少10，指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
在一种实施方式中，从孕妇分离的血液样本或其部分中给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量与对照中的量之间的log2倍差为至少11，指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
在一种实施方式中，从孕妇分离的血液样本或其部分中给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量与对照中的量之间的log2倍差为至少12，指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
在一种实施方式中，从孕妇分离的血液样本或其部分中给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量与对照中的量之间的log2倍差为至少15，指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
如本文所用，短语“天然存在的抗体”指能够识别和结合抗原的异源四聚体糖蛋白，包括通过二硫键相互连接的两个相同的重链(H)和两个相同的轻链(L)。每个重链包括一个重链可变区(本文缩写为VH)和一个重链恒定区(本文缩写为CH)。每个轻链包括一个轻链可变区(本文缩写为VL)和一个轻链恒定区(本文缩写为CL)。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，中间散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。抗体可包括几个相同的异源四聚体。抗体也可通过免疫适宜的动物如小鼠、大鼠、山羊、兔、马等来产生。
如本文所用，术语“早产”指未成熟生产，通常指在37周胎龄前出生的婴儿。
羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞的存在是通过检测一种或多种特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物来确定的。特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中与从孕妇分离的血液样本或其部分相比存在表达差异。
在一种实施方式中，提供了一种确定早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加的方法，该方法包括步骤：(a)提供从孕妇分离的血液样本或其部分；(b)使该样本与i)针对羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的配体或ii)包括与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补的至少10个连续核苷酸的杂交探针接触；和(c)检测a)的血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物；其中羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的存在指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
在一种实施方式中，提供了一种确定早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加的方法，所述方法包括步骤：(a)使来自孕妇的样本或其部分与i)针对羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的配体或ii)包括与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补的至少10个连续核苷酸的杂交探针接触；和(c)检测a)的血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物；其中羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的存在指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
在一种实施方式中，该方法进一步包括：(a)确定血液样本或其部分中羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量；和(b)将羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量与对照进行比较，其中血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量高于对照中的量指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
对照中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量可以是一个预先确定的值。在一种实施方式中，对照中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量是没有早产风险的孕妇血液中的羊膜或绒毛细胞标志物的量。在一种实施方式中，对照中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量是基于一组没有早产风险的孕妇的血液中羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的平均量的一个预先确定的值。
在一种实施方式中，该方法包括在蛋白质水平，(DNA水平)和/或RNA水平检测一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
标志物的检测
在一种实施方式中，该方法还包括检测上皮标志物，例如选自CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK9、CK10、CK12、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18、CK19的标志物。本领域技术人员知晓，“CK”和“KRT”可互换地用于相同的蛋白质。因此，在一种优选的实施方式中，上皮细胞标志物是选自表1和/或表2的KRT。
在另一种实施方式中，该方法进一步包括检测母体标志物，例如选自CD14和CD45的标志物。母体标志物可用于阴性选择源自母体的细胞，存在于白细胞上的造血标志物尤其适用于此目的。在另一种实施方式中，该方法进一步包括检测间质标志物，例如波形蛋白。
样本。在一种实施方式中，来自孕妇的血液样本是全血，即在确定羊膜和/或绒毛膜细胞的存在之前，血液没有经过任何分离。希望获得尽可能大的母体血液样本，以增加潜在的羊膜和/或绒毛膜细胞的总数。因此，在第一实施方式中描述的方法中步骤a的母体血液样本的大小优选在0.5至50ml的范围内，例如在1至40ml的范围，例如5至35ml或10至30ml。
所提供的血液样本优选地是在妊娠20+0周后从孕妇分离。因此，血液样本优选地是在妊娠20周后，如21+0后，如22+0后，如23+0后，如24+0后，如25+0后，如26+0后，如27+0，如28+0后，如29+0后，如30+0后，如31+0后，如32+0后，如33+0后，如34+0后，如35+0后，如36+0周后从孕妇分离。在一种优选的实施方式中，血液样本是在妊娠20+0和37+6周之间分离，例如在妊娠24+0和37+6周之间。
另外，根据本发明，所述样本可在该方法中的任何时候被稀释或浓缩。样本可通过加入等渗缓冲液，例如生理盐水、磷酸盐缓冲盐水、PBS和/或适宜的生长介质，例如基础介质和组织生长介质，稀释至少1.5倍，例如2倍，更优选至少3倍，例如5倍。一个方法步骤可包括通过添加为特定方法步骤分配的各种组分来稀释样本。
为了实施该方法，不同的方法步骤可能是有利的，例如，浓缩样本，例如，在不去除任何细胞的情况下减少体积。样本体积可减小到小于原始样本体积的80％，例如70％，或60％或50％，或甚至优选地减小到小于原始样本体积的40％，例如25％。浓缩步骤可以是离心。本发明的方法可包括一个或多个浓缩步骤。离心是用于浓缩细胞的优选方法。为了避免细胞损伤，优选轻度离心，例如50-700XG离心10分钟。在一种实施方式中，血液样本是在妊娠20周后从孕妇分离。
检测和/或定量
在一种实施方式中，通过检测一种或多种特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物来确定羊膜和/或绒毛膜细胞的存在。在另一种实施方式中，在蛋白质水平检测一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。这可以通过使从孕妇分离的血液样本或其部分与针对羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的配体接触来实现。在另一种实施方式中，在RNA水平检测一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。这可以通过使从孕妇分离的血液样本或其部分与杂交探针接触来实现，杂交探针包含与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补的核苷酸。
针对羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的配体和/或包含与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补的核苷酸的杂交探针可包括一报告染料，从而允许检测和/或定量血液样本中的羊膜和//或绒毛细胞标志物蛋白或RNA。
从孕妇分离的血液样本或其部分中给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的存在，可在将配体和/或杂交探针与从孕妇分离的血液样本或其部分接触后，通过检测来自针对羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的配体和/或包括与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补的核苷酸的杂交探针的信号来确定。
因此，一种实施方式包括检测孕妇血液样本或其部分中的配体或杂交探针的存在。
检测可通过用报告染料，如荧光染料或其他适于检测的染料标记配体或杂交探针来实现。因此，该方法可以是荧光原位杂交(FISH)。如下所述，探针可包括淬灭剂以及荧光体或FRET对，这使得能够检测与它们的靶序列结合的杂交探针。可选地或另外地，通过一个或多个洗涤步骤将与其靶标相结合的探针与不结合的探针分开。
也可使用配体如抗体的免疫染色进行识别。还可以使用多色FISH、多色免疫染色、单核苷酸多态性(SNP)、简单序列重复(SSR)或短串联重复(STR)进行识别。例如，可同时使用具有不同荧光标签的不同杂交探针，或可同时使用两种(或更多种)具有不同荧光标签的不同抗体。
从孕妇分离的血液样本或其部分中给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量，可在将配体和/或杂交探针与从孕妇分离的血液样本或其部分接触后，通过定量来自针对羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的配体和/或包括与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补的核苷酸的杂交探针的信号来确定。
从孕妇分离的血液样本或其部分中给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量与对照中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的量之间的差异可表示为log2倍差。
羊膜和/或绒毛膜细胞标志物
本发明是基于这一发现：特定的羊膜和/或绒毛膜细胞在即将早产或早产风险增加的孕妇血液中存在和/或存在量增加。因此，羊膜和/或绒毛膜细胞可作为生物标志物，用于从孕妇的血液样本中确定早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。羊膜和/或绒毛膜细胞的存在可通过检测特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物来确定。
表1概述了可用于确定早产风险增加的孕妇血液中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在和/或量的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物列表。
表1.可用于确定孕妇血液中羊膜和/或绒毛膜细胞存在和/或量的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物
Figure BDA0004113671940000141
Figure BDA0004113671940000151
#在细胞膜上表达的标志物
∞羊膜和绒毛膜的共同标志物
表2.可用于本发明方法的其他标志物
Figure BDA0004113671940000152
Figure BDA0004113671940000161
在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自：IGF2、IGFPB3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2、GPX8、MUC16、KRT5、TSPAN1、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、FN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、KRT17、PDLIM4、COL17A1、DKK3、PLS3、DPYSL3、TPPP3、SHROOM3、THY1、DCN、DIO2、IGFBP2、SPARCL1、NNMT、LPHN3、PEG3、FLT1、NPR3、AOC1、ITGB8、RXFP1、SPOCK1、CYP11A1、COL4A2、CNR1、SEMA3A、SERPINE1、IL1R1、FBLN1、UCHL1、RAI2、TGM2、PRLR、FSTL3、BCAR1、THSD4、FERMT2、PKP2、P4HA2、TEAD1或AQPEP。
在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、MUC16、THY1、DIO2、UPK1B、LPHN3、EMP1、FLT1、GPX8、PVRL4、NPR3、RXFP1、CNR1、PRTG、PRLR、PRTG。这些标志物在细胞膜上表达，因此是使用本领域技术人员已知的技术(例如磁活化细胞分选)富集胎膜细胞的良好候选物。
在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是在羊膜细胞中选出。羊膜细胞的优选标志物是MUC16、UPK1B和EMP1。
在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是在绒毛膜细胞中选出。绒毛膜细胞的优选标志物是FLT1/VEGFR1、RXFP1、CNR1和PRLR。
在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自在绒毛膜细胞和羊膜细胞上表达但不在母体血细胞上表达的标志物。优选的此类标志物是IGF2、IGFBP3、SERPINB10、CRYAB、FBN1、GPX8、FBN1，KRT18、PRTG或COL1A2。特别优选的标志物是在细胞膜上表达，例如IGF2、GPX8和PRTG。
在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自羊膜和/或绒毛膜。在一种实施方式中，选自羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的细胞标志物的数量为：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、49、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或表1中的所有标志物。
在一种实施方式中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自MUC16、UPK1B、EMP1、PVRL4、THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR1、PRLR、IGF2、IGFBP3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2和GPX8。在一种实施方式中，按顺序选择羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
在一种实施方式中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自羊膜。因此，在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自：IGF2、MUC16、KRT5、TSPAN1、IGFBP3、SERPINB10、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、FN1、FBN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、CRYAB、KRT17、KRT18、PDLIM4、COL17A1、PRTG、DKK3、PLS3、COL1A2、GPX8、DPYSL3、TPPP3和SHROOM3。在一种实施方式中，按顺序选择羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
在一种实施方式中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自绒毛膜。因此，在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自：IGF2、THY1、DCN、DIO2、IGFBP3、IGFBP2、SPARCL1、NNMT、LPHN3、CRYAB、PEG3、FLT1、GPX8、FBN1、NPR3、AOC1、ITGB8、RXFP1、SPOCK1、CYP11A1、COL4A2、KRT18、CNR1、SEMA3A、SERPINE1、IL1R1、FBLN1、COL1A2、UCHL1、RAI2、TGM2、PRLR、FSTL3、SERPINB10、BCAR1、THSD4、PRTG、FERMT2、PKP2、P4HA2、TEAD1和AQPEP。在一种实施方式中，按顺序选择羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
在一种实施方式中，1、2、3、4、5、6、7、8或9种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自绒毛膜且源自羊膜。因此，在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自：IGF2、IGFBP3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2和GPX8。在一种实施方式中，按顺序选择羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
在一种实施方式中，1、2、3、4、5、6、7或8种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自绒毛膜且源自羊膜。因此，在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自MUC16、UPK1B、EMP1、GPX8、FLT1/VEGFR1、RXFP1、CNR1和PRLR。在一种实施方式中，按顺序选择羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
在一种实施方式中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物存在于细胞膜中。因此，在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自：IGF2、MUC16、UPK1B、EMP1、PVRL4、THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR1、PRLR、PRTG和GPX8。使用存在于细胞膜中的标志物的至少一个优点是，该标志物可具有一个可以从细胞外侧获得的细胞外表位。在一种实施方式中，按顺序选择羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
在一种实施方式中，1、2、3、4、5、6或7个羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自羊膜并且存在于细胞膜中。因此，在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自：IGF2、MUC16、UPK1B、EMP1、PVRL4、PRTG和GPX8。在一种实施方式中，按顺序选择羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
在一种实施方式中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自绒毛膜并且存在于细胞膜中。因此，在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自：IGF2、THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR1、PRLR、PRTG和GPX8。在一种实施方式中，按顺序选择羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
在一种实施方式中，1、2、3、4或5个羊膜和/或绒毛膜细胞标志物位于细胞内。因此，在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自：UCHL1、AHNAK2、PDLIM3、DPYSL3和PDLIM4。在一种实施方式中，按顺序选择羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
在一种实施方式中，1个羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自羊膜并且位于细胞内。因此，在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是UCHL1。
在一种实施方式中，1、2、3或4个羊膜和/或绒毛膜细胞标志物位于细胞内并且源自绒毛膜。因此，在一种实施方式中，一种或多种羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自：AHNAK2、PDLIM3、DPYSL3和PDLIM4。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的差异可表示为log2倍差。在一种实施方式中，基于log2倍差来选择标志物。在另一种实施方式中，基于log2倍差选择的标志物进一步根据存在于细胞膜中来选择。当选择适宜的标志物时，可选择能够结合细胞外表位的抗体。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差为至少15。因此，在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是IGF2。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差为至少12。因此，在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、MUC16、THY1和DCN。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自羊膜，并且羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差至少为12。因此，在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2和MUC16。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自绒毛膜，并且羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差为至少12。因此，在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、THY1和DCN。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差为至少11。因此，在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、MUC16、THY1、DCN、KRT5、TSPAN1、IGFBP3、SERPINB10、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、DIO2、IGFBP2和SPARCL1。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自羊膜，并且羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差为至少11。因此，在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、MUC16、KRT5、TSPAN1、IGFBP3、SERPINB10、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2和EMP1。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自绒毛膜，并且羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差为至少11。因此，在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、THY1、DCN、DIO2、IGFBP3、IGFBP2和SPARCL1。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自羊膜，并且羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差为至少10。因此，在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、MUC16、THY1、DCN、KRT5、TSPAN1、IGFBP3、SERPINB10、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、DIO2、IGFBP2、SPARCL1、FN1、FBN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、CRYAB、KRT17、KRT18、PDLIM4、COL17A1、NNMT、LPHN3、PEG3和FLT1。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自羊膜，并且羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差为至少10。因此，在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、MUC16、KRT5、TSPAN1、IGFBP3、SERPINB10、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、FN1、FBN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、CRYAB、KRT17、KRT18、PDLIM4和COL17A1。
在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物源自绒毛膜，并且羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在从孕妇分离的血液样本或其部分中的表达相比，二者之间的log2倍差为至少10。因此，在一种实施方式中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、THY1、DCN、DIO2、IGFBP3、IGFBP2、SPARCL1、NNMT、LPHN3、CRYAB、PEG3和FLT1。
针对羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的配体
给定的羊膜和/或绒毛膜细胞的存在和/或量可通过检测一种或多种特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物来确定，所述标志物可通过用针对一种或多种羊膜和/和绒毛膜细胞标志物的配体处理从孕妇分离的血液样本或其部分来检测和/或定量。
使用配体来检测和/或定量给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物允许在蛋白质水平和/或RNA水平上检测羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
用于本发明方法的配体通常是抗体、肽或适配体。用于本发明方法的配体主要与感兴趣的细胞标志物结合，优选具有比与其他细胞标志物的结合更高的亲和力。因此，优选地该配体主要结合羊膜和/或绒毛膜细胞标志物。
该配体可以是适配体。适配体是基于核酸的高亲和力配体，其结合抗原例如蛋白质。它们通常使用体外进化技术来识别，如SELEX(通过指数富集进行配体的系统进化)。在SELEX中，来自初始文库中的核酸的迭代轮次筛选和扩增被用于识别高亲和力适配体。由于初始文库非常大(例如，1014个不同的序列)，并且序列可能在迭代轮次过程中发生突变，因此现在可以在常规基础上进行高亲和力适配体的识别，并且这类方法是本领域技术人员已知的。通常，适配体的长度小于50个核苷酸。
高亲和力的肽可用噬菌体展示产生。在噬菌体展示中，针对靶标筛选展示肽的噬菌体库，随后在类似于SELEX的进化过程中进行扩增。存在各种噬菌体展示系统，可选择肽的大小以满足特定需求。在一种实施方式中，用于本发明方法的肽的大小为小于50个氨基酸。
通常将文库显示为支架，例如抗体支架。因此，噬菌体展示可用于识别高亲和力抗体。用于抗体产生的其他体外进化技术包括mRNA展示、核糖体展示和共价DNA展示。
配体也可以是抗体。本发明的抗体是能够识别和结合抗原的多肽或蛋白质，抗原包含至少一个抗原结合位点。抗原结合位点优选包含至少一个互补决定区(CDR)。抗体可以是天然存在的抗体、天然存在的抗体的片段或合成抗体。
天然存在的抗体可以包括能够识别和结合抗原的异四聚体糖蛋白，并包含通过二硫键相互连接的两个相同重(H)链和两个相同轻(L)链。每个重链包括重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区(本文缩写为CH)。每个轻链包括轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区(本文简写为CL)。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，中间散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。抗体可包括几个相同的异四聚体。抗体也可通过免疫适宜的动物如小鼠、大鼠、山羊、兔、马等来产生。
用于本发明的抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。产生两种类型抗体的方法是本领域技术人员公知的。除了上述体外进化方法外，单克隆抗体通常使用杂交瘤技术制备。
杂交探针
通过用杂交探针处理从孕妇中分离的血液样本或其部分，可检测和/或定量给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的存在和/或量，该探针包括与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补的核苷酸。
杂交探针是具有能够与编码给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因杂交的序列的核酸。杂交探针包括与该基因互补的核苷酸。杂交探针可用报告染料进行标记。当杂交探针与基因杂交时，实现对血液样本中基因的识别。杂交探针可在RNA水平上检测基因。
杂交探针可按本领域的一般做法使用，通常为DNA或RNA，优选DNA。在优选的实施方式中，探针用非天然核苷酸修饰，以提高结合亲和力和/或结合特异性。这种非天然核苷酸的优选实例是LNA(锁核酸)、TINA(扭转嵌入性核酸)、PNA(肽核酸)、INA(嵌入性核酸)、吗啉和2’O-取代的RNA单体，如2’O-甲基RNA单体和2’O-(2-甲氧基乙基)RNA。
探针的长度可以是任何适宜的长度，例如在10至200个核苷酸的范围，优选在10至30个核苷酸，更优选15-25个核苷酸，并且优选地，探针与编码给定的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因充分互补。
在一种实施方式中，探针与编码表1中描述的任何蛋白质的基因至少85％互补，例如在探针长度上至少90％互补，例如至少95％互补。探针可以与编码蛋白质的mRNA互补。
在一种实施方式中，杂交探针包括至少10个连续核苷酸与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补。在一种实施方式中，杂交探针包括至少15个连续核苷酸与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补。在一种实施方式中，杂交探针包括至少20个连续核苷酸与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补。
报告染料。
本发明要使用的杂交探针和配体可包括或优选地与报告染料连接。杂交探针或配体优选地与报告染料共价连接。该报告染料优选为荧光报告染料。优选地，报告染料选自FAMTM、TETTM、JOETM、VICTM、
Figure BDA0004113671940000231
Green、6FAM、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、德克萨斯红、罗丹明、罗丹明绿、罗丹明红、6-羧基罗丹明6G、AlexaFluor、OregonGreen488、OregonGreen500和/或OregonGreen514。
在一种实施方式中，杂交探针还包括淬灭染料。在优选实施方式中，淬灭染料选自TAMRATM、BlackHoleQuencherTM、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、DDQI、DDQII和/或EclipseDarkQuencher。报告染料和淬灭染料的使用是可取的，因为它除了识别之外还可以进行各种类型的量化。
通常，报告染料和淬灭染料在杂交探针中相互靠近，使报告剂发出的光或激光诱导的荧光被淬灭染料所淬灭。当寡核苷酸与互补模板链结合时，报告剂染料和淬灭剂染料相互分离，使得淬灭剂不再淬灭报告剂的信号，即可以检测到杂交。
因此，在一种实施方式中，杂交探针能够形成一个茎环结构，其中淬灭剂和报告染料在茎中被带入靠近。在一种实施方式中，该寡核苷酸是一个所谓的分子信标。当分子信标碱基与模板链配对时，淬灭剂和报告剂就不再靠近了。因此，来自报告染料的激光诱导信号不再被淬灭。
可使用包括供体荧光体和受体荧光体的所谓FRET(荧光共振能量转移)对，代替使用报告染料和淬灭剂染料。当供体荧光体被外部光源激发时，它发出某一波长的光，从而激发受体荧光体，受体荧光体又发出可以被检测和测量的不同波长的光。只有当供体荧光体和受体荧光体靠近时，能量才会从供体转移到受体。
FRET对的实例包括：BFP-YFP、CFP-YFP、GFP-DsRed、GFP-Cy3、GFP-mOrange、YFP-RFP、FAM-ROX、FAM-Cy5、FAM-Hex、FAM-TAMRA、和/或Cy3-Cy5.
羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的检测和/或定量以及诊断。
优选地，本发明的方法可用于从孕妇的血液样本中预测早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
早产和/或早产风险增加的早期预测是非常重要的，以便为孕妇提供治疗，尽可能地推迟分娩，或准备为早产婴儿提供广泛的护理。
因此，在一种实施方式中，向被确定为即将早产或早产风险增加的孕妇提供治疗，以最大限度地减少早产的风险或改善早产的后果，例如让该个体住院治疗。
与早产或早产风险增加有关的临床状况
早产和早产风险增加可能伴随着相关的临床症状。因此，识别即将早产或早产风险增加的孕妇对于治疗这种相关的临床状况是非常重要的。在一种实施方式中，与早产相关的临床状况是先兆子痫。
实施例1
对从RamkumarMenon博士的实验室收到的绒毛膜和羊膜的快速冷冻组织进行了RNA测序，对基因转录物进行量化，以找到在这些膜的细胞中与母体血细胞相比存在表达差异的基因。简而言之，使用RNeasyUCP试剂盒(Qiagen)提取RNA，在Nanodrop上进行量化，并在Agilent生物分析仪上检查其完整性。RNA测序由位于德国希尔顿的Qiagen/Exiqon公司使用IlluminaTruSeq链式总RNA文库制备试剂盒进行。产生了一个差异表达的基因列表。表1中可以看到识别的标志物。有31个基因在羊膜上过度表达，其中7个基因在细胞膜上表达。然而，有42个基因在绒毛膜中过度表达，其中有11个是在细胞膜上。这15个在细胞膜上表达的基因(GPX8、PRTG和IGF2是羊膜和绒毛膜之间共有的)是使用ARCEDI技术从母体血液中分离羊膜和绒毛膜细胞时作为生物标志物使用的初始靶标。
胎膜细胞标志物的识别。对从正常分娩(非临产)收集的胎膜细胞进行RNAseq分析。将这些细胞中的与母体血细胞存在表达差异的标志物用于从母体血中富集胎膜细胞。
实施例2
本发明人确定了脱落的羊膜细胞是否可以通过组织层(微破裂)或通过胎儿-母体循环到达母体一侧，并且这些细胞可以在母体血液中被识别，作为胎膜生理和功能的标志物。
从母体血液中富集胎膜细胞的方法可以包括，例如美国专利No.9,429,520和国际专利公开号No.WO2012/062325中所教导的方法，这些方法的相关部分通过参考纳入本文。简而言之，该方法可以包括固定母体血液样本中的细胞，这大大增加了母体血液样本中胎儿细胞的稳定性，同时允许富集和识别胎儿细胞。
血液采样。从孕龄36+周的孕妇和孕龄10-14周的孕妇获得30mL的外周血样本。所有血液样本都收集在Streck管中，并在收集后4小时内进行处理。通过使用Y染色体特异性基因对游离的胎儿DNA进行实时PCR来确定胎儿的性别。
全血固定和红细胞裂解。血液样本在抽取后15分钟内在含2％甲醛的PBS中固定。裂解红细胞后，用先前报道的方法收获有核细胞。
通过磁激活细胞分选(MACS)富集胎膜细胞。胎膜细胞的富集是使用9种不同的初级抗体，针对胎膜细胞中的8种不同的标志物，根据制造商的基本方案稍作修改后合并在一起进行。标志物和针对这些标志物的抗体的使用如实施例3所示。细胞悬液与抗体孵育30分钟，用14mL的磁激活细胞分选(MACS)缓冲液(4℃)洗涤两次，通过离心回收，并重新悬浮在MACS缓冲液中。
从母体血液样本中识别胎膜细胞的方法如图1所示。血液样本取自孕妇。对全血样本(如30ml)进行处理以识别细胞和细胞碎片。然后对这些细胞和细胞碎片进行染色，以获得本文教导的细胞标志物。然后对胎儿细胞进行扫描和识别。最后，在扫描和验证后识别胎膜细胞候选物。
从3名孕龄在36+的孕妇中通过MACS富集了三十六个羊膜/绒毛膜细胞，并通过抗角蛋白抗体染色对3名怀有足月男胎的孕妇的血液样本进行了表征(图2A)。胎儿性别通过FISH确认(图2B)。FISH是用X和Y染色体特异性探针进行的。胎膜细胞富集和识别的结果如表3中所示。
表3妊娠36+周孕妇中识别的胎膜细胞
Figure BDA0004113671940000251
Figure BDA0004113671940000261
#XY-FISH在这些细胞上失败
*未进行Y-扫描
从两名孕龄为10-14周的孕妇的富集样本中没有识别出羊膜/绒毛膜细胞(表4)。显示这些标志物只在胎膜细胞中表达，而不在其他类型的胎儿细胞(胎盘/滋养层细胞)中表达。数据显示妊娠后的10-14周没有胎膜细胞，意味着这些标志物不富集其他类型的胎儿细胞(胎盘/滋养层细胞)，而仅富集胎膜细胞。因此，这些标志物是研究与足月分娩和早期分娩(早产)相关条件的良好候选物。
表4妊娠10-14周孕妇的胎膜细胞富集
样本No. 膜候选细胞(FMCC)
2529 0
2530 0
将基于RNAseq分析选择的八个不同标志物用于从母体血液中富集胎膜细胞。使用一组CK抗体对这些标志物的细胞进行免疫荧光染色，以在胎膜细胞中对它们定位。羊膜上皮细胞的代表性染色图见图3A和3B，绒毛膜细胞见图4。
图3A和3B显示了人原代羊膜上皮细胞(AEC)中膜特异性标志物的表达。免疫染色显示AEC共表达上皮标志物细胞角蛋白-18和间质标志物波形蛋白，而“膜”标志物则见于细胞和核膜及细胞质上。图3A以绿色显示AEC表达所有三个膜特异性标志物，图3B以红色显示另外五个膜标志物。荧光图像是在20X拍摄。这些图显示了三个独立实验的一个代表性图像。
图4显示了人原代绒毛滋养层细胞(CTC)中膜特异性标志物的表达。免疫染色显示CTC主要表达上皮标志物细胞角蛋白-18(绿色)，但不表达间质标志物波形蛋白，而“膜”标志物以红色显示。荧光显微镜显示CTC表达所有八个膜特异性标志物。荧光图像是在20X拍摄。蓝色-DAPI，红色-感兴趣的绒毛膜标志物，黄色-波形蛋白，绿色-细胞角蛋白18。该图显示了三个独立实验的一个代表性图像。
实施例3.用于PTB识别的罕见循环胎儿细胞
接着，我们确定了使用那些被证明在胎膜细胞中与母体血细胞相比高度表达的标志物的抗体，从36+周GA的母体血液中富集循环胎儿细胞(CFC)是否可行。简而言之，从怀有男婴的孕妇采集30mL的血液。使用美国专利号No.9,429,520和国际专利公开号No.WO2012/062325中教导的方案处理血液样本，用于分离胎儿细胞。使用美国专利号No.9,429,520中教导的方案，使用9种抗体富集CFC，国际专利公开号No.WO2012/062325用于分离胎儿细胞。一些候选胎儿细胞的身份通过XYFISH确认。发现CFC特异性抗体可作为生物标志物用于PTB的(早期)检测。
表5抗体和标志物
抗体 公司
MUC16，小鼠 abcam ab1107
UPK1B，小鼠 sigmaaldrich WH0007348M2
EMP1，小鼠 abnova H00002012-A01
GPX8，小鼠 abnova H00493869-B01P
FLT1/VEGFR1，小鼠 abcam ab212369
RXFP1，小鼠 rndsystems mab8898
CNR1，小鼠 sigma wh0001268m1
PRLR，小鼠 abcam u5 ab2772
PRLR，小鼠 abcam t6 ab2773
研究发现，9种不同的抗体，其针对从妊娠后期(接近足月)采集的母体血液中富集的胎儿细胞中表达的8种不同标志物，可以用作检测孕妇血液中存在胎膜细胞的生物标志物的抗体。由于胎膜在分娩(足月或早产)期间变得脆弱，导致细胞脱落进入母体循环中，这些标志物可指示PTB。因此，研究表明，这8种生物标志物可指示(早期)PTB。
实施例4.从具有妊娠相关并发症的样本中分离罕见循环胎儿细胞
本发明人确定了在分娩时有以下情况之一的孕妇的血液中是否可以识别出脱落的羊膜细胞：胎膜早破(PPROM)、足月时人工胎膜破裂(AROM)和足月时剖腹产。接近足月妊娠(剖腹产或正常妊娠)中的胎膜变得脆弱，因此有细胞脱落进入母体循环。
从母体血液中富集胎膜细胞的方法可以包括，例如美国专利No.9,429,520和国际专利公开号No.WO2012/062325中所教导的方法，这些方法的相关部分通过参考纳入本文。简而言之，该方法可以包括固定母体血液样本中的细胞，这大大增加了母体血液样本中胎儿细胞的稳定性，同时允许富集和识别胎儿细胞。
血液采样。从孕妇获得外周血样本30mL。将所有血液样本收集在Streck试管中。
全血固定和红细胞裂解。血液样本在抽取后15分钟内在含2％甲醛的PBS中固定。裂解红细胞后，用先前报道的方法收获有核细胞。
通过磁激活细胞分选(MACS)富集胎膜细胞。胎膜细胞的富集是使用9种不同的初级抗体，针对胎膜细胞中的8种不同的标志物，根据制造商的基本方案稍作修改后合并在一起进行。细胞悬液与抗体孵育30分钟，用14mL的磁激活细胞分选(MACS)缓冲液(4℃)洗涤两次，通过离心回收，并重新悬浮在MACS缓冲液中。
富集后，使用CK抗体池对细胞进行免疫荧光染色。
最后，通过扫描和验证识别胎膜细胞候选物。
从两名患有PPROM的孕妇中，识别了12个胎膜细胞。一名足月的AROM妇女的样本没有富集任何胎儿细胞。来自足月剖腹产妇女的四个样本富集了15个胎儿细胞(表6)。实施例4的数据中显著的是PPROM样本(与剖腹产相比，其胎龄更早，能提供更多的细胞)。这只能发生在PPROM的胎膜与剖腹产样本相比更脆弱的情况下，因此表明孕妇血液中检测到胎儿细胞膜细胞指示胎膜过早破裂导致早产的情况。
表6患有PPROM、足月AROM和足月剖腹产的孕妇的胎膜细胞富集
Figure BDA0004113671940000281
Figure BDA0004113671940000291
可以设想，本说明书中讨论的任何实施方式可以在本发明的任何方法、试剂盒、试剂或组合物上实施，反之亦然。此外，本发明的组合物也可用于实现本发明的方法。
应当理解的是，本文描述的具体实施方式是以举例说明的方式显示，而不是对本发明的限制。在不脱离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以在各种实施方式中使用。本领域的技术人员将认识到或能够通过常规实验确定许多与本文所述特定程序等同的方法。这样的等同物被认为落入本发明的范围内，并被权利要求书所涵盖。
本说明书中提到的所有公开物和专利申请都表明了本发明所涉及的技术领域的技术人员的水平。所有的公开物和专利申请通过引用而被纳入本文，其程度相当于具体和单独指明将各个出版物或专利申请通过参考纳入本文。
在权利要求书和/或说明书中，当与术语“包括”一起使用时，词语“一”或“一个”可能意味着“一个”，但它也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或一个以上”的含义一致。权利要求书中使用的术语“或”表示“和/或”，除非明确指出仅指替代物，或替代物们相互排斥，不过本文支持仅指替代物和“和/或”的定义。在本申请中，术语“大约”用于表示一个数值包括设备的固有误差变化、用于确定该数值的方法、或研究对象之间存在的变化。
如本说明书和权利要求书中所用，词语“包括(comprising)”(和任何形式的包括，如“包含”和“含有”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，如“有”和“带有”)、“包括(including)”(和任何形式的包括，例如“包含”和“含有”)或“包含(containing)”(和任何形式的包含，如“包括”和“含有”)是包容性的或开放式的，不排除额外的，未提及的特征、元素、组件、群组、整体和/或步骤，但不排除存在其他未说明的特征、元素、组件、群组、整数和/或步骤。在本文提供的任何组合物和方法的实施方式中，“包括”可用“基本上由……组成”或“由……组成”替代。如本文所用，术语“包括”用于表示仅存在所提及的整体(例如，一个特征、元素、特性、属性、方法/过程步骤或限度)或一组整体(例如，多个特征、元素、特性、属性、方法/过程步骤或限度)。如本文所用，短语“基本上由……组成”需要指定的特征、元素、组件、群组、整体和/或步骤，但不排除存在其他未说明的特征、元素、组件、群组、整体和/或步骤，以及那些不会实质性地影响所要求保护的发明的基本和新颖的特征和/或功能的特征。
本文所用的术语“或其组合”指该术语前面所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”旨在包括以下至少一项：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，如果在特定情况下顺序很重要，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。熟练的技术人员会理解，通常情况下，任何组合中的项目或术语的数量都没有限制，除非从上下文中可以显而易见。
如本文所用，近似的词语，例如但不限于，“大约”、“基本的”或“实质上”是指一种条件，即当如此修饰时，应理解为不一定是绝对的或完美的，但对于本领域的普通技术人员来说，它将被视为足够接近，以保证该条件被定义为存在。该描述可变化的程度将取决于可以做出多大的改变，并且仍然可以让本领域的普通技术人员认识到修改后的特征仍然具有未修改的特征的必要特性和能力。一般来说，在遵守前述讨论的前提下，本文中被诸如“约”这样的近似词所修饰的数值可能与所述数值相差至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％。
根据本发明公开的内容，所有在此公开和要求保护的组合物和/或方法都可以在没有过度实验的情况下实施和执行。虽然本发明的组合物和方法已经以优选实施方式的形式进行了描述，但对于本领域的技术人员来说，显然可以在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，对本文所述的组合物和/或方法以及步骤或步骤顺序进行变化。对本领域技术人员来说，所有这些类似的替代物和修改都被认为属于所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和概念之内。
为了帮助专利局和根据本申请授予的任何专利的任何读者解释本文所附的权利要求，申请人希望指出的是，他们无意让所附的任何权利要求援引35U.S.C.§112的第6段、U.S.C.§112的(f)段或同等内容，因为它在本文件提交之日就已存在，除非在特定权利要求中明确使用了“用于……的手段”或“用于……的步骤”等字样。
对于每一项权利要求，只要先前的权利要求为某一权利要求的术语或要素提供了适当的前因基础，那么每一项从属权利要求既可以从属于独立权利要求，也可以从属于先前的每一项从属权利要求。
参考文献
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Claims (45)

1.一种用于识别从孕妇获得的血液样本中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的检测，包括：
从孕妇获得血液样本；和
确定该血液样本或其部分中羊膜和/或绒毛膜中的一种或多种生物标志物的存在，所述生物标志物选自IGF2、IGFPB3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2、GPX8、MUC16、KRT5、TSPAN1、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、FN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、KRT17、PDLIM4、COL17A1、DKK3、PLS3、DPYSL3、TPPP3、SHROOM3、THY1、DCN、DIO2、IGFBP2、SPARCL1、NNMT、LPHN3、PEG3、FLT1、NPR3、AOC1、ITGB8、RXFP1、SPOCK1、CYP11A1、COL4A2、CNR1、SEMA3A、SERPINE1、IL1R1、FBLN1、UCHL1、RAI2、TGM2、PRLR、FSTL3、BCAR1、THSD4、FERMT2、PKP2、P4HA2、TEAD1或AQPEP。
2.如权利要求1所述的检测，其中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在指示孕妇的早产、相关临床状况、早产的风险增加或相关临床状况的风险增加，或先兆子痫。
3.如权利要求1所述的检测，其中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在是通过检测一种或多种特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物来确定。
4.如权利要求3的检测，其中所述特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与从孕妇分离出的血液样本或其部分相比有差异。
5.如权利要求4所述的检测，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在血液样本或其部分中的表达相比，其log2倍差为至少5，至少10，或至少15。
6.如前述任一项权利要求所述的检测，其中该方法包括步骤：
a)提供从孕妇分离的血液样本或其部分，
b)使该血液样本与(i)针对羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的配体或(ii)包括与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补的至少10个连续核苷酸的杂交探针接触，和
c)检测a)的血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物；
其中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的存在指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
7.如权利要求1至6中任一项所述的检测，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自MUC16、UPK1B、EMP1、PVRL4、THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR1、PRLR、IGF2、IGFBP3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2和GPX8。
8.如权利要求1至7中任一项所述的检测，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是选自MUC16、UPK1B、EMP1、PVRL4、THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR、PRLR和GPX8的细胞膜标志物。
9.如权利要求1至8中任一项所述的检测，其中所述羊膜细胞标志物是选自MUC16、UPK1B、EMP1和PVRL4的羊膜细胞膜标志物。
10.如权利要求1至9中任一项所述的检测，其中所述绒毛膜细胞标志物是选自THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR1和PRLR的绒毛膜细胞标志物。
11.如权利要求1至10中任一项所述的检测，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是选自IGF2、IGFBP3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2和GPX8的羊膜和绒毛膜之间共同的细胞标志物。
12.如权利要求1至11中任一项所述的检测，其中所述检测进一步包括检测上皮细胞标志物，例如选自CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK9、CK10、CK12、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18和CK19的标志物。
13.如权利要求1至12中任一项所述的检测，其中所述检测进一步包括检测间质标志物，例如选自至少一种波形蛋白的标志物。
14.如权利要求1至13中任一项所述的检测，其中与早产相关的临床状况是先兆子痫、早产或羊膜撕裂或破裂。
15.如权利要求1至14中任一项所述的检测，其中所述检测进一步包括：
确定所述血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量，和
将所述羊膜和/或绒毛膜细胞的量与对照进行比较；
其中，所述血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量高于对照的量指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
16.如权利要求15所述的检测，其中对照中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量是一个预先确定的值。
17.如权利要求1至16中任一项所述的检测，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是在蛋白质水平和/或RNA水平上检测。
18.如权利要求1至7中任一项所述的检测，其中所述血液样本是从妊娠20周后的孕妇分离。
19.如权利要求1至18中任一项所述的检测，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物存在于细胞膜中或细胞内。
20.如权利要求1至19中任一项所述的检测，其中所述来自孕妇的血液样本是全血。
21.如权利要求1至20中任一项所述的检测，其中向所述孕妇提供治疗，以最大限度地减少早产的风险或改善早产的后果，例如让该孕妇住院治疗。
22.一种确定早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加的方法，该方法包括步骤：
a)提供从孕妇分离的血液样本或其部分，和
b)确定该血液样本或其部分中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在；
其中，羊膜和/或绒毛膜细胞的存在指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞的存在是通过检测一种或多种特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物来确定。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述特异性羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与从孕妇中分离的血液样本或其部分相比有差异。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物在羊膜和/或绒毛膜细胞中的表达与在血液样本或其部分中的表达相比，其log2倍差为至少5，至少10，或至少15。
26.如权利要求22至25中任一项所述的方法，其中该方法包括步骤：
a)使样品与(i)针对羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的配体或(ii)包括与编码羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的基因互补的至少10个连续核苷酸的杂交探针接触，以及
b)检测a)的血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞标志物；
其中，羊膜和/或绒毛膜细胞标志物的存在指示该孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自IGF2、IGFPB3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2、GPX8、MUC16、KRT5、TSPAN1、UPK1B、CADPS2、LAMC2、AHNAK2、EMP1、FN1、MET、PVRL4、A2ML1、DSP、THSD4、KRT17、PDLIM4、COL17A1、DKK3、PLS3、DPYSL3、TPPP3、SHROOM3、THY1、DCN、DIO2、IGFBP2、SPARCL1、NNMT、LPHN3、PEG3、FLT1、NPR3、AOC1、ITGB8、RXFP1、SPOCK1、CYP11A1、COL4A2、CNR1、SEMA3A、SERPINE1、IL1R1、FBLN1、UCHL1、RAI2、TGM2、PRLR、FSTL3、BCAR1、THSD4、FERMT2、PKP2、P4HA2、TEAD1和AQPEP。
28.如权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物选自MUC16、UPK1B、EMP1、PVRL4、THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR1、PRLR、IGF2、IGFBP3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2和GPX8。
29.如权利要求22至28中任一项所述的方法，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是选自MUC16、UPK1B、EMP1、PVRL4、THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR、PRLR和GPX8的膜细胞标志物。
30.如权利要求22至29中任一项所述的方法，其中所述羊膜细胞标志物是选自MUC16、UPK1B、EMP1和PVRL4的羊膜细胞膜标志物。
31.如权利要求22至30中任一项所述的方法，其中所述绒毛膜细胞标志物是选自THY1、DIO2、LPHN3、FLT1、NPR3、RXFP1、CNR1和PRLR的绒毛膜细胞膜标志物。
32.如权利要求22至31中任一项所述的方法，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是选自IGF2、IGFBP3、SERPINB10、FBN1、CRYAB、KRT18、PRTG、COL1A2和GPX8的羊膜和绒毛膜之间共同的细胞标志物。
33.如权利要求22至32中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括检测上皮细胞标志物，例如选自CK1、CK2、CK3、CK4、CK5、CK6、CK7、CK8、CK9、CK10、、CK12、CK13、CK14、CK15、CK16、CK17、CK18和CK19的标志物和/或选自至少一种波形蛋白的间质标志物。
34.如权利要求22至33中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括：
a)确定血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量，和
b)将羊膜和/或绒毛膜细胞的量与处于相同孕龄但没有早产高风险的孕妇进行比较；
其中所述血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量高于对照中的量，指示孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
35.如权利要求34所述的方法，其中对照中的羊膜和/或绒毛膜细胞的量是一个预先确定的值。
36.如权利要求22至35中任一项所述的方法，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物是在蛋白质水平和/或RNA水平上检测。
37.如权利要求22至36中任一项所述的方法，其中所述血液样本是从妊娠20周后的孕妇中分离。
38.如权利要求22至37中任一项的方法，其中所述羊膜和/或绒毛膜细胞标志物存在于细胞膜上或细胞内。
39.如权利要求22至38中任一项所述的方法，其中来自孕妇的血液样本是全血。
40.如权利要求22至39中任一项所述的方法，其中向孕妇提供治疗，以最大限度地减少早产的风险或改善早产的后果，例如让该个体住院治疗。
41.一种试剂盒，包括一种或多种用于检测血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞上的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、49、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63种或表1和/或表2中的所有标志物。
42.一种确定早产或相关临床状况或早产或相关临床状况风险增加的方法，该方法包括步骤：
a)获得从孕妇分离的血液样本或其部分，和
b)确定该血液样本或其部分中羊膜和/或绒毛膜细胞的存在；
c)分离该血液样本或其部分中的羊膜和/或绒毛膜细胞；
d)确定分离的羊膜/绒毛膜细胞的RNA序列；
e)将分离的羊膜/绒毛膜细胞的基因表达谱与处于相同孕龄、但没有早产高风险的孕妇进行比较；
其中，该基因表达谱指示孕妇的早产或相关临床状况或早产或相关临床状况的风险增加。
43.如权利要求42所述的方法，其中与早产相关的临床状况是先兆子痫。
44.如权利要求42或43所述的方法，其中所述方法进一步包括检测母体标志物，例如选自CD14和CD45的标志物。
45.用于诊断早产风险的羊膜和/或绒毛膜特异性标志物。
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