CN116135963A - 一株热带盐孢菌、其应用与发酵方法 - Google Patents
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Abstract
一株热带盐孢菌、其应用与发酵方法。本发明提供了一株热带盐孢菌(Salinispora tropica)MID2004，于2021年06月07日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M 2021690。用此菌株发酵制备马瑞佐咪，经过摇瓶和罐上试验，发酵效价高且副产物少，降低后提取难度，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株热带盐孢菌、其应用与发酵方法。
背景技术
马瑞佐咪(Salinosporamide A，NPI-0052，Marizomib)是一种新型的海生蛋白酶体抑制剂，具有γ-内酰胺-β-内酯双环核心(结构式如下所示)，负责与20S蛋白酶β亚基发生不可逆结合，且对三个活性位点都有抑制作用，对于多种肿瘤细胞模型表现出很强的细胞毒性，是良好的候选药物。BMS(Celgene)公司已经用其开展系列临床研究，如处于临床三期的胶质母细胞瘤(Glioblastoma)研究，处于临床二期的多发性骨髓瘤(Multiplemyeloma)、室管膜瘤(Ependymoma)研究，以及多项处于临床一期的研究，同时前两项适应症已获批孤儿药资格。
Salinosporamide A于2003年被报道，特异性地存在于热带盐孢菌(Salinisporatropica) 中，天然产量仅几mg/L。一般的马瑞佐咪产生菌，生产能力不稳定，产量较低，杂质较多，导致后提取的工艺较为复杂，大大增加了后提取的难度，难以获得高纯度的最终产物，不适宜于工业化大生产。也有报道通过纯化学合成的方法制备马瑞佐咪，但现有的全合成路线均不能很好的适用于药物的大量制备，不仅耗时长、成本高，且使用的试剂毒性较大，安全操作范围较小，水中溶解度和稳定性较差，无法实现工业化大生产。
现有技术中，会在培养基中添加吸附树脂，用来吸附发酵得到的特定物质，这些吸附树脂不会影响菌体本身的发酵能力。如在文献《Stabilization effect of resin onthe production of potent proteasome inhibitor NPI-0052during submergedfermentation of Salinispora tropica》中， Ginger Tsueng、Kin S Lam等公开了加入XAD-7树脂后，将热带盐孢菌发酵生产马瑞佐咪的效价从原先的5.7mg/L提高到278mg/L。
发明内容
为了进一步提高发酵的效价，本发明提供了一株热带盐孢菌(Salinisporatropica)MID2004，于2021年06月07日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC NO：M 2021690。
本发明另外提供了一种所述热带盐孢菌MID2004的用途，用于生产马瑞佐咪；
或者，用于制备含马瑞佐咪的药品、保健品、食品、饮料、添加剂、饲料中的一个或多个。优选制备含马瑞佐咪的药品、保健品、添加剂中的一个或多个，更优选制备含马瑞佐咪的药品。
本发明另外提供了一种含有所述热带盐孢菌MID2004的发酵液。
本发明另外提供了一种所述发酵液的用途，用于生产马瑞佐咪；
或者，用于制备含马瑞佐咪的药品、保健品、食品、饮料、添加剂、饲料中的一个或多个。优选制备含马瑞佐咪的药品、保健品、添加剂中的一个或多个，更优选制备含马瑞佐咪的药品。
本发明另外提供了一种用所述热带盐孢菌MID2004生产马瑞佐咪的发酵方法。
优选地，包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行发酵。
优选地，所述碳源选自可溶性淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、麦芽糊精、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、甘油中的一种或多种；优选地选自可溶性淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、麦芽糊精、蔗糖、甘露醇、山梨醇中的一种或多种；更优选地选自可溶性淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、麦芽糊精中的一种或多种。
优选地，所述氮源选自黄豆粉、大豆蛋白粉、大豆蛋白胨、酵母浸出粉、麦芽浸出粉、玉米浆粉、酵母粉中的一种或多种；优选地选自大豆蛋白粉、大豆蛋白胨、酵母浸出粉、玉米浆粉、酵母粉中的一种或多种；更优选地选自大豆蛋白粉、大豆蛋白胨中的一种或多种。
优选地，所述发酵培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸亚铁水合物、硫酸亚铁铵、硫酸亚铁铵水合物、硫酸铁、硫酸铁水合物、硫酸锌、硫酸铜、硫酸铜水合物、硫酸镁、硫酸锰、硫酸钾、硫酸铵、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铝、氯化铁、溴化钾、氯化铜、氯化锌、乙酸钠中的一种或多种；优选地选自碳酸钙、硫酸铁、硫酸铁水合物、溴化钾、氯化钙、硫酸铜、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、乙酸钠中的一种或多种；优选地选自碳酸钙、硫酸铁、硫酸铁水合物、溴化钾、氯化钙、硫酸铜、乙酸钠中的一种或多种。
优选地，发酵培养基里还包括吸附树脂。
优选地，所述吸附树脂为适合吸附马瑞佐咪的吸附树脂；优选地选自：LX30、XAD7HP 中的一种或多种。
优选地，培养温度为26～30℃。
优选地，种子培养3～4天。
优选地，发酵培养5～7天。
优选地，摇瓶种子、种子罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源1.5～4.5g，氮源3～6.5g，无机盐0～0.3g，海水晶2～4g，其余为水。
优选地，摇瓶种子、种子罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源2.5～3.5g，氮源4～5.5g，无机盐0.1～0.2g，海水晶2.5～3.5g，其余为水。
优选地，发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源3～7g，氮源2～4g，无机盐0.05～0.5g，海水晶2～4g，树脂2～4g，其余为水。
优选地，发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源4～6g，氮源2.5～3.5g，无机盐0.1～0.3g，海水晶2.5～3.5g，树脂2.5～3.5g，其余为水；
有益效果：
1.本发明提供的菌株可获得发酵效价高的马瑞佐咪，同时发酵副产物相对较少，从而降低了后提取的难度；
2.本发明提供的菌株生产能力稳定，适合工业化生产。
附图说明
图1为保藏编号为CCTCC No：M 2021690的菌落形态；
图2为保藏编号为CCTCC No：M 2021690的菌丝形态；
图3为本发明实施例3发酵液HPLC图；
图4为本发明实施例4发酵液HPLC图。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1：菌种筛选及鉴定
本发明的原始出发菌种为本实验室保藏菌种，源于海洋沉积物中，在此基础上进行反复的自然分离以及诱变选育，筛选高产突变菌株，具体方法如下：
自然分离处理：吸取5mL指数生长期的培养菌液，将其稀释成不同浓度后，涂布于固体培养基，28℃培养10～14天，挑单菌落点种扩培，鉴定菌株效价。
紫外诱变处理：吸取50mL指数生长期的培养菌液，离心去除上清，菌体加入无菌生理盐水和玻璃珠，洗涤离心后制成分散均匀的菌悬液。吸取5mL制备的菌悬液，加入培养皿中，放入一无菌磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上，菌悬液于15W紫外灯下诱变，照射距离25cm，照射时间80s，致死率控制在75～85％。诱变后避光2h以免光复活，将菌悬液稀释涂布，鉴定菌株效价。
通过上述方法筛选得到高产突变菌株，优化培养前效价可达408μg/mL，命名为MID2004。通过菌株MID2004的16s rDNA序列测定，得到序列SEQ ID NO:1，使用NCBI进行BLAST 比对，发现该菌株属于盐孢菌属(Salinispora)，与其中的沙栖盐孢菌(Salinisporaarenicola) 和太平洋盐孢菌(Salinispora pacifica)相似度很高，分别达到99.5％和99.6％，与其中的热带盐孢菌(Salinispora tropica)相似度最高，达到100％，故而确定高产突变菌株MID2004为热带盐孢菌(Salinispora tropica)的一个变种。菌株MID2004的菌落形态和菌丝形态如图1和图2所示。
将筛选得到的菌株MID2004于2021年06月07日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M 2021690。
以下采用菌株MID2004示例性地给出碳源、氮源的筛选，以及发酵培养的实施例。
实施例2：碳源、氮源筛选
1、固体培养碳源利用情况
此次试验以大豆蛋白胨-酵母浸出粉-海盐为基础培养基，28℃培养7天，结果如下表所示：CCTCC No：M 2021690菌株在含有可溶性淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、麦芽糊精等长链多糖的固体培养基上生长丰富，且颜色呈橙黄色；在含有蔗糖、甘露醇、山梨醇的固体培养基上生长中等，且颜色呈浅橙色；在含有麦芽糖、葡萄糖、甘油的固体培养基上生长一般，且颜色呈橙黑色，菌落快速衰老。
CCTCC No：M 2021690的固体培养碳源利用情况
注：+++生长丰富，++生长中等，+生长一般
2、固体培养氮源利用情况
此次试验以玉米淀粉-海盐为基础培养基，28℃培养7天，结果如下表所示：CCTCCNo： M 2021690菌株在含有大豆蛋白粉(生)、大豆蛋白粉(熟)、大豆蛋白胨的固体培养基上生长丰富，且颜色呈橙黄色；在含有酵母浸出粉、玉米浆粉、酵母粉的固体培养基上生长中等，且颜色呈浅橙色；在含有黄豆粉、麦芽浸出粉的固体培养基上生长一般，且颜色呈橙黑色，菌落快速衰老。
CCTCC No：M 2021690的固体培养氮源利用情况
注：+++生长丰富，++生长中等，+生长一般
实施例3：摇瓶发酵培养制备马瑞佐咪
1、菌种培养及保存
固体培养基：玉米淀粉2g，大豆蛋白粉(熟)0.2g，大豆蛋白胨2g，酵母浸出粉1g，海盐3g，琼脂2g，加水到100mL，pH调7.0。
固体培养方法：将菌株稀释涂布于新鲜平板上，28℃培养10～14天，菌落丰满，呈橙黄色。
固体培养结束后，平板放置4～10℃冷藏备用。
2、摇瓶种子培养
种子培养基：玉米淀粉2g，大豆蛋白粉(熟)0.2g，大豆蛋白胨2g，酵母浸出粉1g，海盐3g，琼脂0.3g，加水到100mL，pH调7.0。
种子装液量：250mL三角瓶里装40mL培养基，121℃灭菌30min。
摇瓶种子培养方法：用竹铲从培养好的平板刮取整板菌落，溶于5mL水中，作为原液，按3～5％接种比例(1.2～2mL/40mL)接入摇瓶种子培养基中，28℃、240rpm摇床培养3天，等待菌丝长起，种子成熟后明显挂壁，镜检可见大量网状菌丝及菌团，染色较深且无杂菌， pH为6.7，菌浓为20％。
3、摇瓶发酵培养
发酵培养基：可溶性淀粉2.5g，麦芽糊精2.5g，大豆蛋白粉(熟)1.5g，酵母浸出粉1.75g， CaCO3 0.1g，Fe2(SO4)3·9H2O 0.004g，KBr 0.01g，CaCl2 0.05g，CuSO4 0.005g，NaAc 0.05g，海盐3g，XAD7HP树脂3g，加水到100mL，pH调7.0。
发酵装液量：500mL三角瓶里装100mL培养基，121℃灭菌30min。
摇瓶发酵培养方法：吸取摇瓶种子，按10％接种比例(10mL/100mL)接入摇瓶发酵培养基中，30℃、250rpm摇床培养5天，菌液变橙色后转橙灰色，镜检可见大量网状菌丝，且无杂菌，pH为6.7，菌浓为28％。提取树脂中的马瑞佐咪后检测效价为590μg/mL，归一39％(见图3)。
实施例4：罐上发酵培养制备马瑞佐咪
1、摇瓶种子培养
种子培养基：玉米淀粉3g，大豆蛋白粉(熟)0.3g，大豆蛋白胨3g，酵母浸出粉1.5g，海盐3g，加水到100mL，pH调7.0。
种子装液量：500mL三角瓶里装100mL培养基，121℃灭菌30min。
摇瓶种子培养方法：将30％甘油菌丝冷冻管解冻后，按3～5％接种比例(3～5mL/100mL) 接入摇瓶种子培养基中，28℃、260rpm摇床培养3天，等待菌丝长起，种子成熟后明显挂壁，镜检可见大量网状菌丝及菌团，染色较深且无杂菌，pH为6.4，菌浓为18％。
30％甘油菌丝冷冻管的制作：在无菌状态下，将灭菌后的纯甘油加入生长好的摇瓶种子中，摇匀制成约30％甘油菌丝悬浮液，然后分装至螺口冷冻管中，10mL/支，放置-70℃低温冰箱备用。
2、罐上种子培养
种子培养基：玉米淀粉3kg，大豆蛋白粉(熟)0.3kg，大豆蛋白胨3kg，酵母浸出粉1.5kg， CaCO3 0.15kg，海盐3kg，泡敌0.2kg，加水到100L，pH调7.0。
种子罐装量：150L种子罐内装100L培养基，121℃灭菌30min。
罐上种子培养方法：将培养好的0.2～2L摇瓶种子液接入种子罐中，温度28℃，初始搅拌 150rpm，初始空气1VVM，罐压0.05MPa，控制搅拌150～350rpm，空气1～1.5VVM使得溶氧保持30％以上，培养3～4天，等待菌丝长起，种子成熟后明显挂壁，镜检可见大量网状菌丝及菌团，染色较深且无杂菌，pH为6.8，菌浓为26％。
3、罐上发酵培养
发酵培养基：可溶性淀粉15kg，大豆蛋白粉(熟)4.5kg，酵母浸出粉5.25kg，CaCO30.3kg， Fe2(SO4)3·9H2O 0.012kg，KBr 0.03kg，海盐9kg，LX30树脂10.5kg，泡敌0.3kg，加水到300L， pH调7.0。
发酵罐装量：700L发酵罐内装300L培养基，121℃灭菌30min。
罐上发酵培养方法：将培养好的15～30L罐上种子液接入发酵罐中，温度26℃，初始搅拌150rpm，初始空气1VVM，罐压0.05MPa，控制搅拌150～350rpm，空气1～1.5VVM使得溶氧保持30％以上，培养7天，菌液变橙色后转橙灰色，镜检可见大量网状菌丝，且无杂菌， pH为6.8，菌浓为33％。提取树脂中的马瑞佐咪后检测效价为524μg/mL，归一41％(见图 4)。
序列表
<110> 杭州中美华东制药有限公司
<120> 一株热带盐孢菌、其应用与发酵方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1363
<212> DNA
<213> 热带盐孢(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
ctcccccaca agggttaggc caccggcttc gggtgttgcc gactttcgtg acgtgacggg 60
cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcagcgtt gctgatctgc gattactagc 120
gactccgact tcacggggtc gagttgcaga ccccgatccg aactgagacc ggctttttgg 180
gattcgctcc acctcacggt atcgcagccc attgtaccgg ccattgtagc atgcgtgaag 240
ccctggacat aaggggcatg atgacttgac gtcatcccca ccttcctccg agttgacccc 300
ggcagtcttc gatgagtccc cgccataacg cgctggcaac atcgaacaag ggttgcgctc 360
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caccggcccc gaaggacccc ccatctctga aggatttccg gcgatgtcaa acccaggtaa 480
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attcctttga gttttagcct tgcggccgta ctccccaggc ggggcgctta atgcgttagc 600
tgcggcacag agaaccggag aggctcccca cacctagcgc ccaacgttta cagcgtggac 660
taccagggta tctaatcctg ttcgctcccc acgctttcgc tcctcagcgt cagtatcggc 720
ccagagaccc gccttcgcca ccggtgttcc tcctgatatc tgcgcatttc accgctacac 780
caggaattcc agtctcccct accgaactct agcctgcccg tatcgactgc aagcccgcag 840
ttgagccacg ggttttcaca gtcgacgcga caagccgcct acgagctctt tacgcccaat 900
aaatccggac aacgcttgcg ccctacgtct taccgcggct gctggcacgt agttggccgg 960
cgcttcttct gcaggtaccg tcacaaacgc ttcgtccctg ctgaaagagg tttacaaccc 1020
gaaggccgtc atccctcacg cggcgtcgct gcatcaggct tccgcccatt gtgcaagatt 1080
ccccactgct gcctcccgta ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggccggtcgc 1140
cctctcaggc cggctacccg tcgccgcctt ggtaggccat caccccacca acaagctgat 1200
aggccgcgag cccatcccaa gccaaaaaat ctttccacca accaccatgc ggcagccagt 1260
catatccggt attagccccg gtttcccggg gttatcccaa agcctggggc aggttactca 1320
cgtgttactc acccgttcgc cgctcgagta ccccgaaggg cct 1363
Claims (15)
1.一株热带盐孢菌(Salinispora tropica)MID2004，于2021年06月07日，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M 2021690。
2.一种如权利要求1所述热带盐孢菌MID2004的用途，其特征在于：
用于生产马瑞佐咪；
或者，用于制备含马瑞佐咪的药品、保健品、食品、饮料、添加剂、饲料中的一个或多个。
3.一种含有如权利要求1所述热带盐孢菌MID2004的发酵液。
4.一种如权利要求3所述发酵液的用途，其特征在于：
用于生产马瑞佐咪；
或者，用于制备含马瑞佐咪的药品、保健品、食品、饮料、添加剂、饲料中的一个或多个。
5.一种用如权利要求1所述热带盐孢菌MID2004生产马瑞佐咪的发酵方法。
6.如权利要求5所述的发酵方法，其特征在于：
包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行发酵。
7.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
所述碳源选自可溶性淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、麦芽糊精、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、甘油中的一种或多种；优选地选自可溶性淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、麦芽糊精、蔗糖、甘露醇、山梨醇中的一种或多种；更优选地选自可溶性淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、麦芽糊精中的一种或多种。
8.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
所述氮源选自黄豆粉、大豆蛋白粉、大豆蛋白胨、酵母浸出粉、麦芽浸出粉、玉米浆粉、酵母粉中的一种或多种；优选地选自大豆蛋白粉、大豆蛋白胨、酵母浸出粉、玉米浆粉、酵母粉中的一种或多种；更优选地选自大豆蛋白粉、大豆蛋白胨中的一种或多种。
9.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
所述发酵培养基还包括无机盐，所述无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、碳酸钙、硫酸亚铁、硫酸亚铁水合物、硫酸亚铁铵、硫酸亚铁铵水合物、硫酸铁、硫酸铁水合物、硫酸锌、硫酸铜、硫酸铜水合物、硫酸镁、硫酸锰、硫酸钾、硫酸铵、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铝、氯化铁、溴化钾、氯化铜、氯化锌、乙酸钠中的一种或多种；优选地选自碳酸钙、硫酸铁、硫酸铁水合物、溴化钾、氯化钙、硫酸铜、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钾、乙酸钠中的一种或多种；优选地选自碳酸钙、硫酸铁、硫酸铁水合物、溴化钾、氯化钙、硫酸铜、乙酸钠中的一种或多种。
10.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
发酵培养基里还包括吸附树脂。
11.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
培养温度为26～30℃。
12.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
种子培养3～4天。
13.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
发酵培养5～7天。
14.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
摇瓶种子、种子罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源1.5～4.5g，氮源3～6.5g，无机盐0～0.3g，海水晶2～4g，其余为水。
15.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源3～7g，氮源2～4g，无机盐0.05～0.5g，海水晶2～4g，树脂2～4g，其余为水。
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