CN116124927A - 血浆中jdb0131、其代谢物的浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，属于生物医药分析检测技术领域。本发明方法将待测血浆和内标物WXFL混匀，离心后，取上清液与水混匀，得待测样品；待测样品经高效液相色谱‑串联质谱仪检测样品中JDB0131和/或代谢物WXWD的色谱峰，并据此计算所述待测血浆中JDB0131和/或代谢物WXWD浓度。本发明基于HPLC‑MS/MS技术，以WXFL为内标，在全血和血浆中加入适宜稳定剂，能够高通量、快速灵敏的单独或同时检测JDB0131及其代谢物，结果准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于生物医药分析检测技术领域，具体涉及血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法。
背景技术
JDB0131是硝基咪唑类的新型抗结核化合物。据已有的体外活性，药代动力学和体内药效的结果来看，JDB0131具有优异的体内药效、肺部组织分布以及良好的安全性。
但目前并没有针对该小分子及其体内代谢物在生物样品中的血药浓度检测分析的相关报道。同时，由于该化合物及其代谢物在血浆及全血中不稳定，导致常规检测手段结果不准确。因此急需开发一种专用于JDB0131及其代谢物，并且具有高通量、快速灵敏、结果准确的检测方法。
发明内容
为了弥补现有技术的空白，本发明提供了一种血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其包括以下步骤：
A、将待测血浆和内标物WXFL混匀，离心后，取上清液与水混匀(一般震荡时间大于3s，液体混匀即可)，得待测样品；所述待测血浆由以下方法制备得到：将血浆与稳定剂1混匀即得；所述稳定剂1为饱和醋酸铵生理盐水溶液-冰醋酸、饱和醋酸铵生理盐水溶液-甲酸、浓氨水-甲酸中的至少一种；所述饱和醋酸铵生理盐水溶液-冰醋酸由以下方法制备得到：将饱和醋酸铵生理盐水溶液和冰醋酸按体积比10：3～5混匀即得；所述饱和醋酸铵生理盐水溶液-甲酸由以下方法制备得到：将饱和醋酸铵生理盐水溶液和甲酸按体积比10：3～5混匀即得；所述浓氨水-甲酸由以下方法制备得到：将浓氨水和甲酸按体积比10：3～5混匀即得；
B、待测样品经高效液相色谱-串联质谱仪检测样品中JDB0131和/或代谢物WXWD的色谱峰，并据此计算所述待测血浆中JDB0131和/或代谢物WXWD浓度。
优选的，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，所述稳定剂1为饱和醋酸铵生理盐水溶液-冰醋酸。
优选的，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，所述稳定剂1为10：3(v：v)的饱和醋酸铵生理盐水溶液-冰醋酸、10：3(v：v)的饱和醋酸铵生理盐水溶液-甲酸、2：1(v：v)的浓氨水-甲酸中的至少一种。
最优选的，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，所述稳定剂1为10：3(v：v)的饱和醋酸铵生理盐水溶液-冰醋酸。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，制备待测血浆所用血浆由以下方法制备得到：将全血与稳定剂2混合，然后离心即得；所述稳定剂2由以下方法制备得到：将稳定剂1和生理盐水按体积比1：2混合即得。
优选的，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，制备待测血浆所用血浆时，所述稳定剂2的用量为20～40μL/mL全血。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，制备待测血浆时，所述稳定剂1与血浆的体积比为40～50uL：1mL。
在探索化合物在有机溶剂中的溶解性时，本发明选择了乙腈，内标工作液溶剂则需与其保持一致。按照本领域常识，内标工作液中内标峰与中浓度待测样品峰响应接近即可，并且同一分析方法中要恒定。因此，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，所述内标物WXFL以内标工作液形式加入，所述内标工作液为：以乙腈为溶剂配置WXFL浓度为2～100ng/mL的内标工作液。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，所述内标工作液的加入量为不少于待测血浆体积的3倍。
内标工作液(沉淀剂)的用量提升有利于血浆基质中杂质的去除，对于色谱柱的保护等有利。优选的，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，所述内标工作液的加入量为待测血浆体积的3～20倍。
步骤A中上清液与水的体积比依赖于上清液的浓度以及流动相初始梯度等，上清液浓度越大，根据标曲线性范围，上清液与纯水的体积比越小；进样样本的有机溶剂和水相比例应与流动相初始比例相接近。因此上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，所述上清液与水的体积比为30：70～20：80。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤A中，待测血浆和内标物WXFL混匀后，控制离心转速转速不小于10000rpm，离心时间不少于5min，离心温度2～8℃。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤B中，高效液相色谱条件为：
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，50×2.1mm，1.7μm；
流动相：A水相：甲酸：氨水：水体积比＝0.5：0.5：1000，B有机相：乙腈；
梯度洗脱；柱温：40℃；进样量不超过20μL(进样量需根据最终进样浓度评估，浓度高则进样量要降低，最高进样量不超过20μL，在同一方法测定中进样量需恒定)。
梯度条件出峰前以待测物峰形好坏和是否能够充分分离优化所得，出峰后梯度条件为冲洗柱内残留物再平衡进样以防止柱内残留物集聚产生基质效应，影响测定的准确度和精密度。本发明尝试了不同溶剂和不同pH的流动相梯度条件，经过反复调整试验，最终选定了本发明的梯度条件。其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤B中，梯度洗脱程序为：
| 时间/min | 流速/mL/min | B/％ |
| 0 | 0.4 | 35 |
| 2.3 | 0.4 | 50 |
| 2.31 | 0.4 | 100 |
| 2.90 | 0.4 | 100 |
| 2.91 | 0.4 | 35 |
| 3.40 | 0.4 | 35 |
。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤B中，质谱条件为：检测方式：多反应离子监测MRM，正离子模式扫描；离子源：ESI源；检测参数为：
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，步骤B中，采用内标法，以JDB与内标物WXFL的响应比和/或代谢物WXWD与内标物WXFL的响应比(即峰面积比值)带入各自标准曲线方程，计算所述待测血浆中的JDB0131和/或代谢物WXWD浓度。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法中，所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
a、取空白血浆若干份，分别与稳定剂1按体积比为1mL：40～50uL混匀，得空白血浆1；将空白血浆1分别与对应份数的标准曲线系列工作液混合，得标准曲线系列血浆样本，标准曲线系列血浆样本采用前述与待测血浆相同的预处理操作，得若干标样；
b、标样经高效液相色谱-串联质谱仪(与前述待测血浆相同条件)检测样品中JDB0131与内标物WXFL的响应比和/或代谢物WXWD与内标物WXFL的响应比，以JDB与内标物WXFL的响应比，以JDB与内标物WXFL的浓度比为横坐标，得到JDB的标准曲线方程，和/或以代谢物WXWD与内标物WXFL的响应比，以代谢物WXWD与内标物WXFL的浓度比为横坐标，得到代谢物WXWD的标准曲线方程。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法中，步骤a中，空白血浆1与标准曲线系列工作液按体积比不小于19：1混合。
优选的，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法中，步骤a中，空白血浆1与标准曲线系列工作液按体积比为19：1混合。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法中，步骤a中，标准曲线系列血浆样本中JDB0131浓度选自1～2000ng/mL中的不少于6个点，和/或标准曲线系列血浆样本中代谢物WXWD浓度选自0.25～500ng/mL中的不少于6个点。本领域技术人员可以根据分析检测常识，在该范围内选择相关系列梯度浓度的标准点若干，用于绘制标准曲线。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法中，步骤a中，标准曲线系列血浆样本中JDB0131浓度为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、1000ng/mL、1800ng/mL和2000ng/mL，和/或标准曲线系列血浆样本中代谢物WXWD浓度为0.25ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、62.5ng/mL、250ng/mL、450ng/mL和500ng/mL。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法中，步骤a中，所述工作液为JDB0131工作液、WXWD工作液或JDB0131和WXWD混合工作液，具体根据检测目标而定；所述工作液通过浓度100～1000μg/mL的JDB储备液和/或浓度100～1000μg/mL的WXWD储备液与适量稀释剂配制而成(为便于操作，一般采用逐级稀释)，所述稀释剂由以下方法制备得到：将乙腈、水和稳定剂1按体积比30～50：50～70：8混匀即得。
其中，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法中，还包括以下步骤：配制质控血浆样本，进行质控检验；
所述配制质控血浆样本的操作为：
将浓度100～1000μg/mL的JDB储备液和/或浓度100～1000μg/mL的WXWD储备液与适量稀释剂混合(为便于操作，一般采用逐级稀释)，得LLOQ、LQC、MQC、HQC质控工作液，将质控工作液与空白血浆1混合，配制成LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本；
所述稀释剂由以下方法制备得到：将乙腈、水和稳定剂1按体积比30～50：50～70：8混匀即得；
空白血浆1与质控工作液按体积比不小于19：1混合；优选为19：1；
所述LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本中JDB0131浓度选自1～2000ng/mL中的从低到高4个点，和/或LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本中代谢物WXWD浓度选自0.25～500ng/mL中的从低到高4个点；
所述进行质控检验的操作为：
LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本采用权利要求1或3中与待测血浆相同的预处理操作，得LLOQ、LQC、MQC、HQC质控待测样品，分别经高效液相色谱-串联质谱仪分析(与前述待测血浆、标准曲线相同条件)，经计算后得到LLOQ、LQC、MQC、HQC质控待测样品中JDB0131和/或WXWD的检测浓度；将检测浓度与LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本中的标准浓度进行准确度分析，得到质控检验结果。
优选的，上述血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法中，所述配制质控血浆样本的操作中，所述LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本中JDB0131浓度依次为1ng/mL、3ng/mL、120ng/mL、1600ng/mL，和/或LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本中代谢物WXWD浓度依次为0.25ng/mL、0.75ng/mL、30ng/mL、400ng/mL。
需要说明的是，按照本领域常识，本发明在全血、血浆中一般都需要加入抗凝剂(如肝素锂、枸橼酸钠等)，各抗凝剂均对待测物没有干扰。抗凝剂可为本领域常见抗凝剂，其用量也为本领域常规用量。
本发明能实现单独检测血浆中JDB0131或WXWD浓度，也能实现两者的同时检测，具体根据检测需求而定。当同时进行JDB0131和WXWD浓度检测时，即可配置两者的单独标样用于绘制各自标准曲线，也可将两者混合在一个标样中，同时绘制各自标准曲线。同理，本发明在单独检测血浆中JDB0131或WXWD时，可只单独配置JDB0131或WXWD血浆质控样本；当同时进行JDB0131和WXWD浓度检测时，即可配置两者的单独血浆质控样本，也可将两者混合在一个血浆质控样本中，进行质控检验。
本发明的有益效果是：本发明方法前处理简单，并且能够高通量、快速灵敏的单独或同时检测JDB0131及其代谢物，结果准确可靠。
具体实施方式
在前期试验中，本发明考察了全血、血浆中药物稳定性，筛选了几种不同的稳定剂条件：1)饱和偏重亚硫酸钠生理盐水溶液；2)10：1(v：v)的饱和Na2S2O4生理盐水溶液-纯甲酸；3)10：3(v：v)的饱和醋酸铵生理盐水溶液-冰醋酸；4)10：3(v：v)的饱和醋酸铵生理盐水溶液-纯甲酸；5)2：1(v：v)的浓氨水-纯甲酸；6)饱和维生素C生理盐水溶液；7)20：1(v：v)的KH2PO4生理盐水溶液-磷酸，稳定剂添加比例1mL血浆+40μL 1)～7)，分别考察了待测物在室温(约20℃)放置1h和4h的稳定性，最后结果表明在条件3)的情况下血浆中药物和内标最稳定，其次是条件4)和条件5)，其余稳定性次之，因此本发明选择了条件3)继续后续考察。
接着本发明考察了醋酸铵与冰醋酸在不同比例下的血浆中药物稳定性，发现添加40μL～50uL/mL 10：3(v：v)的醋酸铵-醋酸溶液～10：5(v：v)的醋酸铵-醋酸溶液均可以满足药物在血浆中的稳定性要求。
全血中药物稳定性考察：在以上比例的稳定剂条件下，在全血中添加20～40μl/mL稳定剂1可以满足全血药物稳定性要求，但是发现全血中加入过高比例和浓度的稳定剂容易导致溶血现象，于是本发明将稳定剂1再用生理盐水稀释得到稳定剂2，从而满足药物在全血中的稳定性要求。此外，考虑到稳定剂对血药浓度的误差影响，稳定剂的体积最好不超过全血总体积的5％，因此本发明选择在全血中先加入较少量稳定剂1，在离心分离后的血浆中再加入较大量稳定剂2；同时由于本发明在全血中、离心分离后的血浆中加入的稳定剂相对于总体积，实际上很少，因此对浓度几乎无影响。
在前期试验中，本发明考察了内标物对检测结果的影响。在本领域内，内标物的选用原则为：首选稳定性同位素标记的被测组分做内标，其次是与被测组分只差一个元素的化合物，再其次是与被测组分只差1个C的同系列化合物。然而本发明中的待测物并无商业化的稳定性同位素物，其合成难度大，且费时。本发明则筛选了五个与JDB0131具有结构类似的化合物(区别为：1个苯环上F为3位、2个苯环上多1个F(分别位于苯环2位和3位)、1个S换为O、1个F换为Cl)中经筛选比较，选定了结构中1个S换为O(只差1个元素)的WXFL作为内标最好，WXFL做内标经方法学评价各项指标均符合相关要求。
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
药物及试剂：
JDB0131对照品：武汉药明康德新药开发有限公司；
代谢物WXWD对照品：武汉药明康德新药开发有限公司；
内标物WXFL对照品：武汉药明康德新药开发有限公司；
乙腈购买于赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，甲酸、氨水、冰乙酸购买于成都市科隆化学品有限公司，生理盐水购买于四川科伦药业有限公司。
结构式如下：
实验仪器
美国Waters公司Acquity(I Class)型超高效液相色谱仪，美国Waters公司XevoTQ-S质谱仪，数据采集及控制系统软件为UNIFI Portal，法国METTLER TOLEDO型百万分之一电子分析天平，TGL-19高速离心机由四川蜀科生产，XW-80A微型旋涡混合器(上海青浦滬西)，IQ7000纯水机(Millipore)，BS423s型千分之一电子天平(Sartorius)。
实施例1
1、样本预处理方法：
取待测血浆(或标准曲线血浆样本)50μL，加入500μL乙腈配制的内标工作液(每个分析批次、每条标准曲线之前，均已采用双空白样本以及只加内标的空白样本，证明空白基质中没有待测物和内标的干扰物)，混匀后，低温离心5min(13000rpm，2-8℃)，取上清液50μL，加入纯水150μL，涡旋振荡器混合1min，进样4μL。
2、液相色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(50×2.1mm，1.7μm)，流动相：A(水相)：甲酸：氨水：水(0.5：0.5：1000)，B(有机相)：乙腈。流速：0.4mL·min-1，柱温：40℃。梯度条件如下：
表1JDB和WXWD血浆药物浓度检测流动相梯度
| 时间(min) | 流速(mL/min) | B(％) | 梯度曲线 |
| 0 | 0.4 | 35 | 6 |
| 2.3 | 0.4 | 50 | 6 |
| 2.31 | 0.4 | 100 | 6 |
| 2.90 | 0.4 | 100 | 6 |
| 2.91 | 0.4 | 35 | 6 |
| 3.40 | 0.4 | 35 | 6 |
3、质谱条件：检测方式：多反应离子监测(MRM)，正离子模式扫描；离子源：ESI源。主要检测参数见表2。
表2JDB、WXWD与WXFL的质谱参数
4、液体试剂及脂血/溶血空白血浆配制方法
4.1稳定剂1：取0.9％生理盐水，加醋酸铵混合，放置5min后再混匀仍有醋酸铵未溶解后静置，取上清液与分析纯冰醋酸按10：3混匀即成。
4.2稳定剂2：取稳定剂1用0.9％生理盐水按1：2稀释即成。
4.3含稳定剂的水溶液配制：纯水与稳定剂1按1000：40混合而成。
4.4流动相A相：甲酸：氨水：水(0.5：0.5：1000)：取纯水1000mL，加入甲酸500μL和浓氨水500μL混匀即得。
4.5稀释剂(含稳定剂的50％乙腈水，工作液配制用)：取50mL乙腈，加入50mL纯水，加入8mL稳定剂1混匀即得。
4.6空白全血1配制：用空白全血(从健康受试者采集所得或购自于成都市血液中心)与稳定剂2按1000：30(v：v)比例混合而成。
4.7空白血浆1配制：空白血浆(从健康受试者采集所得或购自于成都市血液中心)与稳定剂1按1000：40(v：v)比例混合而成。
4.8空白血浆2配制：空白全血1分离的血浆与稳定剂1按1000：20(v：v)混合而成。
4.9脂血空白血浆：用购买的商品化脂肪乳和空白血浆1按1：9(v：v)混合即得脂血空白血浆，使用时按以上比例配制即得。
4.10溶血空白血浆：用经冻融后的红细胞和空白血浆1按2：98(v：v)配制即得溶血空白血浆，使用时按以上比例配制即得。
4.11全血样本：用全血与质控工作液按96：4(v：v)比例混合，离心10min(1700g，4℃)，分离出血浆，置-80℃冰箱保存备用。
5.标准曲线、质控样品、内标储备液及工作液的配制
5.1.对照品储备液配制
5.1.1JDB储备液(标准曲线用，约500μg/mL)：用百万分之一天平准确称取JDB0131对照品约5mg，置于10mL容量瓶中，用DMSO溶解，定容至刻度，混匀即得浓度约为500μg/mL的JDB0131储备液，分装于EP管中，置-40℃冰箱保存备用。
5.1.2JDB储备液(质控用，约500μg/mL)：用百万分之一天平准确称取JDB0131对照品约5mg，置于10mL容量瓶中，用DMSO溶解，定容至刻度，混匀即得浓度约为500μg/mL的JDB0131储备液，分装于EP管中，置-40℃冰箱保存备用。
5.1.3WXWD储备液(标准曲线用，约500μg/mL)：用百万分之一天平准确称取WXWD对照品约5mg，置于10mL容量瓶中，用DMSO溶解，定容至刻度，混匀即得浓度约为500μg/mL的WXWD储备液，分装于EP管中，置-40℃冰箱保存备用。
5.1.4WXWD储备液(质控用，约500μg/mL)：用百万分之一天平准确称取WXWD对照品约5mg，置于10mL容量瓶中，用DMSO溶解，定容至刻度，混匀即得浓度约为500μg/mL的WXWD储备液，分装于EP管中，置-40℃冰箱保存备用。
5.1.5内标(WXFL)储备液(约500μg/mL)：用百万分之一天平准确称取WXFL对照品约5mg，置于10mL容量瓶中，用DMSO溶解，混匀即得浓度约为500μg/mL的WXFL储备液，分装于EP管中，置-40℃冰箱保存备用。
5.2内标工作液配制
5.2.1内标中间工作液配制(10μg/mL)：取500ug/mL内标储备液0.040mL，加入1.960mL乙腈，混匀即得。
5.2.2内标工作液配制(20ng/mL)：取10ug/mL内标中间工作液0.1mL，加入50mL乙腈，混匀即得。
5.3标曲工作液及血样配制
5.3.1标曲工作液及血样配制
5.3.1.1标准曲线工作液：按下表3用稀释剂稀释得标准曲线系列工作液STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6、STD7、STD8。分装于EP管中，置-40℃冰箱保存备用。
表3JDB和WXWD标准曲线系列工作液稀释方法
配置JDB-STD8：取0.4mL JDB储备液、0.1mL WXWD储备液和4.5mL稀释剂，混合均匀即得。
配置JDB-STD7：取1.8mL JDB-STD8和0.2mL稀释剂，混合均匀即得。
配置JDB-STD6：取1.0mL JDB-STD8和1.0mL稀释剂，混合均匀即得。
配置JDB-STD5：取0.5mL JDB-STD6和1.5mL稀释剂，混合均匀即得。
配置JDB-STD4：取0.5mL JDB-STD5和2.0mL稀释剂，混合均匀即得。
配置JDB-STD3：取0.5mL JDB-STD4和2.0mL稀释剂，混合均匀即得。
配置JDB-STD2：取0.5mL JDB-STD3和2.0mL稀释剂，混合均匀即得。
配置JDB-STD1：取1.0mL JDB-STD2和1.0mL稀释剂，混合均匀即得。
5.3.1.2标准曲线血浆样本配制：用空白血浆1与标准曲线工作液按19：1的比例配制血浆标准曲线样本(其血药浓度如表3所示)。血浆标准曲线样本每批次使用时新配，实际需要按比例配制。
5.3.2质控工作液及血样配制
5.3.2.1质控工作液：按下表4用50％乙腈稀释得质控用系列工作液ULOQ、HQC、MQC、LQC和LLOQ。分装于EP管中，置-40℃冰箱保存备用。
表4JDB和WXWD质控样本系列工作液稀释方法
配置ULOQ：取0.4mL JDB储备液、0.1mL WXWD储备液和4.5mL稀释剂，混合均匀即得。
配置HQC：取1.6mL ULOQ和0.4mL稀释剂，混合均匀即得。
配置MQC：取0.3mL HQC和3.7mL稀释剂，混合均匀即得。
配置LQC：取0.1mL MQC和3.9mL稀释剂，混合均匀即得。
配置LLOQ：取0.5mL LQC和1.0mL稀释剂，混合均匀即得。
5.3.2.2质控血浆样本配制：用空白血浆1与质控工作液按19：1的比例配制血浆质控样本(其血药浓度如表4所示)。血浆质控样本每批次使用时新配，实际需要按比例配制；稳定性考察样本按实际需要提前配制。
6基质效应进样样本配制
6.1基质效应用工作液配制：按下表稀释得基质效应工作液MEH、MEM和MEL。分装于EP管中，置-40℃冰箱保存，临用前配制。
表5基质效应用工作液配制方法
配置MEH：取18uL HQC、3.6mL内标工作液和8.262mL纯水，混合均匀即得。
配置MEM：取18uL MQC、3.6mL内标工作液和8.262mL纯水，混合均匀即得。
配置MEL：取18uL LQC、3.6mL内标工作液和8.262mL纯水，混合均匀即得。
6.2基质效应进样样本配制：空白血浆1按样本预处理方法进行预处理，取沉淀蛋白离心后空白基质上清液50μL，加入基质效应工作液150μL混匀即成。
7系统适应性/稳定性/PS工作液的配制
系统适应性/稳定性/PS工作液配制：取含稳定剂的水溶液50μL，加入500μL乙腈混合后取该混合溶液50μL，加入150μL基质效应工作液混匀即得。分装于EP管中，置-40℃冰箱保存备用。
8方法学验证内容、方法和接受标准
表6方法学验证内容、方法和接受标准
9人血浆中JDB及其代谢物WXWD血药浓度检测方法学验证结果：
9.1方法选择性
6个不同来源的空白血浆中JDB、WXWD和内标均未见明显的响应。考察结果可接受，见表7。
表7空白血浆中JDB、WXWD和内标响应结果
注：不适用即未检测出峰面积；JDB-LSP-Blank1为取JDB-SP-blank1配制所得脂血空白血浆；JDB-HSP-Blank1取JDB-SP-blank1配制所得溶血空白血浆。
9.2基质效应
9.2.1基质效应(6个不同来源空白血浆)
取6个不同来源的空白血浆，每一空白血浆9份，共计54份，按“样本预处理方法”项下操作处理，加入LQC、MQC、HQC三个浓度基质效应工作液，分别记录进样得到JDB、WXWD与内标的峰面积，同时相应工作液直接进样得到峰面积。HQC、MQC和LQC以内标基质效应校准后JDB血浆样本基质效应均值分别为0.968、1.018和0.926，％CV分别为2.74％、1.38％和2.33％，见表8；WXWD血浆样本基质效应均值分别为0.987、0.998和0.905，％CV分别为3.22％、0.70％和2.19％，见表9。
表8JDB基质效应试验
表9WXWD基质效应试验
9.2.2脂血、溶血空白血浆样本基质效应
用20％脂肪乳和空白血浆按1：9混合即得脂血空白血浆，用经冻融后的全血和空白血浆按2:98配制即得溶血空白血浆。按“样本预处理方法”项下方法操作处理进样，分别记录进样得到JDB、WXWD与内标的峰面积，同时相应工作液直接进样得到峰面积。HQC、MQC和LQC以内标基质效应校准后JDB脂血血浆样本基质效应均值分0.983、1.046和0.935，溶血血浆样本基质效应均值分0.935、0.995和0.933，见表8；WXWD脂血血浆样本基质效应均值分0.962、0.979.和0.878，溶血血浆样本基质效应均值分0.971、0.965和0.902，见表9，考察结果可接受。
9.3标准曲线线性
按“样本预处理方法”项下处理，检测得JDB和WXWD的血浆标准曲线。本次方法学验证共制备标准曲线4组(均双管)，采用标准曲线共4组，其r均大于0.99。待测物JDB血药浓度在(1～2000)ng·mL-1范围内有良好的线性关系，待测物WXWD血药浓度在(0.25～500)ng·mL-1范围内有良好的线性关系，标准曲线参数汇总表见表10。
表10JDB和WXWD的血浆浓度标准曲线
9.4标准曲线的回算浓度
采用的标准曲线回算浓度结果均合格，见表11和表12。
9.5精密度和准确度
按前述方法，配制LLOQ、LQC、MQC和HQC血浆质控样本，各取6份，按“样本预处理方法”项下方法操作检测三批。计算JDB的LLOQ三批批内精密度％CV在3.79％～6.88％之间、准确度偏差在-6.90％～8.23％范围内，批间精密度为％CV为8.39％、准确度偏差为-0.22％；除LLOQ外，其他三个浓度QC三批批内精密度％CV在1.88％～3.56％之间，准确度偏差在-4.20％～5.24％范围内，批间精密度％CV在3.17％～3.74％范围内，准确度偏差在-2.25％～3.21％范围内，见表13。计算WXWD的LLOQ三批批内精密度％CV在8.83％～13.51％之间、准确度偏差在-0.33％～9.93％范围内，批间精密度为％CV为11.16％、准确度偏差为5.27％；除LLOQ外，其他三个浓度QC三批批内精密度％CV在1.96％～4.57％之间，准确度偏差在-3.37％～7.36％范围内，批间精密度％CV在3.15％～3.84％范围内，准确度偏差在-1.81％～4.59％范围内，见表14。考察结果可接受。
表13JDB批内、批间样品检测的精密度和准确度
表14WXWD批内、批间样品检测的精密度和准确度
9.6待测物预处理回收率
取LQC、MQC、HQC血浆质控样本各6份，按“样本预处理方法”项下方法操作后进样，记录进样得到的JDB、WXWD和内标峰面积，即为预处理后的峰面积(C)；同法处理空白血浆，分别用相应浓度的基质效应工作液稀释后进样，记录进样得到的相应的峰面积，即为预处理前的峰面积(A)，以C/A×100％计算，JDB和WXWD低、中、高浓度样本的预处理回收率分别为108.74％和93.72％、93.08％和86.08％、90.24％和87.74％，总体平均回收率分别为97.35％和89.18％，总体变异分别为10.23％和4.51％，见表15和表16，考察结果可接受。
表15JDB预处理回收率
表16WXWD预处理回收率
9.7内标预处理回收率
按9.6操作以LQC、MQC和HQC血浆质控样本的内标峰面积计算内标的预处理回收率均值为97.92％。考察结果可接受，见表17。
表17内标回收率
9.8JDB和WXWD储备液稳定性考察
9.8.1JDB和WXWD储备液长期稳定性考察
配制JDB储备液和WXWD储备液，分装于塑料管中，置-40℃冰箱分别保存141d和72d；与新配的JDB储备液和WXWD储备液进行比较，二者分别稀释到ULOQ管工作液，用于考察储备液长期稳定性。分别取相应的ULOQ管工作液6μL，内标工作液1.2mL，加入纯水2.754mL，即得储备液稳定性考察PS-ULOQ管工作液，进样4μL。工作液制备6份，计算JDB和WXWD的平均稳定性偏差分别为-3.50％和-5.55％，见表18，说明JDB储备液于-40℃冰箱保存141d稳定，WXWD储备液于-40℃冰箱保存72d稳定。
表18储备液长期稳定性
9.8.2JDB和WXWD储备液短期稳定性考察
JDB储备液和WXWD储备液，分装于塑料管中。将分装好的储备液置室温保存4h，与低温保存(-40℃冰箱)的储备液比较，二者分别稀释到标准曲线ULOQ管工作液，用于考察储备液短期稳定性。分别取相应的ULOQ管工作液6μL，内标工作液1.2mL，加入纯水2.754mL，即得储备液稳定性考察PS-ULOQ管工作液，进样4μL。工作液制备6份，计算平均稳定性偏差为0.68％，说明JDB储备液于室温保存15h稳定。见表19。
表19储备液短期稳定性
9.9JDB和WXWD工作液稳定性考察
9.9.1JDB和WXWD工作液长期稳定性考察
取2021年4月19日配制的ULOQ和LLOQ管工作液(编号为：JDB-ULOQ-20210419，JDB-LLOQ-20210419，分装于塑料管中，置-40℃冰箱保存)与2021年4月29日新配的ULOQ和LLOQ管工作液(编号为：JDB-ULOQ-20210429，JDB-LLOQ-20210429)和4月29日新配的ULOQ和LLOQ管工作液(编号为：JDB-ULOQ-20210429，JDB-LLOQ-20210429)进行比较，用于考察工作液长期稳定性。分别取相应的ULOQ和LLOQ管工作液6μL，内标工作液1.2mL，加入纯水2.754mL，即得储备液稳定性考察PS-ULOQ及PS-LLOQ管工作液，进样4μL。工作液制备6份，计算4月29日考察的JDB的ULOQ和LLOQ平均稳定性偏差分别分别为0.36％和2.08％，WXWD的ULOQ和LLOQ平均稳定性偏差分别为-3.63％和-4.71％，说明JDB和WXWD工作液于-40℃冰箱保存10d稳定，见表20；计算5月25日考察的JDB的ULOQ和LLOQ平均稳定性偏差分别分别为-9.05％和6.77％，WXWD的ULOQ和LLOQ平均稳定性偏差分别为--6.93％和-3.01％，说明JDB和WXWD工作液于-40℃冰箱保存36d稳定，见表21。
表20工作液长期稳定性
表21工作液长期稳定性
9.9.2JDB和WXWD工作液短期稳定性考察
取配制好分装于塑料管中的ULOQ和LLOQ管工作液(编号为：JDB-ULOQ-20210420，JDB-LLOQ-20210420)置室温保存6h，与低温保存(-40℃冰箱)的ULOQ和LLOQ管工作液进行比较，用于考察工作液短期稳定性。分别取相应的ULOQ和LLOQ管工作液6μL，内标工作液1.2mL，加入纯水2.754mL，即得储备液稳定性考察PS-ULOQ及PS-LLOQ管工作液，进样4μL。工作液制备6份，计算JDB的ULOQ和LLOQ的平均稳定性偏差分别为0.12％和-7.55％，计算WXWD的ULOQ和LLOQ的平均稳定性偏差分别为-1.90％和-0.64％，说明JDB和WXWD工作液置室温保存6h稳定。见表22。
表22工作液短期稳定性
9.10内标储备液稳定性考察
9.10.1内标储备液长期稳定性考察
取2020年11月26日配制的WXFL70020152储备液(编号为：JDB-IS-SS-20201126，分装于塑料管中，置-40℃冰箱保存)与2021年4月15日新配的JDB储备液(编号为：JDB-IS-SS-20210415)进行比较，二者分别配制成内标工作液，用于考察内标储备液长期稳定性。分别取相应的内标工作液1.2mL，ULOQ工作液6μL，加入纯水2.754mL，即得储备液稳定性考察PS-ULOQ工作液，进样4μL。工作液制备6份，计算内标储备液的平均稳定性偏差为2.36％，说明d3-JDB储备液于-40℃冰箱保存48天稳定。见表23。
表23内标储备液长期稳定性
9.10.2JDB和WXWD内标储备液短期稳定性考察
配制IS储备液(编号为：JDB-IS-SS-20210420)，分装于塑料管中。将分装后的内标储备液置室温保存4h，与低温保存(-40℃冰箱)的内标储备液进行比较，二者分别配制成内标工作液，用于考察内标储备液短期稳定性。分别取相应的内标工作液1.2mL，ULOQ工作液6μL，加入纯水2.754mL，即得储备液稳定性考察PS-ULOQ工作液，进样4μL。工作液制备6份，计算平均稳定性偏差为0.38％，说明WXFL70020152储备液于室温保存4h稳定。见表24。
表24内标储备液短期稳定性
9.11JDB和WXWD内标工作液稳定性考察
9.11.1JDB和WXWD内标工作液长期稳定性考察
取2021年4月20日配制的JDB内标工作液(JDB-WS-IS-20210420，-40℃冰箱保存)与2021年4月29日新配的内标工作液(编号为：JDB-WS-IS-20210429)进行比较，用于考察内标工作液长期稳定性。分别取相应的内标工作液1.2mL，ULOQ工作液6μL，加入纯水2.754mL，即得储备液稳定性考察PS-ULOQ工作液，进样4μL。工作液制备6份，计算平均稳定性偏差为-1.70％，说明内标储备液于2-8℃保存9d稳定，见表25。
表25内标工作液长期稳定性
9.11.2JDB和WXWD内标工作液短期稳定性考察
室温短期稳定性：配制JDB内标工作液(JDB-WS-IS-20210420)，分装2份1份置于室温、另1份置于2-8℃冰箱，放置14h。两个内标工作液进行比较，用于考察工作液短期稳定性。分别取相应的内标工作液1.2mL，ULOQ工作液6μL，加入纯水2.754mL，即得储备液稳定性考察PS-ULOQ工作液，进样4μL。工作液制备6份，计算平均稳定性偏差为-1.51％，说明内标储备液于室温保存12h稳定，见表26。
表26内标工作液短期稳定性
9.12主要储备液称量准确度比较
比较2021年4月20日配制的标曲用储备液与质控用储备液的一致性差异。将两份储备液分别稀释到PS-ULOQ后对比进样；两批工作液各制备6份。分别记录JDB与内标峰面积比，计算2份储备液峰面积比的差值和均值，以2份峰面积比的差值比二者均值计算偏差，JDB和WXWD的偏差分别为-2.22％和-2.14。见表27。
表27主要储备液称量准确度的比较
9.13内标适用性及药物对内标干扰考察
9.13.1内标适用性
取空白血浆样本六管各50μL，加500μL内标工作液进行样本预处理后进样。与定量下限血浆样本进样后比较，JDB和WXWD的峰面积均低于定量下限的20％(未见干扰)，见表28。
9.13.2药物对内标干扰
取STD8样本六管各50μL，加500μL乙腈进行样本预处理后进样。与BL+IS血浆样本进样后比较。内标出峰处的响应低于定量下限的5％(未见干扰)，见表28。检测设备：美国Waters公司Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪
表28内标药物的适用性
9.14血浆样本反复冻融稳定性
配制LQC、MQC和HQC血浆质控样本，于-80℃冰箱反复冻融3次，按“样本预处理方法”项下方法操作后进样，分别记录JDB和内标的峰面积，药物与内标的比值，由当日血浆标准曲线计算血浆JDB和WXWD浓度。JDB和WXWD的LQC、MQC和HQC的准确度平均偏差在在±8％以内，见表29和表30(试验条件：-80℃冰箱-室温反复冻融3次，每次冷冻时间超过12h)，表明血浆样本冻融3次对测定结果的影响在允许范围内。
表29JDB冻融稳定性
表30WXWD冻融稳定性
9.15血浆样本室温放置稳定性
配制LQC、MQC和HQC血浆质控样本，在室温光照条件下放置约6h后，按“样本预处理方法”项下方法操作后进样，分别记录JDB、WXWD和内标的峰面积，计算药物与内标的比值，由当日血浆标准曲线计算血浆JDB和WXWD浓度。JDB和WXWD的LQC、MQC和HQC准确度平均偏差在±6％以内，见表31和表32(试验条件：血浆样本在室温光照条件下放置约6h后再处理进样)，表明血浆样本室温光照放置约6h对测定结果的影响在允许范围内。
表31JDB生物样品前处理过程中的稳定性-室温光照放置稳定性
表32WXWD生物样品前处理过程中的稳定性-室温光照放置稳定性
9.16制备后样品稳定性
9.16.1萃取物放置稳定性
配制LQC、MQC和HQC血浆质控样本，按“样本预处理方法”项下方法操作后，预处理后于2-8℃放置约9h后进样，分别记录JDB、WXWD和内标的峰面积，计算药物与内标的比值，由当日血浆标准曲线计算血浆JDB和WXWD浓度。JDB和WXWD的LQC、MQC和HQC的准确度平均偏差在12％以内，见表33和表34(试验条件：2-8℃条件下放置约9h后稀释进样)，表明血浆样本预处理后于室温放置约9h对测定结果的影响在允许范围内。
表33JDB制备后样品的稳定性-萃取物放置稳定性
表34WXWD制备后样品的稳定性-萃取物放置稳定性
9.16.2进样室放置稳定性
配制LQC、MQC和HQC血浆质控样本，按“样本预处理方法”项下方法操作后，于进样室放置约24h后进样，分别记录JDB、WXWD和内标的峰面积，计算药物与内标的比值，由当日血浆标准曲线计算血浆JDB和WXWD浓度。JDB和WXWD的LQC、MQC和HQC准确度平均偏差在14％以内，见表35和表36(试验条件：样本在进样室(室温)放置约24h)，结果表明血浆样本预处理后在进样室内放置约24h对测定结果的影响在允许范围内。
表35JDB制备后样品的稳定性-进样室放置稳定性
表36WXWD制备后样品的稳定性-进样室放置稳定性
9.16.3重复进样稳定性
配制LQC、MQC和HQC血浆控样本，按“样本预处理方法”项下方法操作，重复进样6次，分别记录JDB、WXWD和内标的峰面积，计算药物与内标的比值，由当日血浆标准曲线计算血浆JDB和WXWD浓度。JDB和WXWD的LQC、MQC和HQC准确度平均偏差在4％以内，见表37和表38(试验条件：同一个样本重复进样6次)，表明血浆样本预处理后在进样室内重复进样6次对测定结果的影响在允许范围内。
表37JDB制备后样品的稳定性-重复进样稳定性
表38WXWD制备后样品的稳定性-重复进样稳定性
9.13血浆样本长期冷冻保存稳定性
配制LQC、MQC和HQC血浆质控样本，分别于-80℃保存9d和42d，-40℃冰箱冷冻保存8天，按“样本预处理方法”项下方法操作后进样，分别记录JDB、WXWD和内标的峰面积，计算药物与内标的比值，由当日血浆标准曲线计算血浆JDB和WXWD浓度。JDB和WXWD的浓度平均准确度偏差在±12％内，见表39～表42，表明血浆样本分别于-80℃保存42天，-40℃冰箱冷冻保存8天，对测定结果的影响在允许范围内。
表39JDB血浆样品长期稳定性(42d，-80℃)
表40WXWD血浆样品长期稳定性(42d，-80℃)
表41JDB血浆样品长期稳定性(8d，-40℃)
表42WXWD血浆样品长期稳定性(8d，-40℃)
9.14样品离心分离前基质中待测物稳定性
质控工作液：全血按4：96的比例配制LQC、MQC和HQC全血质控样本，其中一份立即离心分离血浆，另两份在室温条件下分别放置1.0h和3.0h后离心分离血浆，置-80℃冰箱保存，使用时取出解冻。按“样本预处理方法”项下方法操作后进样，分别记录JDB、WXWD和内标的峰面积，计算药物与内标的比值，由当日血浆标准曲线计算血浆JDB和WXWD浓度。比较全血立即离心与在室温放置1.0h和3.0h后离心样本药物浓度，JDB和WXWD的LQC、MQC和HQC的准确度平均偏差在±7％以内，见表43，表明全血样本在室温放置3.0h分离血浆对测定结果的影响在允许范围内。
表43全血稳定性
11.健康受试者给药JDB的体内血药浓度测定
1.试验对象∶健康受试者
2.采集方案∶
2.1空白样本采集：筛选合格的受试者入组后，于采样当天早晨在Ⅰ期病房空腹各采集约50mL静脉全血。由研究护士用一次性留置针采血，分置于5管10mL含稳定剂2(300μL)的肝素锂抗凝采血管中，立即轻轻翻转数次以确保血液和稳定剂、抗凝剂充分混合。
2.2P K样品的采集在研究期间按照如下设计的时间点采集血样。
全血标本的采集在I期病房进行，每个时间点采集约3mL静脉全血，置于3mL含稳定剂2(90μL)的肝素锂抗凝采血管中，立即轻轻翻转数次以确保血液和稳定剂、抗凝剂充分混合(若使用静脉留置针采血，每次采血前弃血约1mL)。采集的PK全血样本30min内离心分离血浆，血浆与稳定剂1按体积比1mL：40μL混合，进行前述“样本预处理方法”。
2.3(SAD)血样采集时间点：采集给药前(0h)，给药后20min、40min、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、5h、6h、8h、12h、24h(D2)、36h、48h(D3)、72h(D4)、96h(D5)、120h(D6)、148h(D8)的血样。
3.血浆样品测定方法：采用上述超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)方法测定健康受试者给药后不同时间点血浆中JDB和WXWD的浓度。
健康受试者(A2001～A2010、A3001～A3010、A4001～A4010为不同受试者)在口服50mg、100mg和200mgJDB三种剂量后不同时间点药物JDB及WXWD的药物血浆浓度见表44～49。
表44 50mg剂量组母体药物血药浓度测定结果(JDB，ng/mL)
| 时间h | A2001 | A2002 | A2004 | A2005 | A2006 | A2008 | A2009 | A2010 | 均值 | SD |
| 0 | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | |
| 0.333 | BQL | 11.428 | 34.158 | BQL | 24.848 | 15.164 | 25.460 | 7.925 | 14.873 | 9.963 |
| 0.667 | 9.100 | 52.111 | 79.793 | 30.152 | 81.374 | 71.542 | 79.415 | 21.275 | 53.095 | 29.328 |
| 1 | 14.776 | 70.628 | 118.489 | 34.519 | 95.626 | 73.083 | 94.394 | 36.177 | 67.212 | 35.863 |
| 1.5 | 23.057 | 135.492 | 149.833 | 22.907 | 97.034 | 71.759 | 93.500 | 84.774 | 84.795 | 46.039 |
| 2 | 24.706 | 123.632 | 132.641 | 63.385 | 113.289 | 119.111 | 97.659 | 92.111 | 95.817 | 36.062 |
| 2.5 | 23.126 | 127.996 | 142.965 | 65.320 | 110.195 | 94.304 | 89.326 | 120.182 | 96.677 | 38.380 |
| 3 | 22.745 | 119.673 | 124.857 | 66.569 | 84.928 | 90.428 | 83.900 | 153.014 | 93.264 | 39.850 |
| 3.5 | 22.939 | 109.864 | 117.544 | 50.390 | 83.634 | 88.262 | 78.763 | 153.589 | 88.123 | 40.364 |
| 4 | 21.001 | 110.106 | 113.906 | 43.575 | 84.209 | 92.865 | 70.370 | 160.311 | 87.043 | 43.413 |
| 5 | 19.877 | 85.795 | 89.732 | 40.114 | 69.300 | 77.189 | 59.495 | 159.699 | 75.150 | 41.474 |
| 6 | 18.960 | 68.257 | 86.410 | 36.851 | 60.280 | 63.933 | 48.061 | 138.427 | 65.147 | 36.021 |
| 8 | 14.661 | 59.931 | 61.405 | 26.921 | 44.245 | 53.390 | 37.844 | 131.767 | 53.771 | 35.405 |
| 12 | 10.120 | 33.892 | 44.387 | 16.223 | 35.325 | 39.561 | 28.558 | 89.386 | 37.182 | 24.033 |
| 24 | 4.404 | 11.148 | 14.073 | 7.440 | 21.430 | 21.712 | 13.125 | 34.325 | 15.957 | 9.571 |
| 36 | 1.552 | 5.407 | 3.472 | 2.236 | 14.509 | 11.159 | 7.097 | 10.510 | 6.993 | 4.681 |
| 48 | BQL | 1.469 | BQL | BQL | 8.594 | 5.777 | 3.683 | 2.979 | 2.813 | 2.764 |
| 72 | BQL | BQL | BQL | BQL | 3.900 | 1.573 | BQL | BQL | 0.684 | 1.645 |
| 96 | BQL | BQL | BQL | BQL | 1.352 | BQL | BQL | BQL | 0.169 |
表45 50mg剂量组代谢物血药浓度测定结果(WXWD，ng/mL)
| 时间h | A2001 | A2002 | A2004 | A2005 | A2006 | A2008 | A2009 | A2010 | 均值 | SD |
| 0 | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | |
| 0.333 | BQL | 0.445 | 1.000 | BQL | 1.154 | 0.429 | 2.390 | 0.544 | 0.745 | 0.748 |
| 0.667 | 0.471 | 2.200 | 4.102 | 1.321 | 3.938 | 3.983 | 8.105 | 1.637 | 3.220 | 2.404 |
| 1 | 1.190 | 4.168 | 8.275 | 2.122 | 6.440 | 6.879 | 10.993 | 3.759 | 5.478 | 3.283 |
| 1.5 | 2.984 | 5.728 | 12.385 | 1.655 | 8.689 | 8.314 | 14.102 | 8.683 | 7.818 | 4.273 |
| 2 | 3.204 | 8.303 | 14.521 | 5.481 | 10.307 | 11.760 | 13.470 | 11.842 | 9.861 | 3.935 |
| 2.5 | 2.442 | 9.816 | 15.155 | 7.195 | 10.610 | 11.971 | 13.027 | 15.637 | 10.732 | 4.351 |
| 3 | 3.048 | 9.438 | 14.261 | 7.207 | 6.372 | 10.831 | 12.071 | 17.214 | 10.055 | 4.548 |
| 3.5 | 3.222 | 9.983 | 15.145 | 6.954 | 10.060 | 11.758 | 11.752 | 10.958 | 9.979 | 3.561 |
| 4 | 3.131 | 10.692 | 14.011 | 5.521 | 9.033 | 10.990 | 10.510 | 16.958 | 10.106 | 4.380 |
| 5 | 2.567 | 8.717 | 11.694 | 5.429 | 8.195 | 8.607 | 8.242 | 21.710 | 9.395 | 5.646 |
| 6 | 1.986 | 6.830 | 9.478 | 3.904 | 7.074 | 7.159 | 6.150 | 18.063 | 7.581 | 4.801 |
| 8 | 1.619 | 5.919 | 7.606 | 3.550 | 4.696 | 5.253 | 5.459 | 16.337 | 6.305 | 4.415 |
| 12 | 1.226 | 4.333 | 6.573 | 0.929 | 4.776 | 4.874 | 4.170 | 13.153 | 5.004 | 3.798 |
| 24 | 0.779 | 2.142 | 3.452 | 1.388 | 3.638 | 3.725 | 2.662 | 7.458 | 3.156 | 2.042 |
| 36 | 0.471 | 1.668 | 1.732 | 0.841 | 2.935 | 2.698 | 2.093 | 4.233 | 2.084 | 1.205 |
| 48 | 0.336 | 0.902 | 1.080 | 0.611 | 2.431 | 2.013 | 1.633 | 2.547 | 1.444 | 0.836 |
| 72 | 0.291 | 0.537 | 0.774 | 0.403 | 1.787 | 1.459 | 1.098 | 1.085 | 0.929 | 0.525 |
| 96 | BQL | 0.342 | 0.356 | 0.263 | 1.299 | 0.881 | 0.711 | 0.700 | 0.569 | 0.368 |
| 120.000 | 2.172 | 0.374 | 2.210 | 1.674 | 3.045 | 4.606 | 1.771 | 3.512 | 2.421 | 1.289 |
| 168.000 | 1.306 | BQL | 1.410 | 1.017 | 1.786 | 2.962 | 1.139 | 2.254 | 1.484 | 0.698 |
表46 100mg剂量组母体药物血药浓度测定结果(JDB，ng/mL)
表47 100mg剂量组代谢物血药浓度测定结果(WXWD，ng/mL)
| 时间h | A3001 | A3002 | A3003 | A3005 | A3006 | A3007 | A3009 | A3010 | 均值 | SD |
| 0 | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | |
| 0.333 | 0.983 | 1.904 | 2.033 | 4.303 | 1.414 | BQL | BQL | 2.584 | 1.653 | 1.165 |
| 0.667 | 8.209 | 13.811 | 9.704 | 22.791 | 11.535 | 4.943 | 1.257 | 8.642 | 10.112 | 6.409 |
| 1 | 14.959 | 19.651 | 14.498 | 28.620 | 20.694 | 11.103 | 4.989 | 11.977 | 15.811 | 7.162 |
| 1.5 | 22.301 | 29.635 | 22.218 | 37.090 | 39.549 | 13.817 | 9.670 | 16.313 | 23.824 | 10.815 |
| 2 | 27.690 | 34.691 | 28.242 | 41.854 | 49.093 | 20.132 | 12.097 | 20.175 | 29.247 | 12.220 |
| 2.5 | 31.087 | 37.447 | 27.090 | 38.659 | 60.197 | 25.001 | 13.874 | 18.985 | 31.543 | 14.339 |
| 3 | 42.068 | 40.223 | 29.755 | 40.051 | 66.457 | 27.760 | 19.267 | 26.963 | 36.568 | 14.465 |
| 3.5 | 32.416 | 30.187 | 24.257 | 35.129 | 53.053 | 22.731 | 12.736 | 15.938 | 28.306 | 12.662 |
| 4 | 35.015 | 30.318 | 25.720 | 38.286 | 53.983 | 27.131 | 12.963 | 18.387 | 30.225 | 12.651 |
| 5 | 30.676 | 22.465 | 13.217 | 21.598 | 40.820 | 19.487 | 11.303 | 13.214 | 21.598 | 10.026 |
| 6 | 17.744 | 12.925 | 17.021 | 19.843 | 31.686 | 14.963 | 10.848 | 12.189 | 17.152 | 6.610 |
| 8 | 15.161 | 14.434 | 17.253 | 16.590 | 26.972 | 12.642 | 10.713 | 11.701 | 15.683 | 5.104 |
| 12 | 12.428 | 13.293 | 11.606 | 14.448 | 21.639 | 11.157 | 8.429 | 8.806 | 12.726 | 4.147 |
| 24 | 8.506 | 6.564 | 7.421 | 10.866 | 10.791 | 6.311 | 5.158 | 3.441 | 7.382 | 2.600 |
| 36 | 5.915 | 4.725 | 4.179 | 9.615 | 5.546 | 4.559 | 4.487 | 1.777 | 5.100 | 2.202 |
| 48 | 3.961 | 2.910 | 2.512 | 6.744 | 3.937 | 3.862 | 3.999 | 1.160 | 3.636 | 1.602 |
| 72 | 2.328 | 2.057 | 1.392 | 3.913 | 2.233 | 2.805 | 2.785 | 0.710 | 2.278 | 0.964 |
| 96 | 1.369 | 1.311 | 0.653 | 2.323 | 1.248 | 1.986 | 2.302 | 0.308 | 1.438 | 0.735 |
| 120.000 | 2.063 | 2.626 | 5.529 | 2.549 | 0.266 | 1.947 | 1.161 | 3.107 | 2.406 | 1.548 |
| 168.000 | 0.808 | 1.797 | 3.488 | 1.626 | BQL | 1.230 | 0.339 | 1.991 | 1.410 | 1.009 |
表48 200mg剂量组母体药物血药浓度测定结果(JDB，ng/mL)
表49 200mg剂量组代谢物血药浓度测定结果(WXWD，ng/mL)
| 时间h | A4002 | A4003 | A4004 | A4005 | A4006 | A4007 | A4008 | A3010 | 均值 | SD |
| 0.000 | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | BQL | |
| 0.333 | BQL | 0.483 | 1.590 | 1.645 | 5.012 | 3.239 | 0.402 | 1.301 | 1.709 | 1.645 |
| 0.667 | 0.838 | 1.816 | 8.433 | 7.999 | 22.812 | 10.857 | 4.152 | 6.945 | 7.982 | 6.899 |
| 1.000 | 3.579 | 2.484 | 12.444 | 17.103 | 26.204 | 17.410 | 6.529 | 11.154 | 12.113 | 8.011 |
| 1.500 | 10.272 | 3.893 | 16.409 | 28.824 | 35.712 | 32.018 | 12.282 | 18.919 | 19.791 | 11.317 |
| 2.000 | 17.009 | 4.929 | 26.845 | 43.721 | 46.861 | 31.323 | 18.296 | 20.829 | 26.227 | 14.085 |
| 2.500 | 21.085 | 6.500 | 28.799 | 43.845 | 40.729 | 41.758 | 24.847 | 25.648 | 29.151 | 12.638 |
| 3.000 | 22.742 | 6.483 | 31.175 | 42.609 | 37.874 | 42.397 | 25.301 | 26.711 | 29.412 | 12.023 |
| 3.500 | 21.453 | 8.014 | 31.745 | 43.148 | 39.821 | 48.861 | 31.097 | 37.425 | 32.696 | 12.999 |
| 4.000 | 27.031 | 7.030 | 31.653 | 41.656 | 40.591 | 62.932 | 25.919 | 32.023 | 33.604 | 15.985 |
| 5.000 | 17.756 | 6.126 | 21.019 | 33.031 | 25.060 | 42.294 | 17.748 | 28.334 | 23.921 | 10.971 |
| 6.000 | 13.701 | 5.125 | 15.737 | 30.253 | 19.549 | 31.606 | 13.101 | 28.793 | 19.733 | 9.588 |
| 8.000 | 12.277 | 5.059 | 13.730 | 25.821 | 20.238 | 30.504 | 12.824 | 21.300 | 17.719 | 8.264 |
| 12.000 | 10.799 | 4.996 | 13.215 | 20.402 | 19.050 | 25.223 | 11.500 | 19.164 | 15.544 | 6.527 |
| 24.000 | 8.293 | 3.638 | 10.351 | 13.601 | 18.525 | 20.090 | 9.984 | 14.056 | 12.317 | 5.404 |
| 36.000 | 6.526 | 2.704 | 7.571 | 10.039 | 14.609 | 15.558 | 7.672 | 10.242 | 9.365 | 4.236 |
| 48.000 | 4.698 | 1.782 | 5.856 | 6.014 | 11.196 | 11.400 | 6.102 | 8.932 | 6.998 | 3.302 |
| 72.000 | 3.459 | 1.018 | 4.002 | 3.651 | 6.588 | 7.711 | 3.487 | 5.610 | 4.441 | 2.107 |
| 96.000 | 2.644 | 0.678 | 2.871 | 2.419 | 4.287 | 5.657 | 2.831 | 4.600 | 3.248 | 1.544 |
| 120.000 | 3.351 | 1.752 | 2.108 | 2.116 | 8.500 | 3.410 | 2.752 | 4.188 | 16.464 | 2.170 |
| 168.000 | 1.771 | 0.653 | 1.162 | 0.995 | 5.574 | 2.504 | 1.580 | 2.269 | 20.501 | 1.550 |
Claims (10)
1.血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
A、将待测血浆和内标物WXFL混匀，离心后，取上清液与水混匀，得待测样品；所述待测血浆由以下方法制备得到：将血浆与稳定剂1混匀即得；所述稳定剂1为饱和醋酸铵生理盐水溶液-冰醋酸、饱和醋酸铵生理盐水溶液-甲酸、浓氨水-甲酸中的至少一种；所述饱和醋酸铵生理盐水溶液-冰醋酸由以下方法制备得到：将饱和醋酸铵生理盐水溶液和冰醋酸按体积比10：3～5混匀即得；所述饱和醋酸铵生理盐水溶液-甲酸由以下方法制备得到：将饱和醋酸铵生理盐水溶液和甲酸按体积比10：3～5混匀即得；所述浓氨水-甲酸由以下方法制备得到：将浓氨水和甲酸按体积比10：3～5混匀即得；
B、待测样品经高效液相色谱-串联质谱仪检测样品中JDB0131和/或代谢物WXWD的色谱峰，并据此计算所述待测血浆中JDB0131和/或代谢物WXWD浓度。
2.根据权利要求1所述的血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其特征在于：步骤A中，制备待测血浆所用血浆由以下方法制备得到：将全血与稳定剂2混合，然后离心即得；所述稳定剂2由以下方法制备得到：将稳定剂1和生理盐水按体积比1：2混合即得；优选的，制备待测血浆所用血浆时，所述稳定剂2的用量为20～40μL/mL全血。
3.根据权利要求1或2所述的血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其特征在于：步骤A中，至少满足下列的一项：
制备待测血浆时，所述稳定剂1与血浆的体积比为40～50uL：1mL；
所述内标物WXFL以内标工作液形式加入，所述内标工作液为：以乙腈为溶剂配置WXFL浓度为2～100ng/mL的内标工作液；所述内标工作液的加入量为不少于待测血浆体积的3倍；优选为3～20倍；
所述上清液与水的体积比为30：70～20：80；
待测血浆和内标物WXFL混匀后，控制离心转速转速不小于10000rpm，离心时间不少于5min，离心温度2～8℃。
4.根据权利要求1～3任一项所述的血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其特征在于：步骤B中，高效液相色谱条件为：
色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18，50×2.1mm，1.7μm；
流动相：A水相：甲酸：氨水：水体积比＝0.5：0.5：1000，B有机相：乙腈；
柱温：40℃；进样量不超过20μL；
梯度洗脱程序为：
5.根据权利要求1～3任一项所述的血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其特征在于：步骤B中，质谱条件为：检测方式：多反应离子监测MRM，正离子模式扫描；离子源：ESI源；检测参数为：
6.根据权利要求1～5任一项所述的血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其特征在于：步骤B中，采用内标法，以JDB与内标物WXFL的响应比和/或代谢物WXWD与内标物WXFL的响应比带入各自标准曲线方程，计算所述待测血浆中的JDB0131和/或代谢物WXWD浓度。
7.根据权利要求6所述的血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其特征在于：所述标准曲线方程的建立包括以下步骤：
a、取空白血浆若干份，分别与稳定剂1按体积比为1mL：40～50uL混匀，得空白血浆1；将空白血浆1分别与对应份数的标准曲线系列工作液混合，得标准曲线系列血浆样本，标准曲线系列血浆样本采用权利要求1或3中与待测血浆相同的预处理操作，得若干标样；
b、标样经高效液相色谱-串联质谱仪检测样品中JDB0131与内标物WXFL的响应比和/或代谢物WXWD与内标物WXFL的响应比，以JDB与内标物WXFL的响应比，以JDB与内标物WXFL的浓度比为横坐标，得到JDB的标准曲线方程，和/或以代谢物WXWD与内标物WXFL的响应比，以代谢物WXWD与内标物WXFL的浓度比为横坐标，得到代谢物WXWD的标准曲线方程。
8.根据权利要求7所述的血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其特征在于：步骤a中，至少满足下列的一项：
空白血浆1与标准曲线系列工作液按体积比不小于19：1混合；优选为19：1；
步骤a中，标准曲线系列血浆样本中JDB0131浓度选自1～2000ng/mL中的不少于6个点，和/或标准曲线系列血浆样本中代谢物WXWD浓度选自0.25～500ng/mL中的不少于6个点；
优选的，标准曲线系列血浆样本中JDB0131浓度为1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、1000ng/mL、1800ng/mL和2000ng/mL，和/或标准曲线系列血浆样本中代谢物WXWD浓度为0.25ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、62.5ng/mL、250ng/mL、450ng/mL和500ng/mL。
9.根据权利要求7或8所述的血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其特征在于：步骤a中，所述工作液为JDB0131工作液、WXWD工作液或JDB0131和WXWD混合工作液，具体根据检测目标而定；所述工作液通过浓度100～1000μg/mL的JDB储备液和/或浓度100～1000μg/mL的WXWD储备液与适量稀释剂配制而成，所述稀释剂由以下方法制备得到：将乙腈、水和稳定剂1按体积比30～50：50～70：8混匀即得。
10.根据权利要求1～9任一项所述的血浆中JDB0131、其代谢物的浓度测定方法，其特征在于：所述方法还包括以下步骤：配制质控血浆样本，进行质控检验；
所述配制质控血浆样本的操作为：
将浓度100～1000μg/mL的JDB储备液和/或浓度100～1000μg/mL的WXWD储备液与适量稀释剂混合，得LLOQ、LQC、MQC、HQC质控工作液，将质控工作液与空白血浆1混合，配制成LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本；
所述稀释剂由以下方法制备得到：将乙腈、水和稳定剂1按体积比30～50：50～70：8混匀即得；
空白血浆1与质控工作液按体积比不小于19：1混合；优选为19：1；
所述LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本中JDB0131浓度选自1～2000ng/mL中的从低到高4个点，和/或LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本中代谢物WXWD浓度选自0.25～500ng/mL中的从低到高4个点；优选的，所述LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本中JDB0131浓度依次为1ng/mL、3ng/mL、120ng/mL、1600ng/mL，和/或LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本中代谢物WXWD浓度依次为0.25ng/mL、0.75ng/mL、30ng/mL、400ng/mL；
所述进行质控检验的操作为：
LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本采用权利要求1或3中与待测血浆相同的预处理操作，得LLOQ、LQC、MQC、HQC质控待测样品，分别经高效液相色谱-串联质谱仪分析，经计算后得到LLOQ、LQC、MQC、HQC质控待测样品中JDB0131和/或WXWD的检测浓度；将检测浓度与LLOQ、LQC、MQC、HQC血浆质控样本中的标准浓度进行准确度分析，得到质控检验结果。
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| CN114397379A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-04-26 | 安徽万邦医药科技股份有限公司 | 一种液质联用测定血浆中奥硝唑浓度的方法 |
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