CN116338046A - 一种复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法 - Google Patents
一种复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法。该含量检测方法包括以下步骤：对照品溶液的制备；供试品溶液的制备；分别将对照品溶液和供试品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图；根据对照品和供试品的色谱图，经过计算得到供试品溶液中的斑蝥素含量；其中，所述气相色谱仪的色谱条件如下：色谱柱是以(50％‑苯基)‑甲基硅酮为固定液，涂布浓度为3～5％；柱温为160～180℃；H2流速为28～32mL/min,空气流速为280～320mL/min，尾吹气N2流速为28～32mL/min。利用本发明提供的方法测定复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量，专属性强，可操作性好且具有良好的准确度及精密度。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法。
背景技术
复方斑蝥胶囊属于中成药物，含有斑蝥、甘草、女贞子、人参、黄芪、半枝莲等中药材。上述中药材通过中医理论配伍后，使复方斑蝥胶囊具有攻毒、破血、消瘀的功效。在临床上可以用于辅助治疗一些恶性肿瘤，例如：恶性淋巴瘤、肺癌、直肠癌、妇科恶性肿瘤、原发性肝癌等等。
斑蝥中主要活性成分为斑蝥素，现代医学对斑蝥素药用功能研究发现，斑蝥素及其衍生物对肿瘤细胞活性具有明显抑制作用。斑蝥具有毒性,常因多服、误服产生胃肠道反应及肝肾毒性,严重者可致肾衰竭,甚至死亡。其毒性物质基础多认为是斑蝥素，因此必须对其含量加以控制。
发明内容
本发明提供了一种复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，该方法专属性高，且可操作性强，具有较高的准确度和精密度。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
一种复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，包括以下步骤：
对照品溶液的制备：以斑蝥素为对照品，配制成对照品溶液；
供试品溶液的制备：取复方斑蝥胶囊配制成供试品溶液；
分别将对照品溶液和供试品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图；
根据对照品和供试品的色谱图，经过计算得到供试品溶液中的斑蝥素含量；
其中，所述气相色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱是以(50％-苯基)-甲基硅酮为固定液，涂布浓度为3～5％；
柱温为160～180℃；
H2流速为28～32mL/min,空气流速为280～320mL/min，尾吹气N2流速为28～32mL/min。
本发明实验发现，针对复方斑蝥胶囊中所含有的斑蝥素组分，采用上述色谱条件尤其是上述气体流量进行检测可以获得准确的分析结果。
优选地，上述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法中，所述对照品溶液的制备方法如下：称取斑蝥素适量，加入氯仿，配制成每1mL含0.02～0.03mg斑蝥素，得到对照品溶液。
优选地，上述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法中，所述供试品溶液的制备方法如下：取复方斑蝥胶囊的内容物3～5g置于容器中，加入氯仿55～65mL，加热回流0.5～1.5小时，放冷，滤过，滤液置于蒸发皿中，用氯仿洗涤容器及滤渣，洗液加入所述蒸发皿中，置于水浴上蒸干至约1.5～2.5mL，加氯仿至4.5～5.5mL，即得。
优选地，上述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法中，分别精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液各1.8～2.2μL，注入气相色谱仪，得到色谱图。
优选地，上述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法中，所述色谱柱的柱长为28～32m，柱径为0.300～0.350mm，膜厚为1.7～1.9μm，优选柱长为30m，柱径为0.320mm，膜厚为1.8μm。
优选地，上述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法中，所述气相色谱仪的进样口温度为195～205℃，优选为200℃；检测器温度为245～255℃，优选为250℃。
优选地，上述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法中，所述气相色谱仪的分流比为1：18～22，优选为1：20。
优选地，上述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法中，所述气相色谱仪的柱流量为13～17mL/min，优选为15mL/min。
优选地，上述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法中，所述气相色谱仪的色谱条件：理论塔板按斑蝥素峰计算应不低于2000。
本发明有益效果如下：
利用本发明的检测方法，可实现快速定量测定复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量，操作性强且具有良好的准确度及精密度。对本发明方法进行考察，经研究，该含量测定方法具有良好专属性、线性、精密度和耐用性。
附图说明
图1为斑蝥素浓度-峰面积线性关系图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1
1、仪器设备和试剂
气相色谱仪1：安捷伦7890A型；FID检测器；编号SB-NYF-070；
电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，型号XS205DU；编号SB-HYF-103；
超纯水器：德国赛多利斯；型号：6110V；编号SB-HYF-073；
数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；型号KQ-500DE；编号SB-HYF-171；
超纯水：自制；
氯仿：国药集团化学试剂有限公司；批号20191216；含量99.0％；
斑蝥素：中国食品药品检定研究院；批号110783-201105；含量98.6％。
2、溶液配置
对照品溶液的制备：以斑蝥素为对照品，配制成对照品溶液；
供试品溶液的制备：取复方斑蝥胶囊配制成供试品溶液。
3、色谱条件
色谱柱：安捷伦DB-624 30m×0.320mm×1.8μm；以苯基(50％)甲基硅酮为固定液，涂布浓度为4％；
载气：H2流量30mL/min,空气流量300mL/min，尾气N2流量30mL/min；
柱温：170℃；
进样口温度：200℃；
检测器温度：250℃；
分流比：1：20；
柱流量：15mL/min。
4、样品测定
分别精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液各2μL，注入气相色谱仪，得到色谱图，然后按照下述公式计算复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量：
式中：A样：供试品溶液中斑蝥素峰面积；
C对：对照品浓度(mg/ml)；
P：对照品含量；
A对：对照品溶液主峰面积；
C样：样品浓度(mg/ml)。
试验例1系统适用性测试
(一)溶液配制
(1)对照品溶液-1：精密称取斑蝥素对照品10.40mg，置10ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液-1；
(2)对照品溶液-2：精密称取斑蝥素对照品10.45mg，置10ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液-2；
(3)供试品溶液的制备：取本品40粒的内容物，精密称定，混匀，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氯仿60ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液置蒸发皿中，用氯仿15ml分次洗涤容器及残渣，洗液滤入同一蒸发皿中，置水浴上低温挥至约2ml，定量转移至5ml量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得。
(二)测定方法
分别精密吸取对照品溶液-1与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。
(三)结果
数据结果见表1～2，
表1 系统适用性试验结果
| 名称 | 保留时间 | 峰面积 | 理论塔板数 |
| 斑蝥素 | 15.202 | 405.73743 | 3762 |
表2进样精密度结果
(四)结论
实验结果表明：(1)进样精密度：对照品溶液重复进样6针，斑蝥素峰面积的相对标准偏差为0.63％(1μg/g的重复性(RSD)不得过8.0％)；符合中国药典的要求。
试验例2线性与范围
(一)溶液配制
(1)斑蝥素对照品溶液：精密称取斑蝥素对照品10.40mg，置10ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液-1。
(2)斑蝥素对照品储备液：精密称取斑蝥素对照品10.40mg，置10ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品储备液。
(3)斑蝥素线性溶液
①10％线性溶液：精密量取(1)溶液2ml，置25ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
②40％线性溶液：精密量取(1)溶液3ml，置10ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
③80％线性溶液：精密量取(1)溶液3ml，置5ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
④100％线性溶液：精密量取(1)溶液15ml，置20ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
⑤130％线性溶液：精密量取(1)溶液1ml，置25ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
⑥220％线性溶液：精密量取(2)溶液1ml，置20ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
(二)测定方法
分别精密量取各浓度水平的线性溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，并计算其线性相关系数。
峰面积为纵坐标进行线性回归，计算线性方程。
(三)结果
数据结果见表3，曲线图见图1
表3线性与范围试验结果
(四)结论
实验结果表明：斑蝥素2.4611μg/ml～51.2720μg/ml范围内，浓度与峰面积线性关系斑蝥素的线性方程为y＝12.786x+3.7458，r＝0.9999，方法线性良好。
试验例3定量限
(一)溶液配制
(1)斑蝥素对照品溶液：精密称取斑蝥素对照品10.40mg，置10ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液-1。
(2)斑蝥素线性溶液
①定量限浓度：精密量取(1)溶液2ml，置25ml量瓶中，加氯仿稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。
(二)测定方法
分别精密量取各浓度水平的线性溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。
(三)结果
数据结果见表4
表4定量限试验结果
(四)结论
斑蝥素的定量限浓度为2.4611μg/ml，信噪比为10：1；相对标准偏差为3.24％(1μg/g的重复性(RSD)不得过8.0％)；符合规定。
试验例4回收率
(一)溶液配制
(1)斑蝥素对照品溶液：精密称取斑蝥素对照品10.40mg，置10ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液-1。
(2)斑蝥素对照品溶液：精密称取斑蝥素对照品10.45mg，置10ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液-2。
(3)斑蝥素对照品溶液储备液：精密称取斑蝥素对照品8.2mg，置10ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品储备液。
(4)供试品溶液的制备：取本品40粒的内容物，精密称定，混匀，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氯仿60ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液置蒸发皿中，用氯仿15ml分次洗涤容器及残渣，洗液滤入同一蒸发皿中，置水浴上低温挥至约2ml，定量转移至5ml量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得。
(5)回收率溶液的配制
①100％溶液的配制：取本品40粒的内容物，精密称定，混匀，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入(3)对照品溶液储备液3ml，加氯仿60ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液置蒸发皿中，用氯仿15ml分次洗涤容器及残渣，洗液滤入同一蒸发皿中，置水浴上低温挥至约2ml，定量转移至5ml量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得。同法配制六份。
回收率＝(C-A)/B×100％
式中A为供试品所含被测成分量
B为加入对照品的量
C为实测量值；
(二)测定方法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液、回收率测定用样品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。按外标法计算斑蝥素的回收率。回收率应在75％～120％之间，其相对标准偏差(RSD)不得过8.0％。
(三)结果
数据结果见表5。
表5回收率试验结果
(四)结论
实验结果表明：按外标法计算斑蝥素的回收率。回收率为92.75％，RSD为5.34％，小于8.0％，符合验证要求。说明该含量方法准确度良好。
试验例5精密度
5.1重复性
(一)溶液配制
(1)斑蝥素对照品溶液：精密称取斑蝥素对照品10.40mg，置10ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液-1。
(2)斑蝥素对照品溶液：精密称取斑蝥素对照品10.45mg，置10ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置100ml量瓶中，加氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液-2。
(3)供试品溶液的制备：取本品40粒的内容物，精密称定，混匀，取约4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加氯仿60ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液置蒸发皿中，用氯仿15ml分次洗涤容器及残渣，洗液滤入同一蒸发皿中，置水浴上低温挥至约2ml，定量转移至5ml量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得；平行配制6份。
(二)测定方法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。按外标法计算本品的标示含量。其相对标准偏差(RSD)不得过8.0％。
(三)结果
数据结果见表6
表6重复性试验结果
(四)结论
实验结果表明：重复性的供试品平均含量为9.19μg/粒，RSD为3.11％，小于8.0％，符合规定。
5.2中间精密度
(1)溶液配制
照2.3.4.1重复性项下溶液配制方法进行配制。
(2)测定方法
由2名试验人员，在不同的时间进行重复性项下试验，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。按外标法计算本品的标示含量。按外标法计算本品的标示含量及其相对标准偏差，并计算2名试验人员及12份测定结果的相对标准偏差，均不得过6.0％。
(三)结果
数据结果见表7
表7中间精密度试验结果
(四)结论
实验结果表明：中间精密度的中间精密度的供试品平均含量为8.74μg/粒，中间精密度的RSD％为4.45，精密度的RSD％为4.46，符合规定。
试验例6溶液稳定性
(一)溶液配制
(1)考察用对照品溶液的配制：取系统适用性项下的对照品溶液，置于气相小瓶中。
(2)供试品溶液的配制：取重复性项下的供试品溶液1，置于气相小瓶中。
(二)测定方法
取上述的对照品溶液与供试品溶液，于室温条件下放置0、2、4、6、8、10、12、24小时，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。记录色谱图的峰面积，峰面积的相对标准偏差不得过8.0％。
(三)结果
数据结果见表8～9。
表8对照品溶液稳定性试验结果
表9供试品溶液稳定性试验结果
(四)结论
实验结果表明：在室温条件下，对照品溶液在24小时内所测得的斑蝥素相对标准偏差为2.94％，及供试品溶液在22小时内所测得的斑蝥素未出峰，样品少了，供试品在20小时内所测得的斑蝥素相对标准偏差为5.25％，符合要求(规定：RSD≤8.0％)，结果表明：对照品溶液室温条件下放置24小时相对稳定，供试品溶液于室温条件下放置20小时相对稳定。
试验例7耐用性
7.1溶液配制
(1)对照品溶液-1的制备：精密称取三氯甲烷对照品101mg，置200ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液。
(2)三氯甲烷对照品溶液-2：精密称取三氯甲烷对照品102mg，置200ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取3ml，置25ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；作为对照品溶液。
平行配制2份。
(3)供试品溶液的制备：取本品装量差异项下内容物约200mg，精密称定，置25ml容量瓶，加无水乙醇溶解，超声处理(功率720W，频率40kHz)30分钟，加无水乙醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得；平行配制2份。
7.2测定方法
按照下表调整色谱条件，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，测定，即得。记录色谱图的峰面积，峰面积的相对标准偏差不得过11％。
按外标法计算本品的标示含量及其相对标准偏差并进行比较。
(三)结果
数据结果见表10
表10斑蝥素含量耐用性试验结果
(四)结论
实验结果表明：斑蝥素含量测定检测条件不同柱、不同色谱柱进样口温度，不同检测器温度斑蝥素平均含量9.46μg/粒，RSD值2.99小于11％，符合要求。
试验例8样品中斑蝥素含量的检测
复方斑蝥胶囊三批成品(192050062、192050072、192050082)，分别按“供试品溶液制备”项下的方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定三氯甲烷。测定结果见表11。
表11斑蝥素含量的含量测定结果
经过上述三批样品检测，斑蝥素含量结果平行稳定。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
对照品溶液的制备：以斑蝥素为对照品，配制成对照品溶液；
供试品溶液的制备：取复方斑蝥胶囊配制成供试品溶液；
分别将对照品溶液和供试品溶液注入气相色谱仪，得到色谱图；
根据对照品和供试品的色谱图，经过计算得到供试品溶液中的斑蝥素含量；
其中，所述气相色谱仪的色谱条件如下：
色谱柱是以(50％-苯基)-甲基硅酮为固定液，涂布浓度为3～5％；
柱温为160～180℃；
H2流速为28～32mL/min,空气流速为280～320mL/min，尾吹气N2流速为28～32mL/min。
2.根据权利要求1所述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法如下：称取斑蝥素适量，加入氯仿，配制成每1mL含0.02～0.03mg斑蝥素，得到对照品溶液。
3.根据权利要求1或2所述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法如下：取复方斑蝥胶囊的内容物3～5g置于容器中，加入氯仿55～65mL，加热回流0.5～1.5小时，放冷，滤过，滤液置于蒸发皿中，用氯仿洗涤容器及滤渣，洗液加入所述蒸发皿中，置于水浴上蒸干至1.5～2.5mL，加氯仿至4.5～5.5mL，即得。
4.根据权利要求1-3任一项所述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，其特征在于，分别精密吸取所述对照品溶液和供试品溶液各1.8～2.2μL，注入气相色谱仪，得到色谱图。
5.根据权利要求1-4任一项所述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，其特征在于，所述色谱柱的柱长为28～32m，柱径为0.300～0.350mm，膜厚为1.7～1.9μm，优选柱长为30m，柱径为0.320mm，膜厚为1.8μm。
6.根据权利要求1-5任一项所述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，其特征在于，所述气相色谱仪的进样口温度为195～205℃，优选为200℃；检测器温度为245～255℃，优选为250℃。
7.根据权利要求1-6任一项所述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，其特征在于，所述气相色谱仪的分流比为1：18～22，优选为1：20。
8.根据权利要求1-7任一项所述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，其特征在于，所述气相色谱仪的柱流量为13～17mL/min，优选为15mL/min。
9.根据权利要求1-8任一项所述的复方斑蝥胶囊中斑蝥素的含量检测方法，其特征在于，所述气相色谱仪的色谱条件：理论塔板按斑蝥素峰计算应不低于2000。
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