CN116121158A - 一种生产（r,r）-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株及应用 - Google Patents

一种生产（r,r）-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生产(R,R)‑2,3‑丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株及应用，属于基因工程技术领域。所述基因重组工程菌株MW‑BS1，该菌株的保藏编号为CCTCC No：2022436，保藏日期为2022年04月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国、武汉、武汉大学，命名为Bacillus subtilis MW‑BS1。本发明通过控制发酵过程中的代谢流方向，获得不同的目标产物(R,R)‑2,3‑丁二醇、乙偶姻或四甲基吡嗪，相较于单一产物的工程菌株，本发明利用一种菌株实现多种产物的生产，且产量可观，在工业化生产上可以降低菌种成本，提高生产效益。

Description

一种生产(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株及应用
技术领域
本发明涉及一种生产(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株及应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
2，3-丁二醇(2,3-BD)是一种重要的平台化合物，在食品、化工、制药、能源领域具有广泛的应用价值，微生物发酵生产是现代生物化工的重要方向。2,3-丁二醇分子中含有两个手性碳原子，因此存在三种光学异构体，分别是(2R,3R)-2，3-丁二醇、(2S,3S)-2,3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇。单一构型的(R,R)-2,3-丁二醇除了具有混合构型2,3-丁二醇的功能外，还是合成手性试剂和手性配体的重要前体，在高价值手性液晶材料、农药和医药中间体非对称合成方面具有特殊应用。传统化学合成法获得的2,3-丁二醇是三种光学异构体的混合物，不但存在过程繁琐、产率低、污染环境等问题，而且由于不同立体构型2,3-丁二醇的物理化学性质相近，手性拆分成本十分高昂，难以实现大规模低成本生产。因此，微生物方法合成单一构型的(R,R)-2,3-丁二醇具有重要研究意义。
乙偶姻通常情况下作为食品添加剂，增加食品的香气，是一种天然的食品添加剂；在医药行业，乙偶姻由于具有不同的构型可以用来合成稀有药物及作为药物中间体，另外，乙偶姻在烟草、塑料工业、化学工业及涂料工业都有广泛的应用，乙偶姻作为一种重要的四碳平台化合物，被美国能源部列为优先进行工艺开发利用的30种平台化合物之一。
四甲基吡嗪(TTMP)，俗称川芎嗪，是植物川芎中的一种活性生物碱，同时还是一种医药和农药行业中间体，被用来合成多种用途广泛的药物，其本身也具有临床药理作用，在治疗心脑血管疾病、抗癌、抗自由基方面有显著的效果，被广泛的应用于临床治疗。此外，四甲基吡嗪还是一种天然存在的香气物质，天然存在可可豆、咖啡、花生等坚果类物质、豆类制品和肉类等物质中，具有烘烤香气，被食品加工行业广泛采用。
2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪作为天然的食品添加剂，可以添加到白酒中用于调节白酒风味，提升白酒品质。随着石油产品的日益耗尽，微生物发酵法可以以廉价的原料生产2,3-丁二醇和乙偶姻及四甲基吡嗪，并且生物发酵法对环境的污染较小，符合绿色化工的要求，因此，人们越来越重视微生物发酵法生产(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻及四甲基吡嗪。
发明内容
本发明的目的是提供一种生产(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株及应用，本发明通过构建双高效启动子表达载体，并连接(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶的编码基因bdhA(Gene ID:939490)，再导入到枯草芽孢杆菌BS1(来源：齐鲁工业大学生物工程学部微生物酶技术实验室)中，以此来过表达(R,R)-2，3-丁二醇脱氢酶(BDH)，获得能够生产(R,R)-2，3-丁二醇和乙偶姻的基因工程菌株，同时还通过代谢工程技术对代谢网络进行优化，优化生产培养基及发酵条件，提高(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的产量和转化率。
本发明生产(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株MW-BS1，该菌株的保藏编号为CCTCC No：2022436，保藏日期为2022年04月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国、武汉、武汉大学，命名为Bacillus subtilis MW-BS1。
进一步，本发明获得的基因重组工程菌株MW-BS1在制备(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪中的应用。
更进一步的，所述基因重组工程菌株MW-BS1分别生产(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的发酵条件如下：
温度35℃-38℃，优选为37℃，pH 6.2-6.7，优选为6.5，接种量为10％，v/v，通气量为1L/min，200r/min条件下恒温培养，发酵期间从第12h开始加入无菌葡萄糖溶液，然后每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵周期为3天，生产(R,R)-2,3-丁二醇；
温度35℃-38℃，优选为37℃，pH 7.2-7.8，优选为7.5，接种量为10％，v/v，通气量为1.5L/min，400r/min条件下恒温培养，发酵期间从第12h开始加入无菌葡萄糖溶液，然后每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵周期为5天，生产乙偶姻；
温度35℃-38℃，优选为37℃，pH 7.2-7.8，优选为7.5，接种量10％，v/v，通气量为1.5L/min，400r/min条件下恒温培养，发酵期间从第12h开始加入无菌葡萄糖溶液，然后每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵至第120h，添加25g/L(NH4)2HPO4，发酵温度升至42℃，发酵周期为10天，生产四甲基吡嗪。
本发明还包括通过上述发酵获得的(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
在枯草芽孢杆菌中，(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶可以催化其代谢途径中的乙偶姻向(R,R)-2,3-丁二醇转化，并且(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶是一种双向催化酶，在不同的条件下可实现两种物质的互相转化，而乙偶姻又是四甲基吡嗪的前体物质，在枯草芽孢杆菌细胞内，乙偶姻可与铵根离子一系列反应生成四甲基吡嗪。发明人在枯草芽孢杆菌BS1中过表达(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶，提高其表达量和酶活性，通过研究在不同条件下(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶的催化方向，来实现控制发酵过程中的代谢流方向，可以针对性的获得所需的目标产物。
(R,R)-2,3-丁二醇脱氢酶在弱酸低氧条件下可催化乙偶姻向(R,R)-2,3-丁二醇转化，使工程菌的代谢通路流向(R,R)-2,3-丁二醇。而在弱碱高氧等条件下可催化(R,R)-2,3-丁二醇向乙偶姻转化，使工程菌的代谢通路流向乙偶姻。在基因重组工程菌株MW-BS1的发酵中，在弱酸低氧等条件下以较短的发酵周期获得较高产量的(R,R)-2,3-丁二醇。当需要以乙偶姻为主要产物时，可以在弱碱高氧等条件下延长发酵周期以获得较高产量的乙偶姻，而当需要以四甲基吡嗪为主要产物时，仅需要在乙偶姻发酵周期末期补加底物，同时改变条件就可以改变工程菌株的代谢流向，最终获得较高产量的四甲基吡嗪。然而，传统工程菌株只能在单一条件下进行发酵生产单一产物，发酵条件苛刻，菌株管理成本高，相较于目前单一产物的工程菌株，本发明利用一种菌株可以实现多种产物的生产，即只需要改变发酵条件与发酵模式，就可以控制细菌的代谢来获得(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻或四甲基吡嗪，且产量可观，在工业化生产上可以降低菌种成本，提高生产效益。
附图说明
图1为基因重组质粒PBE980a-Plaps-bdhA的构建过程；
图2为启动子基因Plaps与基因bdhA的琼脂糖核酸电泳图，其中，泳道1为核酸电泳Marker；泳道2为启动子基因Plaps；泳道3为基因bdhA；
图3为基因重组工程菌株MW-BS1中bdhA基因过表达的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为蛋白电泳Marker；泳道2为BS1蛋白；泳道3、4、5为MW-BS1蛋白；
图4为采用毛细管气相色谱法检测(R,R)-2,3-丁二醇的检测报告图；
图5为采用毛细管气相色谱法检测乙偶姻的检测报告图；
图6为采用毛细管气相色谱法检测四甲基吡嗪的检测报告图；
图7为发酵重组菌株生产过程中四甲基吡嗪晶体图；
图8为四甲基吡嗪晶体图；
图9为毛细管气相色谱法检测四甲基吡嗪结晶的检测报告图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的了解本发明，但不可以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
下述实施例以枯草芽孢杆菌BS1为例阐述本发明的一种生产(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的工程菌株的构建方法。
本实验所使用的培养基如下：
LB液体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，调节pH至7.0，121℃高压灭菌20min。
LB固体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，20g/L琼脂，调节pH至7.0，121℃高压灭菌20min。
发酵培养基：酵母粉5g/L，玉米浆干粉20g/L，尿素5g/L，KH2PO46g/L,K2HPO4 14g/L，柠檬酸三钠8g/L，葡萄糖70g/L，调节pH至7.0，115℃高压灭菌20min。
本申请试验中PCR体系如表1所示。
实施例1：
一种生产(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株，其构建方法如下：
首先将启动子Plaps(SEQ ID NO.7)片段与载体质粒PBE980a连接，构建具有Plaps和P43(SEQ ID NO.8)两个启动子的双启动子表达载体PBE980a-Plaps；在枯草芽孢杆菌BS1基因组中克隆(R,R)-2，3-丁二醇脱氢酶(BDH)的编码基因bdhA(使用引物bdhA-F/bdhA-R，即SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，基因bdhA的核苷酸序列为SEQ ID NO.9，并将该基因片段连接到上述构建的双启动子表达载体PBE980a-Plaps上，完成构建过表达基因bdhA的重组质粒PBE980a-Plaps-bdhA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.7，构建过程如图1所示。将重组质粒PBE980a-Laps-bdhA转化到大肠杆菌感受态DH5α中，培养后提取质粒进行基因测序。基因测序正确无误后将该重组质粒转化到枯草芽孢杆菌BS1中，完成构建基因重组工程菌株MW-BS1。
培养基因重组工程菌株MW-BS1，通过菌落PCR验证重组质粒是否转化到宿主菌中(使用引物PBE980a-P-F/PBE980a-P-R；PBE980a-bdhA-F/PBE980a-bdhA-R，即SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6)，结果如图2所示，第一泳道为核酸电泳Marker；第二泳道为启动子Plaps；第三泳道为目的地基因bdhA；所有条带清晰且大小正确，证明重组质粒成功转化入宿主菌株。
培养基因重组工程菌株MW-BS1和原始菌株，提取粗蛋白液进行SDS-PAGE电泳，结果如图3所示，第一泳道为蛋白电泳Marker；第二泳道为原始菌株粗蛋白；第三、四、五泳道均为MW-BS1粗蛋白，在37.9KD处均有较明显条带，且符合BDH大小。
本发明获得的基因重组工程菌株MW-BS1，该菌株的保藏编号为CCTCCNo：2022436，保藏日期为2022年04月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国、武汉、武汉大学，命名为Bacillus subtilis MW-BS1。
表1 50μL PCR扩增体系
质粒提取：根据质粒提取试剂盒。
DNA或PCR产物纯化回收：根据核酸纯化回收试剂盒。
无缝克隆：根据无缝克隆试剂盒ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit。
B.subtilis感受态制备和转化：采用Spizizen法制备B.subtilis感受态。
实施例2
利用初始菌株BS1和基因重组工程菌株MW-BS1进行(R,R)-2,3-丁二醇和乙偶姻的摇瓶培养：
(1)菌株活化：将菌株BS1、菌株MW-BS1分别接种于固体LB培养基上，37℃恒温培养24h。
(2)种子液培养：挑取上述步骤LB固体培养基中的单菌落，接种于50ml液体LB培养基中，37℃200r/min恒温培养8h。
(3)摇瓶培养：取14mL的种子液接种于200mL发酵培养基中，37℃200r/min恒温培养。发酵期间从第24h开始，每12小时补加10mL 40g/L的无菌葡萄糖溶液。
实施例3
利用初始菌株BS1和基因重组工程菌株MW-BS1进行(R,R)-2,3-丁二醇的5L发酵罐培养发酵：
(1)菌株活化：将菌株BS1、菌株MW-BS1分别接种于固体LB培养基上，37℃恒温培养24h。
(2)种子液培养：挑取上述步骤LB固体培养基中的单菌落，接种于50ml液体LB培养基中，37℃200r/min恒温培养8h。
(3)5L发酵罐发酵：取200mL的种子液接种于有1.8L发酵培养基的发酵罐中，温度为37℃，pH 6.5，通气量1L/min，200r/min恒温培养。发酵期间从第12h开始，每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵周期3天。
实施例4
利用初始菌株BS1和基因重组工程菌株MW-BS1进行乙偶姻的5L发酵罐培养发酵：
(1)菌株活化：将菌株BS1、菌株MW-BS1分别接种于固体LB培养基上，37℃恒温培养24h。
(2)种子液培养：挑取上述步骤LB固体培养基中的单菌落，接种于50ml液体LB培养基中，37℃200r/min恒温培养8h。
(3)5L发酵罐发酵：取200mL的种子液接种于有1.8L发酵培养基的发酵罐中，温度为37℃，pH 7.5，通气量1.5L/min，400r/min恒温培养。发酵期间从第12h开始，每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵周期5天。
实施例5
利用初始菌株BS1和基因重组工程菌株MW-BS1进行四甲基吡嗪的5L发酵罐培养发酵：
(1)菌株活化：将菌株BS1、菌株MW-BS1分别接种于固体LB培养基上，37℃恒温培养24h。
(2)种子液培养：挑取上述步骤LB固体培养基中的单菌落，接种于50ml液体LB培养基中，37℃200r/min恒温培养8h。
(3)5L发酵罐发酵：取200mL的种子液接种于有1.8L发酵培养基的发酵罐中，温度为37℃，pH为7.5，通气量1.5L/min，400r/min恒温培养。发酵期间从第12h开始，每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液。发酵至第120h，补加(NH4)2HPO4至25g/L,发酵温度升至42℃，发酵周期10天。
试验例1发酵液中(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的检测(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的测定：
采用毛细管气相色谱法同时检测(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪，仪器型号为日本岛津气相色谱仪GC-2030，色谱柱规格：柱长30m，内径0.32mm，液膜厚度0.5μm。检测条件：柱温80℃，进样器和检测器温度250℃，进样量0.1μL，采用FID检测器。发酵液经离心去除菌体后，以乙酸乙酯为萃取剂1:1等体积震荡萃取，取上层萃取液用0.22μm有机滤膜过滤，气相色谱仪检测样品，(R,R)-2,3-丁二醇检测报告如图4，乙偶姻检测报告如图5，四甲基吡嗪检测报告如图6；产量检测结果如表2-表5。
表2摇瓶培养初始菌株BS1和基因重组工程菌株MW-BS1的(R,R)-2,3-丁二醇与乙偶姻的产量(单位：g/L)
由表2可知，在摇瓶发酵实验中，基因重组工程菌株MW-BS1在发酵24个小时后，(R,R)-2,3-丁二醇的产量加快增长，发酵至第96h时，(R,R)-2,3-丁二醇到达最高产量53.5g/L，而原始菌株的产量为36.5g/L，基因重组工程菌株MW-BS1的(R，R)-2,3-丁二醇生产率相较原始菌株提高了46.6％。继续发酵，(R,R)-2,3-丁二醇的含量逐渐降低，乙偶姻的产量明显上升，发酵至240h，基因重组工程菌株MW-BS1生产的乙偶姻的浓度为58.1g/L，而原始菌株的乙偶姻的产量为45.2g/L，基因重组工程菌株MW-BS1的乙偶姻的产量相较原始菌株提高了28.5％。
表3基因重组工程菌株MW-BS1 5L发酵罐发酵生产(R,R)-2,3-丁二醇的产量(单位：g/L)
由表3可知，在5L发酵罐培养工程菌株MW-BS1生产(R,R)-2,3-丁二醇的实验中，发酵条件为温度为37℃，pH为6.5，接种量为10％，v/v，通气量为1L/min，200r/min条件下恒温培养，每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液。在发酵至第72h时，到达(R,R)-2,3-丁二醇的最高产量84.6g/L，作为副产物的乙偶姻最高仅为8.6g/L。
表4基因重组工程菌株MW-BS1 5L发酵罐发酵生产乙偶姻的产量(单位：g/L)
由表4可知，在5L发酵罐培养工程菌株MW-BS1生产乙偶姻的实验中，
发酵条件为温度为37℃，pH为7.5，接种量为10％，v/v，通气量为1.5L/min，400r/min条件下恒温培养，每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液。发酵至第120h时，乙偶姻到达最高产量82.2g/L，此时作为副产物的(R,R)-2,3-丁二醇最高仅为11.2g/L。
表5基因重组工程菌株MW-BS1 5L发酵罐发酵四甲基吡嗪的产量(单位：g/L)
由表5可知，在5L发酵罐培养基因重组工程菌株MW-BS1生产四甲基吡嗪的实验中，发酵条件为温度为37℃，pH为7.5，接种量10％，v/v，通气量为1.5L/min，400r/min条件下恒温培养，每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵至第120h，添加(NH4)2HPO4至25g/L，发酵温度升至42℃。在发酵至120h时，乙偶姻的产量为71.4g/L，补加(NH4)2HPO4之后，乙偶姻与铵根离子开始合成四甲基吡嗪，直至第240h时，发酵罐内壁会附着大量四甲基吡嗪晶体，如图7所示，四甲基吡嗪晶体如图8所示，发酵结束后，收集晶体通过气相色谱法检测晶体成分，检测报告如图9所示，确定晶体为较高纯度的四甲基吡嗪，综合所有产生的四甲基吡嗪，产量最高到达34.8g/L。

Claims (9)

1.一种生产(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪的基因工程菌株，其特征在于，所述基因重组工程菌株MW-BS1，该菌株的保藏编号为CCTCCNo：2022436，保藏日期为2022年04月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国、武汉、武汉大学，命名为Bacillus subtilis MW-BS1。
2.如权利要求1所述基因重组工程菌株在制备(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻和四甲基吡嗪中的应用。
3.根据权利要求1所述基因重组工程菌株，其特征在于，所述基因重组工程菌株生产(R,R)-2,3-丁二醇的发酵条件如下：
温度35℃-38℃，pH 6.2-6.7，接种量为10％，v/v，通气量为1L/min，200r/min条件下恒温培养，发酵期间从第12h开始加入无菌葡萄糖溶液，然后每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵周期为3天，生产(R,R)-2,3-丁二醇。
4.根据权利要求3所述基因重组工程菌株，其特征在于，发酵温度为37℃，pH为6.5。
5.根据权利要求1所述基因重组工程菌株，其特征在于，所述基因重组工程菌株生产乙偶姻的发酵条件如下：
温度35℃-38℃，pH 7.2-7.8，接种量为10％，v/v，通气量为1.5L/min，400r/min条件下恒温培养，发酵期间从第12h开始加入无菌葡萄糖溶液，然后每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵周期为5天，生产乙偶姻。
6.根据权利要求5所述基因重组工程菌株，其特征在于，发酵温度为37℃，pH为7.5。
7.根据权利要求1所述基因重组工程菌株，其特征在于，所述基因重组工程菌株生产四甲基吡嗪的发酵条件如下：
温度35℃-38℃，pH 7.2-7.8，接种量10％，v/v，通气量为1.5L/min，400r/min条件下恒温培养，发酵期间从第12h开始加入无菌葡萄糖溶液，然后每12小时补加100mL 60g/L的无菌葡萄糖溶液，发酵至第120h，补加(NH4)2HPO4至25g/L，发酵温度升至42℃，发酵周期为10天，生产四甲基吡嗪。
8.根据权利要求5所述基因重组工程菌株，其特征在于，发酵温度为37℃，pH为7.5。
9.如权利要求3-8任一项所述基因重组工程菌株发酵获得的(R,R)-2,3-丁二醇、乙偶姻或四甲基吡嗪。
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Assignee: CHANGYI RUIHAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

Assignor: Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences)

Contract record no.: X2023980051324

Denomination of invention: A genetically engineered strain for the production of (R, R) -2,3-butanediol, acetoin, and tetramethylpyrazine and its application

Granted publication date: 20230912

License type: Common License

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