CN116083582A - Sdc2基因单一特定位点甲基化检测的应用、肠癌诊断试剂及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因诊断技术领域,尤其是涉及SDC2基因单一特定位点甲基化检测的应用、肠癌诊断试剂及系统。本发明首次将选自SDC2基因的四个单一特定位点:chr8:96494187、chr8:96493501、chr8:96493590或chr8:96494113的甲基化作为生物标志物用于检测、预测或监测结直肠癌发展产品的制备中,具有显著的测灵敏度和特异性,可有效检测结直肠癌及结直肠进展期腺瘤患者。
Description
技术领域
本发明涉及基因诊断技术领域,尤其是涉及SDC2基因单一特定位点甲基化检测的应用、肠癌诊断试剂及系统。
背景技术
近年来,DNA甲基化被认为是最有前景的肿瘤标志物。DNA甲基化是指,在DNA甲基化转移酶作用下使DNA胞嘧啶5号碳位共价键结合一个甲基基团,从而改变DNA的功能。
诸多研究证实,DNA甲基化参与调控肿瘤的发生发展全过程。正常细胞中抑癌基因启动子区域处于低甲基化状态,下游DNA正常表达抑癌蛋白,而肿瘤细胞中启动子区域表现为高甲基化,抑制了抑癌基因正常表达,所以学界普遍认为DNA甲基化改变往往是先于肿瘤的发生,或是最早能检测到的肿瘤相关指标。
现有技术已利用检测基因的甲基化水平来检测结直肠癌或其早期病变,然而现有技术均是对目标基因的一段区域内的平均甲基化水平进行检测,存在操作繁琐、灵敏度和特异性不高等问题。例如Niu F et al.2017,对SDC2基因进行甲基化检测,在特异性为93.3%的条件下,对肠癌的检测灵敏度仅为81.1%。
鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于,提供将选自SDC2基因的单一特定位点甲基化作为生物标志物应用于制备检测、预测或监测结直肠癌发展的产品中,同时提供配套的结直肠癌诊断试剂、结直肠癌诊断试剂盒和检测、预测或监测结直肠癌发展的系统,以缓解了现有技术中具有广泛推广潜力的结直肠癌早筛技术的空白。
为了解决上述技术问题,实现上述目的,本发明提供以下技术方案:
第一方面,本发明提供SDC2基因单一特定位点甲基化在制备检测、预测或监测结直肠癌发展产品中的应用,所述SDC2基因单一特定位点选自chr8:96494187、chr8:96493501、chr8:96493590或chr8:96494113。
第二方面,本发明提供结直肠癌诊断试剂,所述结直肠癌诊断试剂包含用于检测SDC2基因中的单一特定位点chr8:96494187、chr8:96493501、chr8:96493590或chr8:96494113甲基化水平的特异性引物对和探针,特异性引物对包括正向引物和捕获引物;
其中检测SDC2基因特定位点chr8:96494187的第一正向引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列,第一捕获引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列;
检测SDC2基因特定位点chr8:96493501的第二正向引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列,第二捕获引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列;
检测SDC2基因特定位点chr8:96493590的第三正向引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列,第三捕获引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列;
检测SDC2基因特定位点chr8:96494113的第四正向引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列,第四捕获引物具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
优选地,还包括反向引物。
进一步优选地,所述反向引物具有SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。
在可选的实施方式中,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96494187的第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,第一捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示,第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
在可选的实施方式中,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96493501的第二正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,第二捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示,第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
在可选的实施方式中,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96493590的第三正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,第三捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示,第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。
在可选的实施方式中,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96494113的第四正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,第四捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示,第四探针的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。
在可选的实施方式中,所述探针序列标记有至少一个荧光基团;所述荧光基团选自FAM、VIC、CY5、HEX、JOE、ROX、TAMRA、TET、TexasRed或CY3。
第三方面,本发明提供结直肠癌或结直肠进展期腺瘤诊断试剂盒,所述试剂盒包括前述实施方式任一项所述的结直肠癌诊断试剂。
第四方面,本发明提供检测、预测或监测结直肠癌发展的系统,所述系统包括:
检测模块,用于使用前述实施方式任一项所述试剂或前述实施方式所述试剂盒检测已知样本和待测样本基因甲基化水平;
比对模块,用于根据已知样本的甲基化状态数据确定判断参考数据,将检测模块获得的待测样本的SDC2基因甲基化状态与判断参考数据对比,根据二者的接近程度输出结直肠癌发展的评估结果;
所述参考数据来源于以下至少一种人群:(a)非结直肠癌患者,(b)结直肠癌患者。
在可选的实施方式中,所述待测样本来源于检测人群的粪便、组织或体液。
优选地,所述待测样本来源于结直肠癌进展期腺瘤。
本发明首次将选自SDC2基因的四个单一特定位点:chr8:96494187、chr8:96493501、chr8:96493590或chr8:96494113的甲基化作为生物标志物用于检测、预测或监测肿瘤发展产品的制备中,具有显著的测灵敏度和特异性,可有效检测肿瘤患者。
本发明还提供了用于肿瘤诊断的试剂、试剂盒和系统,用于检测包含四个位点chr8:96494187、chr8:96493501、chr8:96493590和chr8:96494113在内的任一位点甲基化,能够实现对SDC2基因定点甲基化的检测,与现有技术中检测SDC2基因片段甲基化的方法相比,无需进行甲基化转化,显著地提高了检测效率,同时降低了检测成本。
本发明发现,检测目标基因的某个与结直肠癌或结直肠进展期腺瘤相关的单一特定位点的甲基化水平相较于检测目标基因的一段区域内的平均甲基化水平,对检测、预测或监测结直肠癌发展具有更高的灵敏度和特异性,这可能是因为检测多甲基化位点的平均甲基化水平会在一定程度上掩盖单位点的检测性能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的单一特定位点用于肠癌诊断取得的ROC曲线;
图2为本发明实施例2提供的单一特定位点用于肠癌诊断取得的ROC曲线;
图3为本发明实施例3提供的单一特定位点用于肠癌诊断取得的ROC曲线;
图4为本发明实施例4提供的单一特定位点用于肠癌诊断取得的ROC曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此,以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
应注意到:相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项,因此,一旦某一项在一个附图中被定义,则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。此外,术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述,而不能理解为指示或暗示相对重要性。
SDC2基因的全长区域为chr8:96493169~96495331,基因数据来源于:UCSCGenome Browser on Human Dec.2013(GRCh38/hg38)Assembly。
在一次具体的实施方式中,第一方面,本发明提供了SDC2基因单一特定位点甲基化在制备检测、预测或监测结直肠癌发展产品中的应用,所述SDC2基因单一特定位点选自chr8:96494187、chr8:96493501、chr8:96493590或chr8:96494113。
第二方面,本发明提供结直肠癌诊断试剂,所述结直肠癌诊断试剂包含用于检测SDC2基因中的单一特定位点chr8:96494187、chr8:96493501、chr8:96493590或chr8:96494113甲基化水平的特异性引物对和探针,特异性引物对包括正向引物和捕获引物;
其中检测SDC2基因特定位点chr8:96494187的第一正向引物的核苷酸序列包含:CCCCGAGCCTGAGCC(SEQ ID No.1),第一捕获引物的核苷酸序列包含:GCACACGAATCCGGAGCCCGAGC(SEQ ID No.2);
检测SDC2基因特定位点chr8:96493501的第二正向引物的核苷酸序列包含:GGGAAGAAA AGAGCATAGAGGAG(SEQ ID No.3),第二捕获引物的核苷酸序列包含:GTTTTCTCAGTCCTTT(SEQ ID No.4);
检测SDC2基因特定位点chr8:96493590的第三正向引物的核苷酸序列包含:GGCGGCAGTGTGACTC(SEQ ID No.5),第三捕获引物的核苷酸序列包含:GTGTAATCCTGTAGGAA(SEQ ID No.6);
检测SDC2基因特定位点chr8:96494113的第四正向引物的核苷酸序列包含:CAGCGATTGCGGCTCAGGCT(SEQ ID No.7),第四捕获引物的核苷酸序列包含:GCCCCCGAGCCCCGCA(SEQ ID No.8)。
需要说明的是,所述正向引物和捕获引物包含的核苷酸序列对应的核苷酸片段为本发明提供的可行引物对中最短的核心核苷酸片段,该核心核苷酸片段为实现本发明定点检测SDC2基因四个位点所必需的。本领域技术人员能够在该核心核苷酸片段的基础上,根据实际需求构建实际应用的不同的引物对组合。
优选地,还包括反向引物。
进一步优选地,所述反向引物的核苷酸序列包含:GCCTGTCAGCCAACGGTATTCATC(SEQ ID No.9)。
需要说明的是,所述反向引物为一段通用引物序列,可以为任意序列,原则上满足基本的引物设计原则即可。该序列GC含量合理,不与人类基因组有明显结合,且与大量的特异性引物没有明显的交叉结合。例如上述SEQ ID No.9既不与上述四对引物存在交叉结合,同时与人类基因组也不存在明显结合。
可以理解的是,针对上述四个位点中某一特定位点的甲基化修饰,所述特异性引物对能够扩增包含该甲基化位点在内的一段基因区域。据此,本领域技术人员能够以检测该特定甲基化位点为目的,在上述扩增区域内对探针进行设计和选择,因此,下面所述的四条探针并非针对上述特定位点的特定探针,而是仅作为示例,不应当理解为对本发明保护范围的限缩,本领域技术人员能够在设计的其他引物对的基础上,参考下面四条探针的设计原则,进行常规设计,得到的探针序列均应理解为本发明个的保护范围。
在可选的实施方式中,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96494187的第一正向引物的核苷酸序列为CCCCGAGCCTGAGCC(SEQ ID No.1),第一捕获引物的核苷酸序列为GCCTGTCAGCCAACGGTATTCATCtttGCACACGAATCCGGAGCCCGAGCCCCGAGC CCG(SEQ ID No.10),第一探针的核苷酸序列为CAATCGCTGCGGTACTC(SEQ IDNo.11)。
在可选的实施方式中,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96493501的第二正向引物的核苷酸序列为GGGAAGAAAAGAGCATAGAGGAG(SEQ ID No.3),第二捕获引物的核苷酸序列为GCCTGTCAGCCAACGGTATTCATCtttGTTTTCTCAGTCCTTTGAAGGGA AAGAGAAAAGACAACG(SEQ IDNo.12),第二探针的核苷酸序列为CCTTTCTCTCCCCAC(SEQ ID No.13)。
在可选的实施方式中,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96493590的第三正向引物的核苷酸序列为GGCGGCAGTGTGACTC(SEQ ID No.5),第三捕获引物的核苷酸序列为GCCTGTCAGCCAACGGTATTCATCtttGTGTAATCCTGTAGGAATTGG GCGACTGGGGAGA(SEQ ID No.14),第三探针的核苷酸序列为CCAGATAAACCCGGGAGA(SEQ ID No.15)。
在可选的实施方式中,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96494113的第四正向引物的核苷酸序列为CAGCGATTGCGGCTCAGGCT(SEQ ID No.7),第四捕获引物的核苷酸序列为GCCTGTCAGCCAACGGTATTCATCtttGCCCCCGAGCCCCGCACACGAATCCGGAGC AGAGTAC(SEQ IDNo.16),第四探针的核苷酸序列为CCCGAGTCCCCGAGC(SEQ ID No.17)。
在可选的实施方式中,所述探针序列标记有至少一个荧光基团;所述荧光基团选自FAM、VIC、CY5、HEX、JOE、ROX、TAMRA、TET、TexasRed或CY3。
第三方面,本发明提供结直肠癌或结直肠进展期腺瘤诊断试剂盒,所述试剂盒包括前述实施方式任一项所述的结直肠癌或结直肠进展期腺瘤诊断试剂。
应当理解的是,上述试剂盒还包括任选耗材,用于保证试剂盒检测顺利实施的必备的随试剂盒一起包装,包括但不限于取液装置、反应容器、清洗装置和混液装置等,本领域技术人员可以根据试剂盒耗材的改进而进行适应性的更新选择,在不对检测结果起到决定性影响的情况下,上述适应性选择均应理解为本发明的保护范围。
第四方面,本发明提供检测、预测或监测结直肠癌发展的系统,所述系统包括:
检测模块,用于使用前述实施方式任一项所述试剂或前述实施方式所述试剂盒检测已知样本和待测样本基因甲基化水平;
比对模块,用于根据已知样本的甲基化状态数据确定判断参考数据,将检测模块获得的待测样本的SDC2基因甲基化状态与判断参考数据对比,根据二者的接近程度输出结直肠癌发展的评估结果;
所述参考数据来源于以下至少一种人群:(a)非结直肠癌患者,(b)结直肠癌患者。
在可选的实施方式中,所述待测样本来源于检测人群的粪便、组织或体液。
优选地,所述待测样本来源于结直肠癌进展期腺瘤。
需要说明的是,本领域技术人员能够根据实际需求的不同,对本发明所述的检测数据与参考数据的接近程度的确定方法进行选择,所述实际需求包括检测速度、检测通量或检测准确度等,所述确定方法可以是对比检测数据和参考数据对应的甲基化评价参数(包括但不限于扩增曲线的△Ct值或△△Ct值等),得出检测数据和参考数据的匹配程;还可以是根据参考数据构建预测模型,使用预测模型对检测数据进行分析。
下面结合附图,对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下,下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例提供了一组用于检测SDC2基因单一特定位点chr8:96494187甲基化的引物对和探针,所述引物对和探针信息如下:
需要说明的是,本实施例中所述探针还存在其他选择,满足其靶位位于扩增区域chr8:96494118~96494187范围内即可,其选用的修饰荧光基团还可以为VIC、CY5、HEX、JOE、ROX、TAMRA、TET、TexasRed或CY3。
实施例2
与实施例1相比区别在于,本实施例提供了一组新的用于检测位点chr8:96493501甲基化的引物对和探针,其扩增区域为chr8:96493412~96493501,具体序列信息如下:
实施例3
与实施例1相比区别在于,本实施例提供了一组新的用于检测位点chr8:96493590甲基化的引物对和探针,其扩增区域为chr8:96493591~96493662,具体序列信息如下:
实施例4
与实施例1相比区别在于,本实施例提供了一组新的用于检测位点chr8:96494113甲基化的引物对和探针,其扩增区域为chr8:96494114~96494187,具体序列信息如下:
实验例
本实验例入组结直肠癌患者粪便样本108例,进展期腺瘤粪便样本31例,使用实施例1~4提供的引物对和探针,分别按照以下方法用于肠癌的早期筛查:
1.提取粪便中人源DNA:
采用任何方式得到粪便中的人源DNA即可,本示例中使用如北京天漠科技开发有限公司的土壤粪便基因组DNA提取试剂盒(货号:TD601),具体操作如下:
(1)取2g新鲜粪便样本到粪便采集管内,采集管内预先装有10ml的保存液(北京天漠科技开发有限公司,货号:TR110),充分混匀,取600μL的混合液到裂解管中,在涡旋仪上最大速下振荡5分钟以上混匀,将裂解管放到离心机里,在≥10000xg下离心1分钟。
(2)将所得上清400μL加到3号柱F中,3号柱F套在一个收集管里,在8000xg的离心力下离心1分钟,丢弃过滤柱,添加1200μL的基因组DNA裂解液到上一步的收集管中充分混匀,将2号柱套在一个新的收集管里,吸取700μL混合液加到2号柱中,在10000xg下离心1分钟,倒掉收集管中废液。
(3)重复步骤(2)直至用完所有混合液。
(4)将2号柱套在一个新的收集管内,添加200μL的基因组DNA洗涤液1到2号柱中,在≥10000xg下离心1分钟,添加500μL的基因组DNA洗涤液2到2号柱中,在≥10000xg下离心1分钟。
(5)重复步骤(4),将收集管中的废液倒掉,并将2号柱套回收集管中,在≥10000xg下离心2分钟,尽量除去洗涤液,以免洗涤液中残留乙醇抑制下游反应,将2号柱移至干净的1.5ml离心管中直接添加120μL的基因组DNA洗脱液到柱基质上,室温下放置2~5分钟,在≥10000xg下离心1分钟来洗脱基因组DNA,将抑制物去除柱套在一个收集管内,添加600μL的抑制物去除液,在≥8000xg下离心3分钟。
(6)将洗脱的基因组DNA放入制备好的抑制物去除柱内,抑制物去除柱套在一个干净的1.5ml离心管内,并在16000xg下离心3分钟。
(7)重复步骤(6),得到的基因组DNA可直接后续甲基化检测实验。
2.酶切反应
酶切反应体系:
充分混匀,瞬离后置于恒温孵育器中,30℃20min,65℃30min,4℃保存;反应后产物即为甲基化检测的模板。
3.甲基化检测:
PCR反应体系:
组成 | 主要组分 |
PCR反应液1 | Buffer、dNTP、引物、探针 |
PCR反应液2 | Taq DNA聚合酶 |
阳性对照 | 甲基化阳性基因组 |
(1)将PCR反应液1、PCR反应液2、引物和阳性对照取出,解冻后,振荡30s,瞬时离心30s,防止试剂残留在管盖。
(2)反应液配制:根据扩增检测的样本数量计算需要分装的反应液管数。
组成 | 主要组分 |
PCR反应液1 | 1.8μL |
引物 | 9.6μL |
PCR反应液2 | 0.6μL |
(3)分装:将配制的反应液按照12μL/管分装至反应管/反应板中。
(4)加样:向已分装好反应液的各反应管分别按顺序依次加入处理好的阴性对照NC、酶切反应产物、阳性对照PC各8μL。加样后,盖上管盖或封膜后,短暂离心30s,立即进行PCR扩增反应。
PCR扩增按照下表设置PCR扩增程序并运行。
PCR扩增程序:
结果判断:
阳性对照,阴性对照,内控合格之后,则可按照下述CT值判读标准对样本检测结果进行判定。
采用上述实施例1~4提供引物对和探针对入组结直肠癌患者粪便样本108例,进行验证检测,结果如下:
chr8:96494187单点检测结果
chr8:96493501单点检测结果
chr8:96493590单点检测结果
chr8:96494113单点检测结果
相应的ROC曲线如图1~4所示,分别对应单一特定位点chr8:96494187、chr8:96493501、chr8:96493590和chr8:96494113的检测结果,由图1~4和上表所示的本发明提供的SDC2四个单点甲基化位点检测均取得了90%以上的灵敏度和94%以上的特异性,可见,本发明提供的上述4个单一特定位点的甲基化检测均能够用于区分肠癌与正常的有效标志物。
SDC2四个单点甲基化位点灵敏度和特异性分析结果汇总如下:
位点信息 | 基因 | 灵敏度 | 特异性 | AUC |
chr8:96494187 | SDC2 | 92.96% | 97.30% | 0.949 |
chr8:96493501 | SDC2 | 91.55% | 97.30% | 0.947 |
chr8:96493590 | SDC2 | 90.14% | 94.59% | 0.932 |
chr8:96494113 | SDC2 | 91.55% | 94.59% | 0.924 |
采用上述实施例1~4提供引物对和探针对入组31例进展期腺瘤样本进行验证检测,检出率结果如下:
位点信息 | 基因 | 阳性检出率 |
chr8:96494187 | SDC2 | 61.29% |
chr8:96493501 | SDC2 | 35.48% |
chr8:96493590 | SDC2 | 51.61% |
chr8:96494113 | SDC2 | 51.61% |
对比例1
本对比例采用常规的重亚硫酸盐转化及荧光定量PCR检测方法对SDC2基因进行检测,具体步骤如下:
1.粪便中人源DNA纯化和富集
300μL粗粪便DNA中加入等体积6mol/L的异硫氰酸胍溶液(含10pmol生物素化的SDC2和actin捕获探针),室温孵育4h。
加入50μL链霉亲和素修饰的磁珠M-280(Thermo Fisher Scinetific)室温孵育1h。
用1×洗涤液(1.0mol/L NaCl,5mmol/L Tris-HCl pH 7.5,and 0.5mmol/L EDTA)清洗磁珠/核酸杂交复合物2次,用50μL无核酸酶水(含20ng/μL转移RNA)将磁珠上的核酸洗脱下来;目标基因SDC2基因和内参基因β-actin(ACTB)就同时被捕获到一个反应中。
2.重亚硫酸盐转化
DNA重亚硫酸盐转化使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research),根据产品操作说明书进行操作。取50μL捕获后粪便DNA阳标加入反应中,最后用15μL TE缓冲液洗脱。
3.实时荧光定量甲基化特异性PCR
采用实时荧光定量甲基化特异性PCR用来检测粪便DNA样本。在SDC2基因的CpG岛位置设计引物和探针,ACTB基因作为重亚硫酸转化和DNA投入量的内参基因。
引物和探针序列:
PCR反应体系如下:5μL粪便DNA样本,25μL反应液(各引物浓度400nmol/L,探针浓度200nmol/L,5mmol/L Mg2+,400μmol/L dNTPs,0.1U/μL GoTaq Hot Star4tPolymerase(Promegea),及1×缓冲液)。PCR反应体系在Lightcycler96仪器上进行检测。PCR反应程序:95℃ 5min;
粪便DNA样本,根据检测结果计算SDC2甲基化的量。
对比例对上述入组结直肠癌患者粪便样本检测的灵敏度和特异性分析结果为灵敏度81.1%,特异性93.3%。对入组进展期腺瘤样本进行验证检测的检出率为58.2%。相对于对比例,实施例1~4对结直肠癌患者具有更高的检测灵敏度和特异性。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.SDC2基因单一特定位点甲基化在制备检测、预测或监测结直肠癌发展产品中的应用,所述SDC2基因单一特定位点选自chr8:96494187、chr8:96493501、chr8:96493590或chr8:96494113。
2.结直肠癌诊断试剂,其特征在于,所述结直肠癌诊断试剂包含用于检测SDC2基因中的单一特定位点chr8:96494187、chr8:96493501、chr8:96493590或chr8:96494113甲基化水平的特异性引物对和探针,特异性引物对包括正向引物和捕获引物;
其中检测SDC2基因特定位点chr8:96494187的第一正向引物具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列,第一捕获引物具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列;
检测SDC2基因特定位点chr8:96493501的第二正向引物具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列,第二捕获引物具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列;
检测SDC2基因特定位点chr8:96493590的第三正向引物具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列,第三捕获引物具有SEQ ID No.6所示的核苷酸序列;
检测SDC2基因特定位点chr8:96494113的第四正向引物具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列,第四捕获引物具有SEQ ID No.8所示的核苷酸序列;
优选地,还包括反向引物;
进一步优选地,所述反向引物具有SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的结直肠癌诊断试剂,其特征在于,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96494187的第一正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,第一捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示,第一探针的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。
4.根据权利要求2所述的结直肠癌诊断试剂,其特征在于,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96493501的第二正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示,第二捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示,第二探针的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
5.根据权利要求2所述的结直肠癌诊断试剂,其特征在于,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96493590的第三正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示,第三捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示,第三探针的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。
6.根据权利要求2所述的结直肠癌诊断试剂,其特征在于,用于检测SDC2基因特定位点chr8:96494113的第四正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,第四捕获引物的核苷酸序列如SEQ ID No.16所示,第四探针的核苷酸序列如SEQ ID No.17所示。
7.根据权利要求2~6任一项所述的结直肠癌诊断试剂,其特征在于,所述探针序列标记有至少一个荧光基团;所述荧光基团选自FAM、VIC、CY5、HEX、JOE、ROX、TAMRA、TET、TexasRed或CY3。
8.结直肠癌或结直肠进展期腺瘤诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求2~7任一项所述的结直肠癌诊断试剂。
9.检测、预测或监测结直肠癌发展的系统,其特征在于,所述系统包括:
检测模块,用于使用权利要求2~7任一项所述试剂或权利要求8所述试剂盒检测已知样本和待测样本基因甲基化水平;
比对模块,用于根据已知样本的甲基化状态数据确定判断参考数据,将检测模块获得的待测样本的SDC2基因甲基化状态与判断参考数据对比,根据二者的接近程度输出结直肠癌发展的评估结果;
所述参考数据来源于以下至少一种人群:(a)非结直肠癌患者,(b)结直肠癌患者。
10.根据权利要求9所述的系统,其特征在于,所述待测样本来源于检测人群的粪便、组织或体液;
优选地,所述待测样本来源于结直肠进展期腺瘤。
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Application publication date: 20230509 Assignee: Mingde Henan Biotechnology Co.,Ltd. Assignor: Shanghai Huizhong Tongkang Biotechnology Co.,Ltd. Contract record no.: X2023980041677 Denomination of invention: Application of Single Specific Localization Methylation Detection of SDC2 Gene, Diagnostic Reagents and Systems for Colorectal Cancer License type: Exclusive License Record date: 20230913 |
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