CN116083551B - 用于检测人类中性粒细胞抗原基因分型的引物组合、试剂盒及方法 - Google Patents
用于检测人类中性粒细胞抗原基因分型的引物组合、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及用于检测人类中性粒细胞抗原基因分型的引物组合、试剂盒及方法。本发明针对人类粒细胞抗原HNA 1‑5系统全部11个SNP位点设计了正向引物、反向引物和延伸引物，序列如SEQ ID No:1‑22所示，应用所述引物组合检测人类中性粒细胞抗原基因分型的方法，可实现每批96个或384个样品的批量检测，高通量检测将为相关临床诊断和科研工作带来很大的便利，大大节约实验时间，且检测方法准确、稳定。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及用于检测人类中性粒细胞抗原基因分型的引物组合、试剂盒及方法。
背景技术
人类中性粒细胞抗原(Human Neutrophil Antigens，HNA)是在人类中性粒细胞粒细胞表面表达的一组糖蛋白，在同种和自身免疫中起重要作用。个体HNA抗原的差异可以导致输血后产生粒细胞抗体。目前证实HNA抗原、抗体在多种临床疾病中起重要的作用，包括新生儿同种免疫性粒细胞减少症(NIN)、自身免疫性粒细胞减少症、发热性非溶血性输血反应、输血相关性急性肺损伤(TRALI)、骨髓移植后同种免疫性粒细胞减少症、输血相关性同种免疫性粒细胞减少症、药物诱导的粒细胞减少症和粒细胞输注无效等。因此研究HNA抗原具有重要的临床意义。
人类中性粒细胞抗原定义和相关命名法由国际输血协会粒细胞免疫学工作组(ISBT GIWP)HNA命名法规范，并基于相关糖蛋白上的血清学定义表位。采用符号HNA表示人类中性粒细胞抗原，不同抗原系统用数字表示，同一糖蛋白不同的多态性则根据发现先后顺序用小写英文字母表示，如HNA-la、HNA-lb、HNA-1c等。ISBT GIWP已将14个HNA等位基因正式分配给5个HNA抗原系统。
目前HNA特异性鉴定方法主要有血清学方法和基因分型方法。血清学鉴定HNA抗原或抗体方法主要有粒细胞凝集试验、粒细胞免疫荧光试验(GIFT)、单克隆抗体特异性粒细胞抗原捕获试验(Monoclonal Antibody Immobilization of Granulocyte Antigen,MAIGA)、流式细胞术和ELISA等方法。HNA抗原系统的基因分型方法主要有PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)、实时定量PCR(RT-qPCR)、基于PCR的测序(PCR-SBT)等。
鉴定HNA抗原特异性的血清学方法尽管简单、便宜、与临床关系紧密，但存在耗时多、通量低、依赖抗血清等缺点。现主要应用的HNA抗原系统基因分型方法中：PCR-SSP法需要进行多管扩增，虽然操作简单、试剂便宜，但存在通量低、实验操作工作量大等缺点；RT-qPCR具有多重扩增的优点，但存在检测通量不高、实验检测试剂成本较高等缺点；PCR-SBT法具有能直接检测序列、发现新突变的优点，但存在检测成本高、分析相对复杂、通量不高等缺点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供用于检测人类中性粒细胞抗原基因分型的引物组合、试剂盒及方法。
第一方面，本发明提供用于检测人类中性粒细胞抗原基因分型的引物组合，检测的基因位点及对应的正向引物、反向引物和延伸引物的序列如下表所示：
第二方面，本发明提供一种用于检测人类中性粒细胞抗原基因分型的试剂盒，包括所述的引物组合。
第三方面，本发明提供应用所述引物组合检测人类中性粒细胞抗原基因分型的方法，包括以下步骤：
S1、提取待测样本DNA；
S2、以S1的DNA为模板，使用多重PCR技术扩增含有目的SNP的DNA序列，扩增引物为上述的正向引物和反向引物；
S3、扩增的PCR产物SAP处理后，利用上述的延伸引物进行单碱基延伸；
S4、获得的单碱基延伸产物，转移到SpectroCHIP芯片上，进行质谱检测，确定其基因型。
进一步的，S2中扩增体系为：超纯水0.8μL，含20mM Mg2+的10×PCR Buffer 0.5μL，25mM MgCl2 0.4μL，25mM dNTP 0.1μL，0.5μM PCR引物混合液1.0μL，5U/μL HotstarTaq酶0.2μL，20-50ng/μL的人基因组DNA溶液2.0μL。
更进一步的，S2中扩增程序为：95℃，2min；45个循环95℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min；72℃，保持5min，4℃保温。
更进一步的，S3中SAP处理体系为：超纯水1.53μL，SAP缓冲液0.17μL，SAP酶0.30μL。
更进一步的，S3中SAP处理程序为：37℃40min；85℃，5min；4℃保温。
更进一步的，S3中延伸体系为：超纯水0.62μL，PLEX Buffer缓冲液0.2μL，iPLEXTermination Mix 0.2μL，延伸引物混合液0.94μL，iPLEX Pro Enzyme酶0.04μL。
更进一步的，S3中延伸程序为：
94℃，30sec；
40个循环：94℃，5sec；(52℃，5sec；80℃，5sec)5个循环；
72℃，3min；
4℃保温。
本发明具有如下有益效果：
采用本发明的检测方法、引物和试剂盒，可以在单个PCR反应孔中对人类粒细胞抗原HNA1-5系统全部11个SNP位点进行检测，采用飞行时间质谱平台，基于核酸分子在电场中飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空中的飞行时间而获得样品分析物的精准分子量，从而检测出SNP位点信息。结合多重PCR技术、单碱基延伸技术，和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术进行分型检测，实验步骤简单，实验结果软件分析快捷方便，通过核酸质谱仪可实现每批96个或384个样品的批量检测，高通量检测将为相关临床诊断和科研工作带来很大的便利，大大节约实验时间，且检测方法准确、稳定。
附图说明
图1为HNA1-5系统11个SNP核酸质谱检测峰图(样本编号：2-19053037)。
图2为2-19053037样本HNA1_G108C SNP核酸质谱检测峰图。
图3为2-19053037样本HNA1_C114T SNP核酸质谱检测峰图。
图4为2-19053037样本HNA1_A194G SNP核酸质谱检测峰图。
图5为2-19053037样本HNA1_C233A SNP核酸质谱检测峰图。
图6为2-19053037样本HNA1_G244A SNP核酸质谱检测峰图。
图7为2-19053037样本HNA1_G316A SNP核酸质谱检测峰图。
图8为2-19053037样本HNA2_A787T SNP核酸质谱检测峰图。
图9为2-19053037样本HNA3_C451T SNP核酸质谱检测峰图。
图10为2-19053037样本HNA3_G455A SNP核酸质谱检测峰图。
图11为2-19053037样本HNA4_G230A SNP核酸质谱检测峰图。
图12为2-19053037样本HNA5_G2372C SNP核酸质谱检测峰图。
图13为48份样本HNA1_G108C SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图14为48份样本HNA1_C114T SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图15为48份样本HNA1_A194G SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图16为48份样本HNA1_C233A SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图17为48份样本HNA1_G244A SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图18为48份样本HNA1_G316A SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图19为48份样本HNA2_A787T SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图20为48份样本HNA3_C451T SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图21为48份样本HNA3_G455A SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图22为48份样本HNA4_G230A SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图23为48份样本HNA5_G2372C SNP核酸质谱检测结果聚类图。
图24为16份样本HNA核酸质谱和sanger测序检测结果对比。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实验共进行了多轮引物设计和测试，完成48例血液基因组DNA样品11个SNP位点的测试实验，并进行了一代测序验证。检测方法及结果如下所示：
1、样品准备：
48例血液样品基因组DNA提取结果如表1所示，浓度稀释到20-50ng/μL后用于后续检测实验。
表1实验样品DNA浓度纯度表
2、引物准备：
引物设计结果如表2所示。
表2正向引物、反向引物和延伸引物的序列
3、检测流程：
3.1样品准备
(1)待测DNA样本，浓度20-50ng/μL。
(2)阳性质控样本，浓度20-50ng/μL，已知HNA分型样品。
(3)阴性空白，RNase-free超纯水样品。
(4)制作样品表格，将待测的样品信息进行96孔板表格排版，样品管震荡混匀、瞬时离心后，每份样品取2μL样本转移到96孔板里。
3.2PCR扩增反应
(1)按照下表3配制PCR反应体系，可按实际体积多配制10％-20％的量。
表3PCR扩增反应混合液配制表
(2)配制完毕后，充分涡旋混匀，瞬时离心。
(3)将PCR反应体系按需要分装到8联排管中。使用排枪加入到96反应孔里，每个孔加3μL的PCR扩增反应混合液。
(4)用封口膜将96孔板密封，涡旋混匀，瞬时离心。
(5)将96板放置在PCR仪上，盖紧PCR仪上盖，运行PCR扩增程序。
PCR扩增程序如下所示：
95℃，2min；
45个循环：95℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min；
72℃，保持5min；
4℃保温。
选择反应体系5μL，启动反应程序。
(6)反应结束后，取出96孔PCR反应板，3000rpm离心1min。
3.3碱性磷酸酶(SAP)反应
(1)按照下表4配制SAP反应体系，可按实际体积多配制10％-20％的量。
表4碱性磷酸酶(SAP)反应混合液配制表
(2)配制完毕后，充分涡旋混匀，瞬时离心。
(3)将SAP反应体系按需要分装到8联排管中。使用排枪加入到96反应孔里，每个孔加2μL的碱性磷酸酶(SAP)反应混合液。
(4)用封口膜将96孔板密封，涡旋混匀，瞬时离心。
(5)将96板放置在PCR仪上，盖紧PCR仪上盖，运行SAP程序。
SAP程序如下所示：37℃，40min；85℃，5min；12℃，Hold。
选择反应体系7μL，启动反应程序。
(6)反应结束后，取出96孔PCR反应板，3000rpm离心1min。
3.4单碱基延伸反应
(1)按照下表5配制单碱基延伸反应体系，可按实际体积多配制10％-20％的量。
表5单碱基延伸反应混合液配制表
| 试剂 | 1份样本的试剂量[μL] |
| RNase-free超纯水 | 0.62 |
| iPLEX Buffer | 0.20 |
| iPLEX Termination mix | 0.20 |
| 延伸引物混合液 | 0.94 |
| iPLEX Pro Enzyme酶 | 0.04 |
| 总体积 | 2.00 |
(2)配制完毕后，充分涡旋混匀，瞬时离心。
(3)将延伸反应体系按需要分装到8联排管中。使用排枪加入到96反应孔里，每个孔加2μL的延伸反应混合液。
(4)用封口膜将96孔板密封，涡旋混匀，瞬时离心。
(5)将96板放置在PCR仪上，盖紧PCR仪上盖。
单碱基延伸反应程序如下所示：
94℃，30sec；
40个循环：94℃，5sec；(52℃，5sec；80℃，5sec)5个循环；
72℃，3min；
4℃保温。
(6)选择反应体系9μL，启动反应程序。
反应结束后，取出96孔PCR反应板，3000rpm离心1min。
(7)将96孔板瞬时离心，每孔加41μL RNase-free超纯水，用封口膜将反应板封好，3000rpm瞬时离心。
3.5上机树脂纯化、点样检测
(1)将96样品板、芯片放到核酸质谱仪器指定位置，设置参数，运行树脂纯化、点样检测程序，进行质谱实验。
(2)结果分析：使用Typer软件中的Typer Analyzer模块分析实验结果，判读完成后导出PlateData数据。
4、实验结果：
(1)对48例基因组DNA样品进行了检测，并同时进行重复1次实验。HNA1-5系统11个SNP核酸质谱检测结果如图1所示，2-19053037样本11个SNP核酸质谱检测结果依次如图2-12所示，11个SNP在48份样本中的核酸质谱检测结果聚类结果依次如图13-23所示。
48例样品一次检测成功率：
528个数据结果，全部检出，一次实验成功率100％。
(2)临床灵敏度和特异性：
对48例样品进行一代sanger测序抽检。
共测序了16例样品，每个样品检测分析11个SNP位点，共计176个结果，其中野生型结果88例，突变型结果4例，杂合型结果84例，结果见表6和图24。
表6实验检测灵敏度和特异性分析表
真阳性结果：质谱结果为非野生型，测序结果也为非野生型的结果数量为88例。
假阴性结果：质谱结果为非野生型，测序结果为野生型的结果数量为0例。
真阴性结果：质谱结果为野生型，测序结果也为野生型的结果数量为88例。
假阳性结果：质谱结果为野生型，测序结果为非野生型的结果数量为0例。
灵敏度＝真阳性结果/(真阳性结果+假阴性结果)×100％＝88/(88+0)×100％＝100％。
特异性＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)×100％＝88/(88+0)×100％＝100％。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.用于检测人类中性粒细胞抗原基因分型的引物组合，其特征在于，所述引物组合由引物对1~11这十一组引物对构成，每组引物对均由正向引物、反向引物和延伸引物组成，其中：
引物对1：检测的基因位点为HNA-1 G108C，反向引物、正向引物和延伸引物的序列依次如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:11所示；
引物对2：检测的基因位点为HNA-1 C114T，反向引物、正向引物和延伸引物的序列依次如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:12所示；
引物对3：检测的基因位点为HNA-1 A194G，反向引物、正向引物和延伸引物的序列依次如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:13所示；
引物对4：检测的基因位点为HNA-1 C233A，反向引物、正向引物和延伸引物的序列依次如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:14所示；
引物对5：检测的基因位点为HNA-1 G244A，反向引物、正向引物和延伸引物的序列依次如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:15所示；
引物对6：检测的基因位点为HNA-1 G316A，反向引物、正向引物和延伸引物的序列依次如SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:16所示；
引物对7：检测的基因位点为HNA-2 A787T，反向引物和正向引物的序列依次如SEQ IDNo:3、SEQ ID No:4所示，延伸引物的序列如SEQ ID No:17和SEQ ID No:18所示；
引物对8：检测的基因位点为HNA-3 C451T，反向引物、正向引物和延伸引物的序列依次如SEQ ID No:5、SEQ ID No:6和SEQ ID No:19所示；
引物对9：检测的基因位点为HNA-3 G455A，反向引物、正向引物和延伸引物的序列依次如SEQ ID No:5、SEQ ID No:6和SEQ ID No:20所示；
引物对10：检测的基因位点为HNA-4 G230A，反向引物、正向引物和延伸引物的序列依次如SEQ ID No:7、SEQ ID No:8和SEQ ID No:21所示；
引物对11：检测的基因位点为HNA-5 G2372C，反向引物、正向引物和延伸引物的序列依次如SEQ ID No:9、SEQ ID No:10和SEQ ID No:22所示。
2.一种用于检测人类中性粒细胞抗原基因分型的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组合。
3.应用权利要求1所述引物组合非诊断和治疗目的检测人类中性粒细胞抗原基因分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取待测样本DNA；
S2、以S1的DNA为模板，使用多重PCR技术扩增含有目的SNP的DNA序列，扩增引物为权利要求1中的正向引物和反向引物；
S3、扩增的PCR产物SAP处理后，利用权利要求1中的延伸引物进行单碱基延伸；
S4、获得的单碱基延伸产物，转移到SpectroCHIP芯片上，进行质谱检测，确定其基因型。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2中扩增体系为：超纯水0.8μL，含20mM Mg2 +的10×PCR Buffer 0.5μL，25mM MgCl2 0.4μL，25mM dNTP 0.1μL，0.5μM PCR引物混合液1.0μL，5U/μL HotstarTaq酶 0.2μL，20-50ng/μL的人基因组DNA溶液2.0μL。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，S2中扩增程序为：95℃，2min；45个循环95℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min；72℃，保持5min， 4℃保温。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，S3中SAP处理体系为：超纯水1.53μL，SAP缓冲液0.17μL，SAP酶0.30μL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S3中SAP处理程序为：37℃40 min；85℃ ，5min；4℃保温。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S3中延伸体系为： 超纯水0.62μL，PLEXBuffer缓冲液0.2μL，iPLEX Termination Mix 0.2μL，延伸引物混合液0.94μL，iPLEX ProEnzyme酶0.04μL。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，S3中延伸程序为：
94℃，30sec；
40个循环：94℃，5sec； 52℃，5sec，80℃，5sec， 5个循环；
72℃，3min；
4℃保温。
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