CN116083399B - 提高遗传转化效率的Cas9启动子、基因编辑载体、构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高遗传转化效率的Cas9基因启动子、编辑载体、构建方法和应用，属于基因编辑领域，针对CRISPR/Cas9载体的T‑DNA插入片段表达活性进行优化，降低了转基因沉默的概率，提高了西瓜中的遗传转化效率和基因编辑效率。所述编辑载体在pBSE402的基础上，对Cas9基因进行西瓜密码子优化后，以西瓜内源泛素基因的启动子去驱动Cas9基因的表达，行成新型CRISPR/Cas9基因编辑载体pBUE702C，将西瓜的遗传转化效率从1.20％提高到10.41％，同时基因编辑效率也从53.88％提高到68.11％，该载体在提高了遗传转化效率的同时，还增加了基因编辑效率，对未来加快西瓜的基因功能研究和分子育种技术具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，更具体地说是涉及提高遗传转化效率和基因编辑效率的Cas9基因启动子、编辑载体、构建方法及应用。
背景技术
CRISPR/Cas9系统是近十年内快速发展起来的新型基因组编辑技术，该系统中的CRISPR/Cas9因其设计简单，操作方便，成为当下应用最为广泛的基因编辑工具之一。CRISPR/Cas9系统包括三个重要组成部分：Cas9蛋白，sgRNA和PAM(NGG)识别位点。该系统在细胞内实现基因编辑主要分为两个过程：首先，Cas9基因和sgRNA在细胞内发生转录和翻译后，Cas9蛋白和sgRNA形成复合物，sgRNA特异性识别DNA，并引导Cas9蛋白对DNA双链进行切割；然后，DNA双链断裂激活细胞内的DNA修复机制，包括非同源末端连接和同源重组。通常情况下，非同源末端连接是细胞内的主要修复机制，往往在修复的过程中实现DNA序列的改变，从而达到定向修复基因的目的。
现在关于CRISPR/Cas9基因编辑工具的优化主要是通过优化Cas9基因和sgRNA的表达来提高在植物细胞内的编辑效率。目前，CRISPR/Cas9基因编辑工具主要是依靠以农杆菌介导的遗传转化体系，将CRISPR/Cas9载体上的T-DNA插入到植物基因组中，所以T-DNA插入后的表达高低会限制关于该工具在植物中的应用和研究。在植物的遗传转化中，转基因沉默是普遍存在的一种现象，是指当外源基因插入到植物基因组，被宿主细胞的RNA干扰机制所识别，造成该基因表达活性降低。植物的转基因沉默可分为两种，一种是转录水平的基因沉默(TGS)，主要是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的基因沉默；另外一种是转录后基因沉默(PTGS)，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性降解而使基因失活。研究表明基因的甲基化是造成转基因沉默的重要原因之一，DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，从活性甲基化合物上将甲基催化转移到其他化合物的过程，在不改变DNA序列的情况下，调节基因的表达和关闭。TGS主要与启动子序列的甲基化有关，PTGS则与编码序列的甲基化有关，同时具有重复结构的转基因常常引起DNA甲基化。研究发现在龙胆草的转基因植物中35S启动子区域会出现明显的胞嘧啶甲基化导致转基因沉默。
因此，如何提供新的启动子、基因编辑载体，以提供遗传转化效率，降低基因沉默的可能是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明将pBSE402载体中的35S启动子替换为AtUBI、ClRPS5A或ClUBI启动子，显著提高了CRISPR/Cas9基因编辑载体的转化效率和编辑效率。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种提高遗传转化效率的Cas9启动子，包括：ClRPS5启动子或ClUBI启动子，所述ClUBI启动子如SEQ ID NO.1所示，ClRPS5启动子如SEQ ID NO.2所示。
所述的启动子在构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，提高遗传转化效率中的应用。
一种提高遗传转化效率的CRISPR/Cas9基因编辑载体，针对CRISPR/Cas9载体的T-DNA插入片段表达活性进行优化，所述编辑载体在pBSE402的基础上，对Cas9基因进行西瓜密码子优化后，以其他基因启动子替换35S启动子，形成新型CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述基因编辑载体表达元件包括使用拟南芥U6启动子驱动sgRNA的表达，AtUBI、ClRPS5A或ClUBI启动子驱动Cas9基因的表达，35S启动子驱动GFP和Basta抗性基因的表达。
作为上述技术方案优选的技术方案，其他基因启动子包括AtUBI、ClRPS5A或ClUBI启动子。
作为上述技术方案优选的技术方案，所述基因编辑载体包括：pBUE702A、pBRE702C或pBUE702C。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的基因编辑载体的构建方法，过程包括：
1)对玉米Cas9基因进行西瓜密码子优化，获得优化后的西瓜密码子Cas9编码序列，如SEQ ID NO.3所示；
2)对pBSE402载体进行SbfI和SacI酶切，并连接优化后的Cas9基因片段，获得pBE702载体；
3)用限制性内切酶SwaI酶切pBE702载体，并扩增AtUBI、ClRPS5A或ClUBI基因起始密码子前1307bp、1779bp和1877bp的片段，将线性化pBE702载体与片段连接，获得pBUE702A、pBRE702C或pBUE702C基因编辑载体。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护所述的构建方法构建得到的基因编辑载体在对西瓜植物进行基因编辑，提高基因遗传转化效率和编辑效率中的应用。
应用于西瓜中的CRISPR/Cas9的基因编辑载体pBSE402，其中包括4个重要的表达元件，使用35S启动子去驱动玉米密码子优化的Cas9基因表达，拟南芥的U6启动子去驱动sgRNA表达，使用35S去驱动GFP以及Basta抗性基因的表达。pBSE402载体中使用多次35S启动子去驱动相关基因的表达，可能会增加T-DNA片段在转基因植物体内沉默的可能性。与现有技术相比，本发明设计了4个西瓜CRISPR/Cas9基因编辑载体，分别使用35S、AtUBI、ClRPS5A和ClUBI启动子去驱动西瓜密码子优化的Cas9基因的表达，其余3个重要表达元件与pBSE402载体中一致，分别命名为pBSE702、pBUE702A、pBRE702C和pBUE702C载体，在西瓜愈伤组织中比较了pBSE702、pBUE702A、pBRE702C和pBUE702C四个载体的编辑效率，在西瓜的稳定转化中比较了pBSE702、pBUE702A、pBRE702C和pBUE702C的遗传转化效率和基因编辑效率。结果表明，将pBSE702载体中的35S启动子替换为AtUBI、ClRPS5A和ClUBI启动子，都显著提高CRISPR/Cas9基因编辑载体西瓜中的遗传转化效率。使用ClUBI启动子驱动Cas9基因表达时遗传转化效率最高，达到10.42％，是使用35S启动子驱动Cas9基因的8.74倍，同时也显著提高载体的基因编辑效率，达到68.11％。研究表明，转基因植物中35S启动子区域会出现明显的胞嘧啶甲基化导致转基因沉默，本次研究中减少载体中35S启动子的使用，降低了转基因沉默的概率，提高转基因的表达活性，从而增加了遗传转化效率。因此，优化的pBUE702C载体一方面显著地提高转化效率，另一方面还显著地增强了基因编辑效率，对未来加快西瓜的基因功能研究和分子育种技术具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为不同载体在西瓜愈伤中的编辑效率图；
图2附图为不同载体在西瓜稳定遗传转化中阳性芽再生效率图；
图3附图为不同载体在西瓜稳定遗传转化中遗传转化效率图；
图4附图为不同载体在西瓜稳定遗传转化中阳性芽的明场和荧光图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
pBUE702A载体的命名规则：
B表达basta抗性；
S/U/R表示Cas9启动子，分别为35S启动子，RPS5A启动子，Ubiquitin启动子；
E表示Cas9终止子，为rbcS-E9t；
7表示Cas9为西瓜密码子优化；
02表示sgRNA的启动子，为拟南芥U6启动子
A/C表示Cas9启动子的物种来源，A为拟南芥，C为西瓜；
实验中用到的引物序列：
表1
实验中所用到的载体有pBE702中间载体，35S、AtUBI、ClRPS5A和Cl UBI启动子去驱动Cas9表达的pBSE702、pBUE702A、pBRE702C和pBUE702C4个载体，以及带有ClPDS基因靶点的pBSE702-ClPDS、pBUE702A-ClP DS、pBRE702C-ClPDS和pBUE702C-ClPDS 4个载体，共计9个载体。
实施例1载体的构建
1、构建pBE702载体
(1)根据网站(http://www.jcat.de/和https://sg.idtdna.com/pages/tools/cod on-optimization-tool)对Cas9序列进行西瓜密码子优化，将优化的Cas9片段送金唯智生物公司合成；
(2)首先用限制性内切酶SbfⅠ和SacⅠ酶切pBSE402载体，得到线性化载体；其次以ClCas9GC-F/R(如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.5所示)为引物，西瓜密码子优化Cas9的序列为模板进行PCR扩增，得到PCR产物，该PCR产物的5’和3’最末端的序列分别和线性化载体两末端序列完全一致，同时在PCR产物的5’加入SwaⅠ酶切的酶切位点；
(3)根据天根的通用型DNA纯化回收试剂盒说明书(DP214-02，天根，中国)，回收纯化上述获得的线性化载体和PCR产物后，通过Clon Expres s II One Step Cloning Kit(C112-01，诺维赞，中国)的同源重组方法进行连接；
(4)取10μL反应产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在具有卡那霉素抗性的固体LB平板上，37℃培养16h，设计引物pBE702J-F/R(如SEQ ID NO.6～SEQ IDNO.7所示)检测阳性克隆，测序正确后提取大肠杆菌质粒，获得pBE702质粒。
2、pBSE702、pBUE702A、pBRE702C和pBUE702C载体的构建：
(1)以AtRPS5A(AT3G11940)和AtUBI(AT4G05320.2)的基因序列为参考序列，在西瓜基因组(http://www.cucurbitgenomics.org/organism/21)中进行blast比对，选择同源性最高的ClRPS5A(Cla97C09G177040)和ClUBI(Cla97C03G056140)基因为西瓜中的同源基因，如SEQ ID NO.1所示；
(2)用限制性内切酶SwaⅠ酶切pBE702载体，得到线性化载体，以西瓜基因组DNA和拟南芥基因组DNA为模板，分别利用引物AtUBI-F/R(如SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.9所示)、ClRPS5A-F/R(如SEQ ID NO.10～SEQ ID NO.11所示)和ClUBI-F/R(如SEQ ID NO.12～SEQID NO.13所示)扩增AtUBI、ClRPS5A和ClUBI基因起始密码子前1307bp、1779bp和1877b的片段作为启动子序列；以pBSE402质粒为模板，用引物35S-F/R(如SE Q ID NO.14～SEQ IDNO.15所示)进行PCR扩增，获得35S的启动子序列，以上PCR产物的5’和3’最末端的序列分别和线性化载体两末端序列完全一致；
(3)纯化回收35S、AtUBI、ClRPS5A和ClUBI的启动子片段和酶切后线性化pBE702的质粒，按照ClonExpress II One Step Cloning Kit(C112-01，诺维赞，中国)的要求进行同源连接；
(4)取10μL反应产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在具有卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养16h，用引物35SJ-F/Cas9-R,At UBIJ-F/Cas9-R,ClRPS5AJ-F/Cas9-R，ClUBIJ-F/Cas9-R鉴定阳性克隆，测序正确后提取大肠杆菌质粒，得到pBSE702、pBUE702A、pBRE702C和pBUE702C载体。
3、pBSE702-ClPDS、pBUE702A-ClPDS、pBRE702C-ClPDS和pBUE702C-ClPDS载体的构建
(1)合成文献报道的西瓜PDS基因的靶点序列引物PDS-F/R，通过引物退火方法将单链引物变成DNA双链片段，按照表2的混合体系后，95℃4min后，自然冷却至室温；
表2引物退火反应体系
(2)将步骤(1)中的双链引物和pBSE702、pBUE702A、pBRE702C和pBUE702C载体通过T4酶连接，按照表3混合酶切连接体系后，37℃5h，50℃5min，80℃10min；
表3酶切连接体系
(3)将步骤(2)中的10μL反应产物通过热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在具有卡那霉素抗性的LB平板上，37℃培养16h，用引物U626-F/PDS-R(如SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.24所示)鉴定阳性克隆，测序正确后提取大肠杆菌质粒，得到pBSE702-ClPDS、pBUE702A-ClPDS、p BRE702C-ClPDS和pBUE702C-ClPDS载体。
实施例2西瓜愈伤的遗传转化
1、菌液准备
吸取2μL pBSE702-ClPDS,pBUE702A-ClPDS,pBRE702C-ClPDS和pBUE702C-ClPDS质粒分别加入100ul的农杆菌EHA105感受态细胞,冰上5min，液氮5min，37℃5min，冰上5min后加入700ul LB液体培养基，200rpm/28℃3h后，5000rpm离心5min，倒上清600μL，将剩余100μL液体与底部菌吸打混匀，涂布在50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平LB固体培养基上，28℃培养2-3天。用引物35SJ-F/Cas9-R(如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.20所示)、AtUBIJ-F/Cas9-R(如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.20所示)，ClRPS5AJ-F/Cas9-R(如SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.20所示)，ClUBIJ-F/Cas9-R(如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示)鉴定阳性菌落，分别得到农杆菌菌株pBSE702-ClPDS/EHA105，pBUE702A-ClPDS/EHA105，pBRE702C-ClPDS/EHA105和pBUE702-ClPDS/EHA105。挑取PCR验证后的单菌落至10mL 50mg/L卡那霉素和20mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃200rpm的摇床上摇至OD600在0.8左右。
2、无菌外植体准备
野生西瓜自交系‘TC’的子叶用于制备外植体。外植体制备步骤如下：(1)每个质粒准备20粒‘TC’种子，55℃温汤浸种30min，剥去种壳；(2)在超净台中将种子在75％乙醇浸泡30S、1％次氯酸钠浸泡15min，然后用灭菌水清洗5-6遍，灭菌滤纸上晾干；(3)平放到播种培养基(水+琼脂Agarpowder6.4g/L)；28℃黑暗条件下生长2-3days；(4)待种芽长至5mm左右时，在超净台中将每粒种子两片子叶切成8块，即为制备好的外植体。
3、外植体侵染
(1)取1mL OD600＝0.8的菌液加入15mL MS液中(M5194.43 g/L+蔗糖30g/L+6-BA1.5mg/L+40mg/L乙酰丁香酮)制成侵染液；(2)将制好的外植体浸泡在侵染液中，抽真空15min促进侵染；(3)弃去侵染液，取出外植体平铺在灭菌滤纸上晾干。
4、愈伤的组织培养
(1)将晾干外植体移至含有1.0mg/L 2,4-D pH为6.0的MS(M5194.43g/L+蔗糖30g/L+琼脂G32513 g/L+200mg/L TMT+1.4mg/L Basta)固体培养基中诱导愈伤组织；(2)每10天继代一次，30天后用体视荧光显微镜(MZ10F,Leica,German)挑取发荧光愈伤，每20个独立的愈伤为一个样品，每三个样品作为一次重复；(3)采用CTAB法提取愈伤DNA，用引物PDSd-F/R(如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示)扩增包含靶点PDS基因序列送深度测序(high-throughput tracking of mutations,Hi-TOM)，检测pBSE702、pBUE702A、pBRE702C、pBUE702C载体在阳性转基因愈伤中的基因编辑效率。
以西瓜ClPDS为靶标基因，构建相同靶位点的pBSE702-ClPDS，pBUE702A-ClPDS，pBRE702C-ClPDS和pBUE702C-ClPDS的4个载体，将pBSE702-ClPDS/EHA105、pBUE702A-ClPDS/EHA105和pBRE702C-ClPDS/EHA105,pBUE702-ClPDS/EHA105的农杆菌菌液侵染西瓜子叶，培养3周后，在体式荧光下挑取发荧光的愈伤组织，检测pBSE702、pBUE702A、pBRE702C和pBUE702C在ClPDS靶点的编辑效率。如图1所示，使用西瓜内源的UBI启动子去驱动Cas9的表达，其编辑效率最高，达到68.11％，而使用35S、AtUBI、ClRPS5A启动子，其编辑分别为53.88％，54.46％和51.59％。
实施例3西瓜稳定遗传转化
1、菌液准备
此步骤与西瓜愈伤的遗传转化菌液准备步骤一致
2、无菌外植体准备
此步骤和西瓜愈伤的遗传转化中无菌外植体准备步骤一致
3、外植体侵染
此步骤和西瓜愈伤的遗传转化中外植体侵染步骤一致
4、西瓜芽的组织培养
(1)将晾干的外植体移至含有6-BA 1.5mg/L pH为6.0的MS(M5194.43g/L+蔗糖30g/L+琼脂G32513 g/L+200mg/L TMT+1.4mg/L Basta)固体培养基中诱导芽生长，并统计子叶块的数量；
(2)每两周继代一次，5-6周统计转基因芽的个数。转化效率＝转基因芽的数量/侵染子叶块的数量×100％
将pBSE702-ClPDS/EHA105、pBUE702A-ClPDS/EHA105和pBRE702C-ClPDS/EHA105,pBUE702-ClPDS/EHA105的农杆菌菌液侵染西瓜子叶，在培养40天后，统计pBSE702-ClPDS,pBUE702A-ClPDS，pBRE702C-ClPDS和pBUE702C-ClPDS载体侵染西瓜子叶块后阳性芽的再生效率(转基因芽的数量/侵染子叶块的数量×100％)，培养60天后，统计不同载体的遗传转化效率(转基因植株/侵染子叶块的数量×100％)。如图2和图3所示，pBSE702-ClPDS，pBUE702A-ClPDS，pBRE702C-ClPDS和pBUE702-ClPDS载体侵染后阳性芽的再生效率分别为5.53％，11.44％，15.12％和23.18％，遗传转化效率分别为1.19％，3.59％，5.30％和10.42％。结果表明，将驱动Cas9表达的35S启动子替换为AtUBI、ClRPS5A和ClUBI启动子可以增加CRISPR/Cas9载体T-DNA插入片段的表达活性，提高遗传转化效率，使用西瓜内源的ClRPS5A和ClUBI启动子去驱动Cas9基因的表达时，遗传转化效率进一步提高。使用ClUBI启动子时遗传转化效率达到最高，为10.42％，其遗传转化效率是35S启动子的8.74倍。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (6)
1.一种提高遗传转化效率的Cas9启动子，其特征在于，所述启动子为：ClRPS5A启动子或ClUBI启动子，所述ClUBI启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ClRPS5A启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的启动子在构建CRISPR/Cas9基因编辑载体或提高西瓜基因的遗传转化效率中的应用。
3.一种提高遗传转化效率的CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，针对CRISPR/Cas9载体的T-DNA插入片段表达活性进行优化，所述编辑载体在pBSE402的基础上，对Cas9基因进行西瓜密码子优化后，形成新型CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述基因编辑载体表达元件包括使用拟南芥U6启动子驱动sgRNA的表达，ClRPS5A或ClUBI启动子驱动Cas9基因的表达；所述ClUBI启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述ClRPS5A启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的一种提高遗传转化效率的CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，使用西瓜密码子优化的Cas9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求4所述的一种提高遗传转化效率的CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于，所述基因编辑载体包括：pBRE702C或pBUE702C；所述基因编辑载体的构建方法包括下述步骤：
1）对玉米Cas9基因进行西瓜密码子优化，获得优化后的Cas9基因，其核苷酸序列如SEQID NO.3所示；
2）对pBSE402载体进行SbfI和SacI酶切，并连接优化后的Cas9基因片段，获得pBE702载体；
3）用限制性内切酶SwaI酶切pBE702载体，并扩增ClRPS5A或ClUBI基因起始密码子前1779bp和1877bp的片段，将线性化的pBE702载体与片段连接，获得pBRE702C或pBUE702C基因编辑载体；所述ClUBI启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ClRPS5A启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.权利要求5所述的基因编辑载体在提高西瓜基因遗传转化效率和基因编辑效率中的应用。
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