CN116082669B - 一种聚合物基纳米磁珠及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚合物基纳米磁珠及其制备方法，所述纳米磁珠由胺化的高分子基体微球为核心、在核心外表面包覆有磁性纳米颗粒层、在磁性纳米颗粒层外表面包覆含有功能基团的高分子聚合物层，高分子基核心微球粒径为1.5‑2μm，磁性纳米颗粒层和高分子聚合物层的直径为30‑50nm；上述纳米磁珠的颗粒均一，粒径在1.5μm‑2μm之间，平均粒径为1.6μm，夹心包覆的构造使其结构稳定，形状规整性及单分散性好，磁性纳米颗粒包覆完整不会出现泄漏，表面官能团丰度高，同时具有极好的磁响应性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米磁珠及其制法，尤其涉及一种聚合物基纳米磁珠以及纳米磁珠的制备方法。
背景技术
免疫磁珠分离技术是将免疫学反应的高度特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术，是一种具有自动化、高通量、操作简便、不侵入无毒害的体外诊断技术。传统的磁性微球是以磁性粒子为核心，外层均匀包裹高分子聚合物的结构。以磁性粒子为核心的磁珠粒径太小，沉降速度快，颗粒不均匀，制备过程耗费大量溶剂。
申请号为CN 113621112 A的专利公开了一种具有核壳结构的单分散超顺磁性微珠及其生产方法，通过反复涂覆磁性纳米颗粒和反复包被高聚物层，以提高磁珠的含磁量，改善磁响应性，然而透射电镜可以看出大量的磁性纳米粒子泄漏，并且包被的磁性纳米粒子在微球表面的分布非常不均匀，导致磁珠不均一的磁响应性和蛋白的非特异性吸附以及磁性纳米颗粒的泄漏；申请号为CN 110343218 A的专利公开了一种基于溶胀聚苯乙烯微球和高温高压下合成磁性聚合物复合材料的方法，在有机溶剂的溶胀作用下使碱性试剂和铁盐进入到微球的内部，其微球团聚粘连破损，粒径不均一，难以大批量稳定的制备，微球表面仍然裸露有大量的磁性纳米颗粒和大颗粒自组装磁性纳米颗粒，难以进一步修饰和应用。现有技术制备磁性纳米颗粒，都存在上述制备过程复杂繁琐，磁颗粒包覆不均一，表面修饰效果差，微球粒径不均匀等难以解决的问题。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种颗粒均一、磁响应性能好、分散性好、结构稳定且表面官能团丰度高的聚合物基纳米磁珠，还提供了上述纳米磁珠的制备方法。
技术方案：本发明的聚合物基纳米磁珠，由胺化的高分子基体微球为核心、在核心外表面包覆有磁性纳米颗粒层、在磁性纳米颗粒层外表面包覆含有功能基团的高分子聚合物层。
优选的，所述胺化的高分子基体微球为胺化的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球；所述含有功能基团的高分子聚合物为苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和功能单体组成的聚合物，功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、4-乙烯基苯甲酸或马来酸酐的一种或几种。
优选的，所述磁性纳米颗粒为磁性Fe3O4纳米颗粒、磁性Fe2O3纳米颗粒或沉淀磁性颗粒。
优选的，所述高分子基核心微球粒径为1.5-2μm，作为第一壳层的磁性纳米颗粒层和作为第二壳层的高分子聚合物层的厚度为30-50nm。
本发明所述纳米磁珠的制法，包括如下步骤：
(1)取甲基丙烯酸缩水甘油酯，添加苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸叔丁酯的一种或几种，溶解于乙醇，加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP10)和偶氮二异丁腈(AIBN)进行聚合反应得分散液，加入氨基改性剂反应，反应结束离心洗涤得到胺化的高分子基体微球；
(2)取制得的微球分散于水中，加入二价铁盐或三价铁盐进行反应，在氮气气氛下滴加氨水，反应结束进行磁分离和洗涤；将洗涤得到的磁性微球重新分散在经1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)活化的甲基丙烯酸水溶液中，反应后水洗磁分离得到包覆磁性纳米颗粒层的基体微球；
(3)将得到的微球分散于水和乙醇的混合溶液中，加入苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和功能单体，加入稳定剂和引发剂进行聚合反应，洗涤、磁分离后得到所述聚合物基纳米磁珠。
优选的，步骤(1)中，所述氨基改性剂为三(2-氨基乙基)胺、聚乙烯亚胺、均三苄胺或NH3·H2O中的一种。
优选的，步骤(1)中，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯与混合聚合单体的质量比为1:0.1～1，所述乙醇、混合聚合单体、聚乙烯吡咯烷酮、偶氮二异丁腈的质量比为100：10：1～2：0.1～0.2。
优选的，步骤(1)中PVP10的分子量Mw为58000；所述AIBN为经过乙醇重结晶后得到的AIBN；所述加入氨基改性剂反应，反应条件为将溶液加热至65～75℃，在250～350r/min的搅拌速度下聚合至少24h，冷却至室温。
优选的，步骤(2)中，所述微球分散于水中，得到微球分散液，微球分散液的固含量为0.5％-5％，微球上涂覆的纳米磁性颗粒占微球的质量比为15％-35％；进一步地优选为25％。
优选的，步骤(2)中，甲基丙烯酸与磁性微球的质量比为2～4:1，重新分散后，微球在甲基丙烯酸水溶液中的固含量为2％-5％。
优选的，步骤(2)中，加入FeCl3·6H2O和FeCl2·4H2O室温搅拌2-4h后升温至60-70℃，氨水滴加速率为3mL/h-9mL/h，EDC·HCl的摩尔质量与MAA相同。
优选的，步骤(3)中，所述苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和功能单体的质量比为1:0.5～1:1～1.5，上述三种聚合单体总质量与微球的质量比为2～5:1。
优选的，步骤(3)中，所述混合溶液中，微球的固含量为1～5％，稳定剂与微球的质量比为0.5～1:5，引发剂与三种聚合单体总质量的质量比为1～2:100。
优选的，步骤(3)中，所述稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮PVP10，所述引发剂为V50。
发明原理：本发明的夹心式聚合物基纳米磁珠，采用的基体微球是聚甲基丙烯酸缩水甘油酯PGMA微球，其粒径高度均一可调，使其制备的磁珠粒径也相对均一可调。基体微球作为脂类，与水的相容性极差，磁性材料难以沉积在微球表面，采用胺基物质作为基体微球表面的改性剂，一方面通过物理吸附甲基丙烯酸的负电荷，进而利于磁性纳米颗粒的共沉淀，另一方面选用的胺基物质中具有双支链或三支链，能够和环氧基团很好的开环，保证了随后的表面修饰和包被，使包被后的磁珠具有丰富的官能团和结构稳定性。
在纳米磁珠表面修饰的胺基还可增加微球在水溶液中分散性，使得采用简便的共沉淀步骤即可涂覆均匀且足够的磁性纳米颗粒，便于包覆作为第一壳层的磁性纳米颗粒层；此外，较大的基体微球保证了磁性纳米颗粒涂覆后的磁性高分子聚合物微球仅使用一定次数的离心便可除去游离的磁性纳米颗粒。同时，利用表面修饰后胺基或者羟基与活化的MAA的高反应活性，使其表面带有支化的可供反应的不饱和键，使得后续包被的磁珠表面较为光滑，因为以上修饰保证了聚合首先发生在微球的空白处即未被磁性纳米粒子覆盖的部分，然后增长的聚合物链沉积缠结在微球的其他部分，一定的支化修饰保证了增长的聚合物链向不同方向伸展缠结，即使在包被过程中不添加交联剂也能使其结构稳定。
作为第二壳层的高分子聚合物层选用的聚合单体中苯乙烯St提供一定的疏水性，利于蛋白的吸附和偶联过程；甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA不仅能提供一定的疏水性，并且可以利用环氧基团的高反应活性产生更多的功能基团，例如羟基、羧基、氨基基团，用以降低非特异性吸附、改善亲水性，进一步提高官能团密度，而且GMA与基体微球的聚合单体为同一种，相容性高，在聚合过程中可能会与未与MAA反应的胺基基团发生环氧基团的胺解反应，进一步提高聚合物链的锚定；所用功能性单体例如丙烯酸提供羧基官能团和亲水性；苯乙烯、GMA、和功能基团三种单体合理的配比使其表面包被的聚合物层厚度合适，并且在微球表面的反应速率合适，提高聚合物包被量与溶液中聚合物的比值；GMA过少苯乙烯过多的情况下，GMA溶解在溶剂中，没有足量的GMA与环氧基团发生偶联，苯乙烯无法进一步聚合上去，导致壳层很薄甚至无法形成壳层的情况；不加苯乙烯只加GMA时形成的壳层过厚，导致磁珠之间粘连严重，多个磁球会被包覆在一起致使无法使用。
所用分散体系为无毒无害的乙醇水体系，所用引发剂V50为适用于低温引发且水溶性的引发剂，使聚合反应能缓慢的发生在经过亲水性物质修饰的微球表面，所用稳定剂PVP10易于洗去，为物理吸附产生的空间位阻作用，不会与聚合物链产生接枝共聚物。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)颗粒均一，粒径在1.5μm-2μm之间，平均粒径为1.6μm，夹心包覆的构造使其结构稳定，形状规整性及单分散性好，磁性纳米颗粒包覆完整不会出现泄漏；(2)磁响应性能好，4孔拓赫新冠检测磁珠磁力架下磁响应时间不超过10s；(3)磁珠的特异性蛋白偶联量最高可达65mg。
附图说明
图1为聚合物基纳米磁珠的示意图；
图2为PGMA基体微球的SEM图；
图3为胺基物质修饰的PGMA微球的SEM图；
图4为PGMA@Fe3O4的TEM图；
图5为实施例1制得的表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA的TEM图；
图6为具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球的TEM图；
图7为具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球的倍数放大TEM图；
图8为实施例1制得的BCA试剂盒测定的BSA标准蛋白浓度-吸光度曲线；
图9为实施例2制得的表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球SEM图；
图10为实施例2制得的具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球TEM图；
图11为对比例1制得的具有核壳结构的PGMA@Fe3O4磁性复合微球TEM图；
图12为对比例2制得的无第二壳层包覆的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球TEM图；
图13为对比例3制得的无GMA包覆的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球TEM图；
图14为对比例4制得的无St共聚的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球TEM图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
本发明的聚合物基纳米磁珠，微球平均粒径为1.6μm，粒径均匀，颗粒分散，界面清晰，表面光滑；其制备方法包括如下步骤：
(1)制备PGMA高分子基体微球核心：
将除去阻聚剂的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯(St)单体(GMA:St＝6:4)溶解在纯乙醇中，加入PVP10(分子量Mw为58000)和经EtOH(乙醇)重结晶后的AIBN(偶氮二异丁腈)超声溶解20min，EtOH、单体、PVP10、AIBN的质量比为100：10：1：0.2，将溶液加热至70℃，在300r/min搅拌速度下聚合24h。冷却至室温；在所得分散液中加入TREN[三(2-氨基乙基)胺]升温至60℃搅拌12h，离心洗涤离心反复三次。
(2)包覆第一壳层：
制备PGMA@Fe3O4磁性复合微球：
取步骤(1)所得1g的微球分散于100mL水中，加入0.7gFeCl3·6H2O和0.25gFeCl2·4H2O室温搅拌3h后升温至60℃，在氮气气氛下滴加1mLNH3·H2O，所用氨水的质量浓度为2.5％，滴加速率为3mL/h，滴加结束后磁分离，洗涤，离心水洗三次直至上清液为无色，离心转速为1800r/min。
制备表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球：将1g制得的磁性微球重新分散在100mL经EDC·HCl(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐)活化的MAA(2g)的水溶液中，反应6h后水洗磁分离循环三次。
(3)包覆第二壳层：
制备具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球：
取步骤(2)中1g微球分散于100mL水和乙醇的混合溶液中，其中水和乙醇的体积比为6:4，加入总质量为3g的St、GMA和MAA，三种聚合单体的质量比为1:1:1，加入稳定剂PVP0.3g，加入引发剂V50 0.03g，升温至55℃在300r/min的搅拌速度下聚合6h，分别用无水乙醇、水洗涤磁分离三次即得本发明的聚合物基纳米磁珠。
实施例2
本发明的聚合物基纳米磁珠，微球平均粒径为1.6μm，粒径均匀，颗粒分散，界面清晰，表面光滑；实施例2改变第二壳层包覆时三种聚合单体的比值，其制备方法包括如下步骤：
(1)制备PGMA高分子基体微球核心：
将除去阻聚剂的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯(St)单体(GMA:St＝6:4)溶解在纯乙醇中，加入PVP10(分子量Mw为58000)和经EtOH(乙醇)重结晶后的AIBN(偶氮二异丁腈)超声溶解20min，EtOH、单体、PVP10、AIBN的质量比为100：10：1：0.2，将溶液加热至70℃，在300r/min搅拌速度下聚合24h。冷却至室温；在所得分散液中加入TREN[三(2-氨基乙基)胺]升温至60℃搅拌12h，离心洗涤离心反复三次。
(2)包覆第一壳层：
制备PGMA@Fe3O4磁性复合微球：取步骤(1)所得1g的微球分散于100mL水中，加入0.7gFeCl3·6H2O和0.25gFeCl2·4H2O室温搅拌3h后升温至60℃，在氮气气氛下滴加1mLNH3·H2O，所用氨水的质量浓度为2.5％，滴加速率为3mL/h，滴加结束后磁分离，洗涤，离心水洗三次直至上清液为无色，离心转速为1800r/min。
制备表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球：将1g制得的磁性微球重新分散在100mL经EDC·HCl(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐)活化的MAA(2g)的水溶液中，反应6h后水洗磁分离循环三次。
(3)包覆第二壳层：
制备具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球：
取步骤(2)中1g微球分散于100mL水和乙醇的混合溶液中，其中水和乙醇的体积比为6:4，加入总质量为2g的St、GMA和MAA，三种聚合单体的质量比为0.5:0.5:1，加入稳定剂PVP 0.2g，加入引发剂V50 0.02g，升温至55℃在300r/min的搅拌速度下聚合6h，分别用无水乙醇、水洗涤磁分离三次即得本发明的聚合物基纳米磁珠。
图9是经过表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球，可以看出小分子MAA的修饰并未改变PGMA@Fe3O4的形貌，氨水改性的微球在共沉淀磁性纳米颗粒有游离磁性纳颗粒的产生，这可能是由于形成的酯键使微球亲水性下降，磁性微球在机械摩擦的作用下掉落部分磁性物质。
图10是具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球，表面壳层结构明显，包覆良好。
实施例3
本发明的聚合物基纳米磁珠，微球平均粒径为1.6μm，粒径均匀，颗粒分散，界面清晰，表面光滑；实施例3改变第二壳层包覆时三种聚合单体的比值，其制备方法包括如下步骤：
(1)制备PGMA高分子基体微球核心：
将除去阻聚剂的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯(St)单体(GMA:St＝6:4)溶解在纯乙醇中，加入PVP10(分子量Mw为58000)和经EtOH(乙醇)重结晶后的AIBN(偶氮二异丁腈)超声溶解20min，EtOH、单体、PVP10、AIBN的质量比为100：10：1：0.2，将溶液加热至70℃，在300r/min搅拌速度下聚合24h。冷却至室温；在所得分散液中加入TREN[三(2-氨基乙基)胺]升温至60℃搅拌12h，离心洗涤离心反复三次。
(2)包覆第一壳层：
制备PGMA@Fe3O4磁性复合微球：取步骤(1)所得1g的微球分散于100mL水中，加入0.7gFeCl3·6H2O和0.25gFeCl2·4H2O室温搅拌3h后升温至60℃，在氮气气氛下滴加1mLNH3·H2O，所用氨水的质量浓度为2.5％，滴加速率为3mL/h，滴加结束后磁分离，洗涤，离心水洗三次直至上清液为无色，离心转速为1800r/min。
制备表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球：将1g制得的磁性微球重新分散在100mL经EDC·HCl(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐)活化的MAA(2g)的水溶液中，反应6h后水洗磁分离循环三次。
(3)包覆第二壳层：
制备具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球：
取步骤(2)中1g微球分散于100mL水和乙醇的混合溶液中，其中水和乙醇的体积比为6:4，加入总质量为5g的St、GMA和MAA，三种聚合单体的质量比为1:2:2，加入稳定剂PVP0.5g，加入引发剂V50 0.05g，升温至55℃在300r/min的搅拌速度下聚合6h，分别用无水乙醇、水洗涤磁分离三次即得本发明的聚合物基纳米磁珠。
实施例4
本发明的聚合物基纳米磁珠，微球平均粒径为1.6μm，粒径均匀，颗粒分散，界面清晰，表面光滑；实施例4改变制备高分子基体微球时采用的改性剂，其制备方法包括如下步骤：
(1)制备PGMA高分子基体微球核心：
将除去阻聚剂的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯(St)单体(GMA:St＝6:4)溶解在纯乙醇中，加入PVP10(分子量Mw为58000)和经EtOH(乙醇)重结晶后的AIBN(偶氮二异丁腈)超声溶解20min，EtOH、单体、PVP10、AIBN的质量比为100：10：1：0.2，将溶液加热至70℃，在300r/min搅拌速度下聚合24h。冷却至室温；在所得分散液中加入PEI(聚乙烯亚胺)升温至60℃搅拌12h，离心洗涤离心反复三次。
(2)包覆第一壳层：
制备PGMA@Fe3O4磁性复合微球：取步骤(1)所得1g的微球分散于100mL水中，加入0.7gFeCl3·6H2O和0.25gFeCl2·4H2O室温搅拌3h后升温至60℃，在氮气气氛下滴加1mLNH3·H2O，所用氨水的质量浓度为2.5％，滴加速率为3mL/h，滴加结束后磁分离，洗涤，离心水洗三次直至上清液为无色，离心转速为1800r/min。
制备表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球：将1g制得的磁性微球重新分散在100mL经EDC·HCl(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐)活化的MAA(2g)的水溶液中，反应6h后水洗磁分离循环三次。
(3)包覆第二壳层：
制备具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球：
取步骤(2)中1g微球分散于100mL水和乙醇的混合溶液中，其中水和乙醇的体积比为6:4，加入总质量为3g的St、GMA和MAA，三种聚合单体的质量比为1:1:1，加入稳定剂PVP100.3g，加入引发剂V50 0.03g，升温至55℃在300r/min的搅拌速度下聚合6h，分别用无水乙醇、水洗涤磁分离三次即得本发明的聚合物基纳米磁珠。
实施例5
本发明的聚合物基纳米磁珠，微球平均粒径为1.6μm，粒径均匀，颗粒分散，界面清晰，表面光滑；实施例5改变制备高分子基体微球时采用的改性剂，其制备方法包括如下步骤：
(1)制备PGMA高分子基体微球核心：
将除去阻聚剂的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯(St)单体(GMA:St＝6:4)溶解在纯乙醇中，加入PVP10(分子量Mw为58000)和经EtOH(乙醇)重结晶后的AIBN(偶氮二异丁腈)超声溶解20min，EtOH、单体、PVP10、AIBN的质量比为100：10：1：0.2，将溶液加热至70℃，在300r/min搅拌速度下聚合24h。冷却至室温；在所得分散液中加入NH3·H2O升温至60℃搅拌12h，离心洗涤离心反复三次。
(2)包覆第一壳层：
制备PGMA@Fe3O4磁性复合微球：取步骤(1)所得1g的微球分散于100mL水中，加入0.7gFeCl3·6H2O和0.25gFeCl2·4H2O室温搅拌3h后升温至60℃，在氮气气氛下滴加1mLNH3·H2O，所用氨水的质量浓度为2.5％，滴加速率为3mL/h，滴加结束后磁分离，洗涤，离心水洗三次直至上清液为无色，离心转速为1800r/min。
制备表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球：将1g制得的磁性微球重新分散在100mL经EDC·HCl(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐)活化的MAA(2g)的水溶液中，反应6h后水洗磁分离循环三次。
(3)包覆第二壳层：
制备具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球：
取步骤(2)中1g微球分散于100mL水和乙醇的混合溶液中，其中水和乙醇的体积比为6:4，加入总质量为3g的St、GMA和MAA，三种聚合单体的质量比为1:1:1，加入稳定剂PVP100.3g，加入引发剂V50 0.03g，升温至55℃在300r/min的搅拌速度下聚合6h，分别用无水乙醇、水洗涤磁分离三次即得本发明的聚合物基纳米磁珠。
对比例1
对比例1与实施例1相比，制备无第二包覆层的纳米磁珠，其制备方法包括如下步骤：
(1)制备PGMA高分子基体微球核心：
将除去阻聚剂的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯(St)单体(GMA:St＝6:4)溶解在纯乙醇中，加入PVP10(分子量Mw为58000)和经EtOH(乙醇)重结晶后的AIBN(偶氮二异丁腈)超声溶解20min，EtOH、单体、PVP10、AIBN的质量比为100：10：1：0.2，将溶液加热至70℃，在300r/min搅拌速度下聚合24h。冷却至室温；在所得分散液中加入TREN[三(2-氨基乙基)胺]升温至60℃搅拌12h，离心洗涤离心反复三次。
(2)包覆第一壳层：
制备PGMA@Fe3O4磁性复合微球：取步骤(1)所得1g的微球分散于100mL水中，加入0.7gFeCl3·6H2O和0.25gFeCl2·4H2O室温搅拌3h后升温至60℃，在氮气气氛下滴加1mLNH3·H2O，所用氨水的质量浓度为2.5％，滴加速率为3mL/h，滴加结束后磁分离，洗涤，离心水洗三次直至上清液为无色，离心转速为1800r/min，制备表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球：将1g制得的磁性微球重新分散在100mL经EDC·HCl(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐)活化的MAA(2g)的水溶液中，反应6h后水洗磁分离循环三次，得到对比例1的纳米磁珠。图11为对比例1制得的具有核壳结构的PGMA@Fe3O4磁性复合微球TEM图，从图中可以看出磁性微球表面无高分子包覆层。
对比例2
对比例2与实施例1相比，高分子基体微球表面改性剂为对氨基苯甲酸，其制备方法包括如下步骤：
(1)制备PGMA高分子基体微球核心：
将除去阻聚剂的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯(St)单体(GMA:St＝6:4)溶解在纯乙醇中，加入PVP10(分子量Mw为58000)和经EtOH(乙醇)重结晶后的AIBN(偶氮二异丁腈)超声溶解20min，EtOH、单体、PVP10、AIBN的质量比为100：10：1：0.2，将溶液加热至70℃，在300r/min搅拌速度下聚合24h。冷却至室温；在所得分散液中加入对氨基苯甲酸升温至60℃搅拌12h，离心洗涤离心反复三次。
(2)包覆第一壳层：
制备PGMA@Fe3O4磁性复合微球：取步骤(1)所得1g的微球分散于100mL水中，加入0.7gFeCl3·6H2O和0.25gFeCl2·4H2O室温搅拌3h后升温至60℃，在氮气气氛下滴加1mLNH3·H2O，所用氨水的质量浓度为2.5％，滴加速率为3mL/h，滴加结束后磁分离，洗涤，离心水洗三次直至上清液为无色，离心转速为1800r/min。(3)包覆第二壳层：
制备具有核壳结构的羧基化PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球：
取步骤(2)中1g微球分散于100mL水和乙醇的混合溶液中，其中水和乙醇的体积比为6:4，加入总质量为3g的St、GMA和MAA，三种聚合单体的质量比为1:1:1，加入稳定剂PVP100.3g，加入引发剂V50 0.03g，升温至55℃在300r/min的搅拌速度下聚合6h，分别用无水乙醇、水洗涤磁分离三次即得对比例2的纳米磁珠。羧基物质的改性是微球带负电荷，MAA不能依靠静电作用吸附在微球表面，GMA的环氧也无法发生偶联作用使得包覆不成功。图12为对比例2制得的无第二壳层包覆的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球TEM图；从图12可以看出微球表面无高分子包覆层，这是因为对氨基苯甲酸修饰后，微球表面带负电荷，使得MAA的共聚物难以吸附和成功包覆。
对比例3
对比例3与实施例1相比，改变第二壳层包覆时三种聚合单体的比值，其制备方法包括如下步骤：(1)制备PGMA高分子基体微球核心：
将除去阻聚剂的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯(St)单体(GMA:St＝6:4)溶解在纯乙醇中，加入PVP10(分子量Mw为58000)和经EtOH(乙醇)重结晶后的AIBN(偶氮二异丁腈)超声溶解20min，EtOH、GMA、PVP10、AIBN的质量比为100：10：1：0.2，将溶液加热至70℃，在300r/min搅拌速度下聚合24h。冷却至室温；在所得分散液中加入TREN[三(2-氨基乙基)胺]升温至60℃搅拌12h，离心洗涤离心反复三次。
(2)包覆第一壳层：
制备PGMA@Fe3O4磁性复合微球：取步骤(1)所得1g的微球分散于100mL水中，加入0.7gFeCl3·6H2O和0.25gFeCl2·4H2O室温搅拌3h后升温至60℃，在氮气气氛下滴加1mLNH3·H2O，所用氨水的质量浓度为2.5％，滴加速率为3mL/h，滴加结束后磁分离，洗涤，离心水洗三次直至上清液为无色，离心转速为1800r/min。
制备表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球：将1g制得的磁性微球重新分散在100mL经EDC·HCl(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐)活化的MAA(2g)的水溶液中，反应6h后水洗磁分离循环三次。
(3)包覆第二壳层：
制备具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球：
取步骤(2)中1g微球分散于100mL水和乙醇的混合溶液中，其中水和乙醇的体积比为6:4，加入总质量为3g的St和MAA，两种聚合单体的质量比为1.5:1.5，加入稳定剂PVP100.3g，加入引发剂V50 0.03g，升温至55℃在300r/min的搅拌速度下聚合6h，分别用无水乙醇、水洗涤磁分离三次即得对比例3的纳米磁珠。图13为对比例3制得的无GMA包覆的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球TEM图，从图中可以看出没有GMA参与共聚，微球表面包覆第二壳层不明显，可能只有部分MAA依靠静电吸引在微球表面发生聚合，微球之间界面不清晰。
对比例4
对比例4与实施例1相比，第二壳层包覆时不添加苯乙烯，其制备方法包括如下步骤：
(1)制备PGMA高分子基体微球核心：
将除去阻聚剂的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和苯乙烯(St)单体(GMA:St＝6:4)溶解在纯乙醇中，加入PVP10(分子量Mw为58000)和经EtOH(乙醇)重结晶后的AIBN(偶氮二异丁腈)超声溶解20min，EtOH、单体、PVP10、AIBN的质量比为100：10：1：0.2，将溶液加热至70℃，在300r/min搅拌速度下聚合24h。冷却至室温；在所得分散液中加入TREN[三(2-氨基乙基)胺]升温至60℃搅拌12h，离心洗涤离心反复三次。
(2)包覆第一壳层：
制备PGMA@Fe3O4磁性复合微球：取步骤(1)所得1g的微球分散于100mL水中，加入0.7gFeCl3·6H2O和0.25gFeCl2·4H2O室温搅拌3h后升温至60℃，在氮气气氛下滴加1mLNH3·H2O，所用氨水的质量浓度为2.5％，滴加速率为3mL/h，滴加结束后磁分离，洗涤，离心水洗三次直至上清液为无色，离心转速为1800r/min。
制备表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球：将1g制得的磁性微球重新分散在200mL经EDC·HCl(1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐)活化的MAA(2g)的水溶液中，反应6h后水洗磁分离循环三次。
(3)包覆第二壳层：
制备具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球：
取步骤(2)中1g微球分散于100mL水和乙醇的混合溶液中，其中水和乙醇的体积比为6:4，加入总质量为3g的GMA和MAA，三种聚合单体的质量比为1.5:1.5，加入稳定剂PVP100.3g，加入引发剂V50 0.03g，升温至55℃在300r/min的搅拌速度下聚合6h，分别用无水乙醇、水洗涤磁分离三次即得本发明的聚合物基纳米磁珠。图14为对比例4制得的无St包覆的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球TEM图，微球表面高分子层明显，但是微球之间界面不明显，存在粘连现象。
图2是制得的PGMA基体微球的SEM图，从图中可以看出，微球粒径在1.5μm-2μm之间，平均粒径为1.6μm，粒径均匀。
图3是胺基化改性后的SEM图，从图中可以看出改性后的微球粒径和形貌没有发生变化，颗粒均匀分散，界面清晰，表面光滑。
图4是制得的PGMA@Fe3O4磁性复合微球的SEM图，从图中可以看出因为表面胺基化的改性作用，仅仅使用简单的共沉淀过程就可使得磁性纳米颗粒牢牢的均匀的涂覆在微球的表面，表面粗糙但是并无大颗粒的磁性纳米颗粒，利于后续的表面包被。经过简单的离心洗涤后，游离的磁性纳米颗粒边可以彻底除去。微球界面清晰，无明显的团聚现象，分散性良好。
图5是经过表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球，可以看出小分子MAA的修饰并未改变PGMA@Fe3O4的形貌，同时亲水性基团的引入使得微球的分散性进一步增强。
图6和图7是制备的具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球，从图7可以看出，高分子聚合物明显包被到微球表面，厚度均匀；图6可以看出微球的球形度良好，表面形成致密的包覆层。
图9是经过表面修饰的PGMA@Fe3O4@MAA磁性复合微球，可以看出小分子MAA的修饰并未改变PGMA@Fe3O4的形貌，氨水改性的微球在共沉淀磁性纳米颗粒有游离磁性纳颗粒的产生，这可能是由于形成的酯键使微球亲水性下降，磁性微球在机械摩擦的作用下掉落部分磁性物质。
图10是具有核壳结构的PGMA@Fe3O4@Polymer磁性复合微球，表面壳层结构明显，包覆良好。除特殊说明附外，其余步骤所得微球的电镜图片与实施例1无差别。
实施例1制得的磁珠用BCA试剂盒测得BSA蛋白的偶联率为65mg/g。偶联方法参照市售BCA试剂盒说明，具体步骤为：
特异性偶联量的测量：
总吸附量的测量：取1mg的磁珠加入到1mL的离心管中，用1mL pH为6.5的MES[2-(N-吗啡啉)乙磺酸)]缓冲溶液洗涤两次，加入20μL 50mg/mL的EDC·HCl溶液和20μL 30mg/mL NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)和960μLMES溶液在室温下活化30min，活化过程在摇床中进行。活化完成后磁分离，将溶液除去，加入1mLpH为7.2-7.4的PBS(磷酸盐缓冲溶液)润洗两次，除去未反应的EDC·HCl和NHS。加入1mL浓度为1mg/mL的BSA溶液(1mgBSA溶于1mLPBS缓冲溶液中)在摇床中反应1.5h，磁分离，取10μL上清液与10μLPBS缓冲液加入到96孔板中，加入200μL的BCA工作液，在室温下静置2h后用酶标仪测量562nm的吸光度，与测得的BSA标准曲线对照计算出上清液的BSA含量，进而计算出微球偶联的蛋白量。同时做三组取其平均值。
非特异性吸附量的测量：取1mg的磁珠加入到1mL的离心管中，用1mLpH为6.5的MES[2-(N-吗啡啉)乙磺酸)]缓冲溶液洗涤两次，加入1000μL MES溶液在室温下处理30min处理过程同样在摇床中进行。处理完成后磁分离，将溶液除去，加入1mL pH为7.2-7.4的PBS(磷酸盐缓冲溶液)润洗两次，置换MES缓冲溶液。加入1mL浓度为1mg/mL的BSA溶液(1mgBSA溶于1mLPBS缓冲溶液中)在摇床中处理1.5h，磁分离，取10μL上清液与10μL PBS缓冲液加入到96孔板中，加入200μL的BCA工作液，在室温下静置2h后用酶标仪测量562nm的吸光度，与测得的BSA标准曲线对照计算出上清液的BSA含量，进而计算出微球非特异性吸附的蛋白量。同时做三组取其平均值。
BSA标准曲线的绘制方法参照市售BCA试剂盒说明，具体步骤为：
分别测不同BSA标准品浓度下的吸光度，取0.5mg/mL的BSA标准品溶液(0.5mgBSA溶于1mLPBS缓冲溶液中)，按照0、1、2、4、8、12、16、20μL的体积加入96孔板中，不足20μL的用PBS缓冲溶液不足至20μL，各孔中加入200μL的BCA工作液，室温静置2h后用酶标仪测定在562nm波长下的吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
磁珠特异性偶联BSA的量＝BSA总吸附量-BSA非特异性吸附量
表1各实施例和对比例所制备微球偶联BSA的能力对比
从表1可以看出伯胺基化修饰的微球利于MAA的偶联，从而利于高分子层的包覆。另外在此发明技术下包覆第二高分子层时，单体与微球的质量比为3：1时包覆效果最好，偶联蛋白能力最高。在包覆第二高分子层时，单体比例也有较大的影响，合适的苯乙烯含量影响着微球BSA蛋白的非特异性吸附量，合适的甲基丙烯酸影响着微球表面的羧基密度和微球的分散性，合适的GMA影响着单体和基体微球的相容性，影响着苯乙烯与甲基丙烯酸共聚的效率；因此在实施例1的制备方案下可以得到分散性良好的磁珠，偶联BSA蛋白的效果最好。
图8是为实施例1制得的BCA试剂盒测定的BSA标准蛋白浓度-吸光度曲线，参照图8测定各微球的BSA化学偶联量。
Claims (6)
1.一种聚合物基纳米磁珠，其特征在于，所述纳米磁珠由胺化的高分子基体微球为核心，在核心外表面包覆有磁性纳米颗粒层，在磁性纳米颗粒层外表面包覆含有功能基团的高分子聚合物层，所述胺化的高分子基体微球为胺化的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯微球；所述含有功能基团的高分子聚合物为苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和功能单体组成的聚合物，其中功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酸、 4-乙烯基苯甲酸或马来酸酐的一种或几种，所述纳米磁珠由以下步骤制得：
（1）取甲基丙烯酸缩水甘油酯，添加苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸叔丁酯的一种或几种组成混合聚合单体，溶解于乙醇，加入聚乙烯吡咯烷酮和偶氮二异丁腈进行聚合反应得分散液，加入氨基改性剂反应，反应结束离心洗涤得到胺化的高分子基体微球，所述氨基改性剂为三(2-氨基乙基)胺、聚乙烯亚胺、均三苄胺或氨水中的一种；
（2）取制得的微球分散于水中，加入二价铁盐或三价铁盐反应，滴加氨水反应并进行磁分离和洗涤，得到的磁性微球重新分散在经 1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺盐酸盐活化的甲基丙烯酸水溶液中，反应后水洗磁分离得到包覆磁性纳米颗粒层的基体微球；
（3）将得到的微球分散于水和乙醇的混合溶液中，加入苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和功能单体，加入稳定剂和引发剂进行聚合反应，洗涤、磁分离后得到所述聚合物基纳米磁珠，所述苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和功能单体的质量比为1:0.5~1:1~1.5，苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和功能单体的总质量与微球的质量比为 2~5:1。
2.根据权利要求 1 所述的聚合物基纳米磁珠，其特征在于，所述胺化的高分子基体微球粒径为 1.5-2μm，磁性纳米颗粒层和高分子聚合物层的厚度为30-50nm。
3.根据权利要求 1 所述的聚合物基纳米磁珠，其特征在于，步骤（1）中，所述乙醇、混合聚合单体、聚乙烯吡咯烷酮、偶氮二异丁腈的质量比为 100：10：1~2：0.1~0.2。
4.根据权利要求 1 所述的聚合物基纳米磁珠，其特征在于，步骤（2）中，所述微球分散于水中，得到微球分散液，微球分散液的固含量为 0.5%-5%，所述微球上涂覆的纳米磁性颗粒占微球的质量比为 15%-35%。
5.根据权利要求 1 所述的聚合物基纳米磁珠，其特征在于，步骤（2）中，甲基丙烯酸与磁性微球的质量比为 2~4:1，重新分散后，微球在甲基丙烯酸水溶液中的固含量为 2%-5%。
6.根据权利要求 1 所述的聚合物基纳米磁珠，其特征在于，步骤（3）中，所述混合溶液中，微球的固含量为 1~5%，稳定剂与微球的质量比为 0.5~1:5，引发剂与聚合单体总质量的质量比为 1~2:100。
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