CN116077737A - 一种含血管结构的人工皮肤及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种含血管结构的人工皮肤及其制备方法，该制备方法包括：制备第一生物墨水，所述第一生物墨水包括真皮细胞、真皮层基质材料、光引发剂、光吸收剂以及水凝胶；基于3D打印技术将第一生物墨水制备为真皮层，所述真皮层包括至少一条通路；制备第二生物墨水，所述第二生物墨水包括血管内皮细胞以及明胶；低温凝固所述第二生物墨水，并将胶冻的所述第二生物墨水填充至所述通路加温培养，使得所述血管内皮细胞铺展至所述通路的内壁形成血管，同时排出液态的明胶溶液；将表皮细胞种植至所述真皮层的表面制备表皮层。血管结构能够模拟仿生人体内血管通路，输送营养物质和排出代谢废物，以解决现有的组织工程无法精确制备血管结构的问题。

Description

一种含血管结构的人工皮肤及其制备方法
技术领域
本申请涉及生物医学设备技术领域，具体涉及一种含血管结构的人工皮肤及其制备方法。
背景技术
皮肤作为人体最大的器官，具有重要的物理、化学和生物学屏障的功能，其是人体与外界环境接触的屏障，不仅承担着保护身体、排汗、感知等功能，而且维持着机体内环境的稳定。
组织工程的目标是通过制造缺失或者损伤的组织和器官替代物，来解决体外器官构建研究的难题。目前，组织工程已经取得了很多进展，然而这些进展仅局限于相对较薄的组织结构，例如皮肤和膀胱等。这些工程化组织能够依靠周围宿主血管提供营养，但是当工程化组织的厚度超过150-200微米时，就超过了氧气与营养物质扩散的限制。因此为了给组织提供氧气和营养以及移出细胞内的代谢废物，组织工程必须为工程化组织创建一种功能性的血管网络，但是现有的组织工程无法精确制备血管结构，因而无法解决这个难题。
发明内容
本申请提供一种含血管结构的人工皮肤及其制备方法，以解决现有的组织工程无法精确制备血管结构的技术问题。
本申请提供一种含血管结构的人工皮肤的制备方法，包括：
制备第一生物墨水，所述第一生物墨水包括真皮细胞、真皮层基质材料、光引发剂、光吸收剂以及水凝胶；
基于3D打印技术将所述第一生物墨水制备为真皮层，所述真皮层包括至少一条通路；
制备第二生物墨水，所述第二生物墨水包括血管内皮细胞以及明胶；
低温凝固所述第二生物墨水，并将胶冻的所述第二生物墨水填充至所述通路加温培养，使得所述血管内皮细胞铺展至所述通路的内壁形成血管，同时排出液态的明胶溶液；
将表皮细胞种植至所述真皮层的表面制备表皮层。
可选的，所述血管的内径为0.05mm~2mm；所述血管的壁厚为1mm~3mm。
可选的，所述第二生物墨水中所述血管内皮细胞在所述明胶溶液中的浓度为1×104～8×106 cells/ml。
可选的，所述真皮层基质材料包括胶原、明胶、丝素蛋白、蚕丝蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、海藻酸、纤维素、淀粉、甲壳素和壳聚糖中的至少两种。
可选的，所述水凝胶包括两种不同的改性生物可降解高分子材料。
可选的，所述改性生物可降解高分子材料为甲基丙烯酸修饰改性的胶原、甲基丙烯酸衍生物修饰改性的胶原、一型胶原、二型胶原、透明质酸、明胶或葡聚糖中的一种或几种组合。
可选的，所述光引发剂与所述改性生物可降解高分子材料的体积比为2:1～1:20；所述光吸收剂与所述改性生物可降解高分子材料的体积比为1:10～1:200；两所述改性生物可降解高分子材料之间的比例为2:1~1:8。
可选的，所述光引发剂为苯基磷酸锂盐；所述光吸收剂为R1800、柠檬黄、R1888以及碱性红12中任一种。
可选的，所述基于3D打印技术将所述第一生物墨水制备为真皮层的步骤包括：
利用紫外光照射所述第一生物墨水，使得所述真皮细胞沉积排列形成所述真皮层；其中，紫外光交联时间为5~20秒。
相应的，本申请还提供一种含血管结构的人工皮肤，其通过前述的含血管结构的人工皮肤的制备方法，含血管结构的人工皮肤包括真皮层以及表皮层，真皮层包括真皮细胞以及真皮层基质；表皮层形成于所述真皮层的一表面，所述表皮层包括表皮细胞；其中，所述真皮层内设于至少一条血管。
本申请提供一种含血管结构的人工皮肤及其制备方法，内皮细胞构建的血管结构能够真正地模拟仿生人体内血管通路的存在，使得内含血管结构的人工皮肤可以帮助成纤维细胞及角质细胞再生，也可以实现营养物质的输送以及代谢废物的排出，从而有利于提升真皮层内成纤维细胞的存活以及繁殖情况。同时，与人体皮肤相近的水凝胶材料可以更好地模拟人体皮肤的杨氏模量情况，使得具有血管结构的人工皮肤更加贴合人体最真实的皮肤性能，从而保证组织的效果，解决体外器官构建研究的难题。
参考人体内部实际血管的大小分布，合理设计三维的皮肤模型上的血管结构，而后利用3D打印技术制备内含通路的真皮层，并且利用制备的第二生物墨水将血管内皮细胞铺展至通路的内壁上形成血管，因而有利于量产，同时操作较为便利。
具有三维网络多孔结构的人工皮肤能够促使受损皮肤进行快速修复，同时具有良好的生物相容性、机械性能以及可降解性，在愈合期间能够维持良好的形态。同时人工皮肤三维结构中的孔道能够保证培养基中营养物质以及代谢产物、氧气和二氧化碳的及时交换，有助于细胞深入人工皮肤的三维结构进行增殖、分化。上述人工皮肤能够同时在时间和空间上准确沉积不同种类的细胞，最终生成细胞生长、分化所需的多层次3D微环境结构。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请提供的含血管结构的人工皮肤的制备方法的流程示意图；
图2是本申请提供的含血管结构的人工皮肤的制备方法中成纤维细胞与血管内皮细胞的分布示意图；
图3是本申请提供的含血管结构的人工皮肤的制备方法中成纤维细胞的细胞死活染色示意图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。此外，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。在本申请中，在未作相反说明的情况下，使用的方位词如“上”、“下”、“左”、“右”通常是指装置实际使用或工作状态下的上、下、左和右，具体为附图中的图面方向。
本申请提供一种含血管结构的人工皮肤及其制备方法，以下分别进行详细说明。需要说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对本申请实施例优选顺序的限定。且在以下实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
请参阅图1，本申请提供一种含血管结构的人工皮肤的制备方法，其具体包括以下步骤：
S100、构建三维的皮肤模型，该皮肤模型包括人体的血管结构；
血管网络可以为组织提供氧气以及营养物质，帮助细胞再生，同时可以移出细胞内的代谢废物，提升组织内细胞的存活以及繁殖情况。工程化组织可以依靠周围宿主的血管以及组织内的血管结构共同提供氧气以及营养物质，使得工程化组织的厚度可以突破200微米的限制。
利用SOLIDWORKS以及ZBRUSH等三维建模软件构建三维的皮肤模型，基于人体的血管结构，构建包含血管结构的皮肤模型，通过合理设计皮肤上的血管结构，从而真正模拟仿真人体内血管通路的存在。包含血管结构的皮肤模型可以更好地模拟皮肤，改善人工皮肤内细胞的存活条件，使得对于全皮模型的研究更贴合人体最真实的皮肤性能，为化妆品类产品的推广提供良好的平台。
S200、制备第一生物墨水，所述第一生物墨水包括真皮细胞、真皮层基质材料、光引发剂、光吸收剂以及水凝胶；
真皮细胞包括成纤维细胞，上述成纤维细胞的培养步骤如下：选取1×106个成纤维细胞培养在DMEM培养基中，培养温度为37℃，培养环境为含5%（v/v）CO2的空气；每2天更换培DMEM培养基，培养2天后传代，传代时将细胞悬液在1000转/分钟的速度下离心转动5分钟，去除上层清液，即可得到成纤维细胞。
将所得到的成纤维细胞用DMEM配置成细胞悬液，上述成纤维细胞在水凝胶中的浓度范围为2×104～5×106cells/ml，取占总体积1/10体积的细胞悬液与水凝胶、光引发剂、光吸收剂混合即得真皮层生物墨水。
真皮层基质材料为天然细胞外基质，上述天然细胞外基质包括胶原、明胶、丝素蛋白、蚕丝蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、海藻酸、纤维素、淀粉、甲壳素和壳聚糖中的至少两种。
上述第一生物墨水中水凝胶包括两种不同的改性生物可降解高分子材料；并且两种改性生物可降解高分子材料之间的比例为2:1~1:8。每一种改性生物可降解高分子材料为甲基丙烯酸修饰改性的胶原、甲基丙烯酸衍生物修饰改性的胶原、一型胶原、二型胶原、透明质酸、明胶或葡聚糖中的一种或几种组合。
水凝胶需与光引发剂混合，制得所述复合水凝胶，所述复合水凝胶中引发剂与改性生物可降解高分子溶液的体积比在2:1～1:20之间，上述光引发剂为苯基 (2, 4, 6-三甲基苯甲酰基) 磷酸锂盐。
同时真皮层生物墨水中光吸收剂与改性生物可降解高分子材料的体积比为1:10～1:200，上述光吸收剂为R1800、柠檬黄、R1888以及碱性红12中任一种。光吸收剂的主要功能是吸收水凝胶照射中多余的紫外光线，防止过度交联的产生。
由于水凝胶材料具有与人体皮肤相近的力学性能，因而使用水凝胶制备第一生物墨水，可以更好地模拟人体皮肤的杨氏模量情况，使得利用第一生物墨水制备的真皮层高度仿真人体的皮肤，对于全皮模型的研究更加贴合人体最真实的皮肤性能。
本申请真皮层生物墨水中包含7.5%(W/V)的水凝胶，2%(V/V)的胶原，1‰(W/V)光引发剂，1‰(W/V)光吸收剂以及13%(V/V)的细胞悬液。
S300、基于3D打印技术将所述第一生物墨水制备为真皮层，所述真皮层包括至少一条通路；
根据建立的包含血管结构的三维皮肤模型，利用3D打印机将第一生物墨水制备为真皮层，由于三维的皮肤模型中包含人体的血管结构，因而基于模型制备的真皮层对应的包括至少一条通路，上述通路与模型中的血管结构对应，以便于制备血管通道。
步骤S300具体包括以下步骤：
S310、将所述第一生物墨水添加至无菌的生物打印墨盒中；
预先对生物打印机进行紫外线杀菌消毒，而后将配制的第一生物墨水添加至无菌的生物打印墨盒中，从而根据三维皮肤模型进行打印。
S320、利用紫外光照射所述第一生物墨水，使得所述真皮细胞沉积排列形成所述真皮层；其中，紫外光交联时间为5~20秒；
利用第一生物墨水进行3D打印时，使用紫外光照射第一生物墨水，并发生交联反应，使得成纤维细胞可以沉积并整齐排列在模型当中，以形成真皮层。由于真皮层生物墨水中直接加入了成纤维细胞悬液，因此打印过程当中的紫外交联时间应当适当缩略为5~20秒，同时打印前后为保证成纤维细胞在水凝胶中的存活情况，尽量减短实验操作时间，实现多量化少批次的制备。
S400、制备第二生物墨水，所述第二生物墨水包括血管内皮细胞以及明胶；
血管内皮细胞的制备过程如下：取1×106个血管内皮细胞分别培养在DMEM培养基中，培养温度为37℃，培养环境为含5%（v/v）CO2的空气，每2天更换培DMEM培养基，培养2天后传代，传代时将细胞悬液在1000转/分钟的速度下离心转动5分钟，弃去上层清液，得到血管内皮细胞。
将所得到的血管内皮细胞用DMEM配置成细胞悬液，并取占总体积1/3体积的细胞悬液与明胶溶液进行充分混合，从而获得第二生物墨水，其中血管内皮细胞在明胶溶液中的浓度为1×104～8×106cells/ml。
S500、低温凝固所述第二生物墨水，并将胶冻的所述第二生物墨水填充至所述通路加温培养，使得所述血管内皮细胞铺展至所述通路的内壁形成血管，同时排出液态的明胶溶液；
由于明胶具有热逆反应，因而利用血管内皮细胞悬液与明胶溶液制备的第二生物墨水，在低温时可以凝固为胶冻状的第二生物墨水，经加热、搅拌后可以破坏其冻力，使其分子链断裂，形成低分子量低冻力水解明胶溶液。
步骤S500具体包括以下步骤：
S510、将制备的第二生物墨水在4℃冰箱中冷冻5分钟，使其低温凝固为胶冻状的第二生物墨水；
S520、将胶冻状的第二生物墨水填充至真皮层的通路内；
S530、将3D打印的真皮层放置在37℃环境下，并且加入DMEM培养基开始培养，培养温度为37℃，培养环境为含5%（v/v）CO2的空气，且每2天更换一次DMEM培养基，从而使得通路内胶冻状的第二生物墨水转换为水解状的第二生物墨水；
S540、第二生物墨水内的血管内皮细胞铺展至所述通路的内壁形成血管，同时排出液态的明胶溶液；
真皮层内的血管结构是参考人体内部实际血管的大小分布，总体厚度为1mm~3mm，同时血管通路尺寸为0.05mm~2mm之间，因而使得制备的血管更接近人体皮肤内的血管结构。
请参阅图2，在制备真皮层的第一生物墨水材料当中内含成纤维细胞，可以模拟人体皮肤真皮层情况，同时设在真皮层内的血管则是模拟了人体内血管的存在，可以帮助成纤维细胞再生、营养物质的输送以及代谢废物的排出。
S600、将表皮细胞种植至所述真皮层的表面制备表皮层；
利用培养基与表皮细胞制备细胞悬液，并将细胞悬液静置于真皮层的上方，使得表皮细胞经气液界面及生长因子调控，形成表皮层。
请参阅图3，利用死活染剂对打印过后的水凝胶进行死活染色，从而验证其生长状况以及生长存活率，从结果而言，该模型在4天内的培养当中，细胞生长情况良好，在材料内部均匀铺展开来，且具有良好的存活率，达到90%以上，同时细胞形态正常，在37℃培养4天后依旧拥有良好的增值情况。
由于真皮层基质材料为天然细胞外基质，水凝胶包括两种不同的改性生物可降解高分子材料，因此人工皮肤使用的原材料是天然高分子材料和可降解高分子材料，并通过三维打印的工艺制得，使得人工皮肤具有三维网络多孔结构。上述具有三维网络多孔结构的人工皮肤能够促使受损皮肤进行快速修复，同时具有良好的生物相容性、机械性能以及可降解性，在愈合期间能够维持良好的形态。
同时人工皮肤三维结构中的孔道能够保证培养基中营养物质以及代谢产物、氧气和二氧化碳的及时交换，有助于细胞深入人工皮肤的三维结构进行增殖、分化。上述人工皮肤能够同时在时间和空间上准确沉积不同种类的细胞，最终生成细胞生长、分化所需的多层次3D微环境结构。
血管内皮细胞构建的血管结构能够真正地模拟仿生人体内血管通路的存在，使得内含血管结构的人工皮肤可以帮助成纤维细胞及角质细胞再生，也可以实现营养物质的输送以及代谢废物的排出，从而有利于提升真皮层内成纤维细胞的存活以及繁殖情况。同时，与人体皮肤相近的水凝胶材料可以更好地模拟人体皮肤的杨氏模量情况，使得具有血管结构的人工皮肤更加贴合人体最真实的皮肤性能，从而保证组织的效果，解决体外器官构建研究的难题。
参考人体内部实际血管的大小分布，合理设计三维的皮肤模型上的血管结构，而后利用3D打印技术制备内含通路的真皮层，并且利用制备的第二生物墨水将血管内皮细胞铺展至通路的内壁上形成血管，因而有利于量产，同时操作较为便利。
本申请还包括一种基于前述的含血管结构的人工皮肤的制备方法得到的人工皮肤，其包括真皮层以及表皮层，真皮层包括真皮细胞以及真皮层基质，同时真皮层内设于至少一条血管；表皮层形成于真皮层的一表面，并包括表皮细胞。上述真皮细胞为成纤维细胞，表皮细胞为角质细胞。
血管内皮细胞构建的血管结构能够真正地模拟仿生人体内血管通路的存在，使得内含血管结构的人工皮肤可以帮助成纤维细胞及角质细胞再生，也可以实现营养物质的输送以及代谢废物的排出，从而有利于提升真皮层内成纤维细胞的存活以及繁殖情况。同时，与人体皮肤相近的水凝胶材料可以更好地模拟人体皮肤的杨氏模量情况，使得具有血管结构的人工皮肤更加贴合人体最真实的皮肤性能，从而保证组织的效果，解决体外器官构建研究的难题。
参考人体内部实际血管的大小分布，合理设计三维的皮肤模型上的血管结构，而后利用3D打印技术制备内含通路的真皮层，并且利用制备的第二生物墨水将血管内皮细胞铺展至通路的内壁上形成血管，因而有利于量产，同时操作较为便利。
以上对本申请提供一种含血管结构的人工皮肤及其制备方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (10)

1.一种含血管结构的人工皮肤的制备方法，其特征在于，包括：
制备第一生物墨水，所述第一生物墨水包括真皮细胞、真皮层基质材料、光引发剂、光吸收剂以及水凝胶；
基于3D打印技术将所述第一生物墨水制备为真皮层，所述真皮层包括至少一条通路；
制备第二生物墨水，所述第二生物墨水包括血管内皮细胞以及明胶；
低温凝固所述第二生物墨水，并将胶冻的所述第二生物墨水填充至所述通路加温培养，使得所述血管内皮细胞铺展至所述通路的内壁形成血管，同时排出液态的明胶溶液；
将表皮细胞种植至所述真皮层的表面制备表皮层。
2.根据权利要求1所述的含血管结构的人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述血管的内径为0.05mm~2mm；所述血管的壁厚为1mm~3mm。
3.根据权利要求1所述的含血管结构的人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述第二生物墨水中所述血管内皮细胞在所述明胶溶液中的浓度为1×104～8×106 cells/ml。
4.根据权利要求1所述的含血管结构的人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述真皮层基质材料包括胶原、明胶、丝素蛋白、蚕丝蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、海藻酸、纤维素、淀粉、甲壳素和壳聚糖中的至少两种。
5.根据权利要求1所述的含血管结构的人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述水凝胶包括两组不同的改性生物可降解高分子材料。
6.根据权利要求5所述的含血管结构的人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述改性生物可降解高分子材料为甲基丙烯酸修饰改性的胶原、甲基丙烯酸衍生物修饰改性的胶原、一型胶原、二型胶原、透明质酸、明胶或葡聚糖中的一种或几种组合。
7.根据权利要求5所述的含血管结构的人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述光引发剂与所述改性生物可降解高分子材料的体积比为2:1～1:20；
所述光吸收剂与所述改性生物可降解高分子材料的体积比为1:10～1:200；
两所述改性生物可降解高分子材料之间的比例为2:1~1:8。
8.根据权利要求1所述的含血管结构的人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述光引发剂为苯基磷酸锂盐；
所述光吸收剂为R1800、柠檬黄、R1888以及碱性红12中任一种。
9.根据权利要求1所述的含血管结构的人工皮肤的制备方法，其特征在于，所述基于3D打印技术将所述第一生物墨水制备为真皮层的步骤包括：
利用紫外光照射所述第一生物墨水，使得所述真皮细胞沉积排列形成所述真皮层；其中，紫外光交联时间为5~20秒。
10.一种含血管结构的人工皮肤，其特征在于，通过权利要求1-9中任一项所述的含血管结构的人工皮肤的方法制备，其包括：
真皮层，其包括真皮细胞以及真皮层基质；以及
表皮层，其形成于所述真皮层的一表面，所述表皮层包括表皮细胞；
其中，所述真皮层内设于至少一条血管。
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