CN116077607B

CN116077607B - 一种抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物及其应用

Info

Publication number: CN116077607B
Application number: CN202211299425.8A
Authority: CN
Inventors: 吴炳新; 牛纪江; 褚新红; 孙筱林; 吕美
Original assignee: Sanzhu Fuer Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Sanzhu Fuer Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-10-24
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2023-07-07
Anticipated expiration: 2042-10-24
Also published as: CN116077607A

Abstract

本发明公开了一种抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物及其应用，属于生物医药技术领域，所述组合物由以下原料药制成：厚朴、党参、炒黄芩、干姜、陈皮、醋元胡、姜半夏、黄连、甘草，上述原料药经浸泡、煎煮、浓缩后，添加甜味剂，调整pH值、灭菌，加入经扩大培养的益生菌菌液，培养发酵制得。本发明解决了现有技术中使用抗生素产生耐药性的问题，实验表明，本发明对幽门螺杆菌具有很强抑制作用，易于吸收，增强疗效，既能够抑制有害菌幽门螺杆菌，又能增殖胃部有益菌，起到调节胃部菌群的作用，还能保护和修复胃黏膜，改善慢性胃炎所引起的不适症状。

Description

一种抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，HP)是一种革兰氏阴性螺旋状细菌，具有传染性。幽门螺杆菌主要通过口腔途径进入人体胃内，并定植于上皮细胞表面，定植后机体很难自发清除，并可导致胃粘膜活动性炎症，慢性胃炎患者中约有80％感染HP。HP阳性慢性胃炎与一般性胃炎不同，其致病因素是HP感染，该病菌能潜伏于胃黏膜上，引起胃黏膜炎性反应，并且会干扰血脂代谢，增加发生心血管疾病的风险，并与胃癌等肿瘤疾病有关，世界卫生组织将HP归为Ⅰ类致癌物，它在胃癌发展中起主导作用，对健康有着极大威胁。因HP隐匿性强，若不能及时根除，极易造成慢性胃炎的反复发作。在活动性炎症的基础上还可发生慢性胃炎、慢性萎缩性胃炎、消化性溃疡和胃癌等一系列常见疾病，严重地危害人们的健康。

口腔幽门螺杆菌在唾液、牙菌斑中有分布，会引起口臭、口腔溃疡、慢性咽炎等。口腔中的幽门螺杆菌被严重忽视，由于口腔幽门螺杆菌的感染性、传播性和耐药性，药物难以发挥作用，且幽门螺杆菌易于在口腔内定植，是HP根除失败、复发或再感染的重要原因。因此，注重口腔中幽门螺杆菌的预防和治疗是解决以上问题的良好途径。

目前流行的治疗HP感染的方案是同时服用质子泵抑制剂(PPI)加两种或三种抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四环素、甲硝唑等)的三联、四联疗法。三联、四联疗法的最主要缺陷被认为是HP对抗菌剂容易形成耐药性，且大量抗菌剂导致消化道内菌群严重毁灭，出现消化不适症状；另一缺陷是质子泵抑制剂也会诱发消化不良。上述缺陷使得患者HP反复感染，疾病反复发作，增加了患者疾病的治疗难度和医疗成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术存在的缺陷，提供一种抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物及其制备方法与应用，组合物包含益生菌菌体、益生菌代谢产物和中药成分等，多成分协同组合，可有效杀灭幽门螺杆菌，并避免HP的耐药性产生，以及消化道内菌群失调等副作用，减少复发，对人体无伤害。该组合物既可以口服，有效抑杀胃内幽门螺杆菌，还可以漱口，有效抑杀口腔中幽门螺杆菌，又可以应用在牙膏中，与牙膏其余基质结合在一起，作为日常护理，使幽门螺杆菌在口腔中失去生存的环境，健康、安全，防止病从口入，不会破坏口腔中的环境，从根本上预防HP复发。

为了实现上述目的，本发明提供了一种抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物，由以下原料药制成：厚朴、党参、炒黄芩、干姜、陈皮、醋元胡、姜半夏、黄连、甘草，上述原料药经浸泡、煎煮、浓缩后，添加甜味剂，调整pH值、灭菌，加入经扩大培养的益生菌菌液，培养发酵制得；

所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物，每1000mL中含有：厚朴20～60g、党参20～60g、炒黄芩15～40g、干姜15～40g、陈皮15～40g、醋元胡15～40g、姜半夏10～40g、黄连10～30g、甘草10～30g；具体制备方法步骤如下：

(1)按原料药组方称取药材，混合均匀后，加水浸泡0.5～1h，然后再煮沸提取2次，每次0.5～2h，过滤得滤液，合并滤液，滤液减压浓缩，60℃下测定相对密度为1.01～1.10；添加甜味剂，调整pH值、灭菌，作为中药发酵底液，备用；

(2)将所述益生菌菌液扩大混合培养：培养基中添加葡萄糖、酵母粉、酵母膏、大豆肽粉、无机盐，调整pH值7.0±0.5，定容，并于110～121℃下灭菌30～60分钟，温度降至28～40℃时，接种预培养的体积百分比为0.2～1.0％的至少一种双歧杆菌的菌液、体积百分比为0.2～1.0％的肠球菌的菌液、体积百分比为0.2～1.0％的至少一种乳杆菌的菌液，28～40℃培养6～24小时；

(3)将扩大培养后的益生菌混合液按体积百分比为10～50％加入上述中药发酵底液中，28～40℃培养16～48小时，当pH降至4.0以下时结束发酵；

(4)稳定化处理，无菌分装，即得。

优选的，每1000mL益生菌发酵中药组合物中含有：厚朴36g、党参36g、炒黄芩24g、干姜20g、陈皮20g、醋元胡20g、姜半夏16g、黄连12g、甘草12g。

优选的，益生菌菌液扩大混合培养所用培养基中：所述葡萄糖的含量为0.5～3.0g/100mL、所述酵母粉的含量0.1～0.5g/100mL、所述酵母膏的含量0.1～0.6g/100mL、所述大豆肽粉的含量为0.1～1.0g/100mL。

优选的，益生菌菌液扩大混合培养所用培养基中：所述无机盐及含量为：FeSO₄·7H₂O 5.0～15.0mg/100mL、ZnSO₄·7H₂O 4.4～13.2mg/100mL、MgSO₄·7H₂O 30～90mg/100mL、KH₂PO₄ 100～300mg/100mL、K₂HPO₄·3H₂O 100～300mg/100mL。

优选的，所述的甜味剂为三氯蔗糖，其添加量为：0.01～0.03g/100mL。

所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌(CICC 6166)、短双歧杆菌(AS 1.2213)、长双歧杆菌(CICC 6195)、动物双歧杆菌(CGMCC 1.3003)、青春双歧杆菌(CGMCC1.2190)和婴儿双歧杆菌(CICC 6069)中的至少一种；所述的肠球菌选自粪肠球菌(CGMCC1.15424)；所述的乳杆菌选自罗伊氏乳杆菌(CICC 6118)、嗜酸乳杆菌(AS 1.1854)、德氏乳杆菌(AS1.1480)、植物乳杆菌(AS 1.19)、瑞士乳杆菌(CGMCC 1.2903)、唾液乳杆菌(CGMCC1.1881)、副干酪乳杆菌(CGMCC 1.2744)、发酵乳杆菌(CGMCC 1.122)、干酪乳杆菌(CGMCC1.29)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC 1.26)中的至少一种。

优选的，所述的双歧杆菌为短双歧杆菌AS 1.2213，所述的肠球菌为粪肠球菌CGMCC 1.15424，所述的乳杆菌为罗伊氏乳杆菌CICC 6118、植物乳杆菌AS 1.19、嗜酸乳杆菌AS 1.1854。

上述菌种为公开的已知常规菌种，可在中国科学院微生物研究所(AS)或中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(中国，武汉)或中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)(中国，北京)或中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)(中国，北京)获得。

益生菌能够改善机体正常的微生物菌群平衡，以及能够刺激机体特异性、非特异性免疫机制，最终提高机体健康水平和健康状态。益生菌菌体及其代谢产物能够加强粘膜的屏障作用，减少炎症反应，改善患者在治疗过程中的临床症状和依从性，直接或间接提高了幽门螺杆菌的根除率，对幽门螺杆菌及相关疾病的防治具有重要意义，本发明采用益生菌发酵中药组合物(内含益生菌代谢产物、益生菌菌体和中药成分)协同药源，增强去除幽门螺杆菌的功效，降低副作用。

本发明还提供了一种所述的益生菌发酵中药组合物在制备预防和治疗幽门螺杆菌感染药物中的应用。

所述的应用为：将所述的益生菌发酵中药组合物按照制药工业中已知的方法，制成药剂学上可接受的胶囊剂、片剂、颗粒剂。

本发明还提供了一种所述的益生菌发酵中药组合物在用于制备防治口腔幽门螺杆菌感染的药物中的应用，所述药物可为牙膏、口香糖、含片、喷剂以及漱口水等。

有益效果：本发明的益生菌发酵中药组合物的原料包括中药成分、益生菌菌液以及益生菌生长所需部分营养物质。利用对人体有益的细菌，在体外发酵中药水提物，一方面，遵守中医药理论，保留了中药的水提物全成分，保持了中药汤药的特性；另一方面，益生菌在生长繁殖过程中产生大量酶，中药提取物经过益生菌发酵，一些大分子物质在体外被转化，发生某些结构改变后，易于人体吸收，增强疗效；并且乳酸菌在发酵过程中，产生乳酸菌素，可有效抑制病原菌的生长。乳酸菌素的作用类似抗生素，但作用机制不同，乳酸菌素作用机制是先吸附在目标菌的细胞膜上、再侵入膜内而形成通透孔道，以引起胞内重要物质，如ATP、K+等流失或生化反应障碍，而导致指标菌死亡。具有专一性，不产生抗药性及毒性，而且不易被胰蛋白酶破坏；另外，益生菌在发酵过程中，产生丰富风味物质，改善了中药的口感。本发明所述的益生菌发酵中药组合物可应用于制备预防和治疗幽门螺杆菌感染的药物中，如胶囊剂、片剂、颗粒剂、口服液制剂，还可应用于制备防治口腔幽门螺杆菌感染的药物中，如喷剂、漱口水等。

附图说明

图1为本发明试验例1未经益生菌发酵中药原液抑菌效果图；

图2为本发明试验例1未经益生菌发酵中药上清液抑菌效果图；

图3为本发明实施例1益生菌发酵中药组合物A的原液抑菌效果图；

图4为本发明实施例1益生菌发酵中药组合物A的上清液抑菌效果图。

具体实施方式

实施例1：抗HP益生菌发酵中药组合物A的制备

按下列重量称取各中药成分：厚朴36g、党参36g、炒黄芩24g、干姜20g、陈皮20g、醋元胡20g、姜半夏16g、黄连12g、甘草12g。

以上药味，加水浸泡1.0小时，煎煮二次，第一次1.0小时，第二次为0.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至600ml(60℃下测定相对密度为1.03)，加入0.18g三氯蔗糖，调整pH7.5，并于115℃下灭菌40分钟，温度降至37℃左右时，得中药待发酵液，备用。

益生菌菌液扩大混合培养：培养基中含葡萄糖的量1.5g/100mL、酵母粉的量为0.4g/100mL、酵母膏的量为0.4g/100mL、大豆肽粉的量为0.8g/100mL、无机盐(FeSO₄·7H₂O5.0mg/100ml、ZnSO₄·7H₂O 4.4mg/100ml、MgSO₄·7H₂O 90mg/100ml、KH₂PO₄ 100mg/100ml、K₂HPO₄·3H₂O 100mg/100ml)，调整pH值7.0，定容至400ml，并于115℃下灭菌40分钟，温度降至37℃时，接种预培养的体积百分比为1.0％的短双歧杆菌(AS 1.2213)的菌液，体积百分比为0.5％的粪肠球菌的菌液(CGMCC 1.15424)，体积百分比各0.3％的嗜酸乳杆菌(AS1.1854)、植物乳杆菌(AS 1.19)和罗伊氏乳杆菌(CICC 6118)的菌液，37℃培养16h，得益生菌扩大混合培养液。

将益生菌扩大混合培养液加入上述已灭菌的中药待发酵液中，37℃继续培养24h。检测pH值，当pH值降至4.0以下时结束发酵，稳定化处理，无菌分装，即得抗HP益生菌发酵中药组合物A。

实施例2：抗HP益生菌发酵中药组合物B的制备

按下列重量称取各中药成分：厚朴60g、党参60g、炒黄芩15g、干姜15g、陈皮40g、醋元胡15g、姜半夏10g、黄连10g、甘草10g。

以上药味，加水浸泡0.5小时，煎煮二次，第一次2.0小时，第二次为1.0小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至500ml(60℃下测定相对密度为1.04)，加入体积百分比为0.15g的三氯蔗糖，调整pH7.0，并于115℃下灭菌40分钟，温度降至40℃时，得中药待发酵液，备用。益生菌菌液扩大混合培养：培养基中含葡萄糖的量2.0g/100mL、酵母粉的量为0.5g/100mL、酵母膏的量为0.6g/100mL、大豆肽粉的量为0.8g/100mL无机盐(FeSO₄·7H₂O10.0mg/100ml、ZnSO₄·7H₂O 8.8mg/100ml、MgSO₄·7H₂O 60mg/100ml、KH₂PO₄ 200mg/100ml、K₂HPO4·3H₂O 200mg/100ml)，调整pH值7.0，定容至500ml，并于115℃下灭菌40分钟，温度降至40℃时，接种预培养的体积百分比各为0.5％的长双歧杆菌(CICC 6195)、动物双歧杆菌(CGMCC 1.3003)的菌液，体积百分比为1.0％的粪肠球菌(CGMCC 1.15424)的菌液、体积百分比各为0.25％的瑞士乳杆菌(CGMCC 1.2903)、唾液乳杆菌(CGMCC 1.1881)、副干酪乳杆菌(CGMCC 1.2744)、发酵乳杆菌(CGMCC 1.122)的菌液，40℃培养8h，得益生菌扩大混合培养液。

将益生菌扩大混合培养液加入上述已灭菌的中药待发酵液中，40℃继续培养24h。检测pH值，当pH值降至4.0以下时结束发酵，稳定化处理，无菌分装，即得抗HP益生菌发酵中药组合物B。

实施例3：抗HP益生菌发酵中药组合物C的制备

按下列重量称取各中药成分：厚朴20g、党参20g、炒黄芩40g、干姜30g、陈皮20g、醋元胡40g、姜半夏40g、黄连30g、甘草20g。

以上药味，加水浸泡1.0小时，煎煮二次，第一次0.5小时，第二次为0.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至800ml(60℃下测定相对密度为1.02)，加入0.2g的三氯蔗糖，调整pH6.5，并于115℃下灭菌40分钟，温度降至28℃时，得中药待发酵液，备用。

益生菌菌液扩大混合培养：培养基中含葡萄糖的量3.0g/100mL、酵母粉的量为0.3g/100mL、酵母膏的量为0.6g/100mL、大豆肽粉的量为1.0g/100mL、无机盐(FeSO₄·7H₂O10.0mg/100ml、ZnSO₄·7H₂O 8.8mg/100ml、MgSO₄·7H₂O60mg/100ml、KH₂PO₄ 200mg/100ml、K₂HPO₄·3H₂O 200mg/100ml)，调整pH值7.0，定容至200ml，并于115℃下灭菌40分钟，温度降至28℃时，接种预培养的体积百分比各为0.2％的两歧双歧杆菌(CICC 6166)、青春双歧杆菌(CGMCC 1.2190)和婴儿双歧杆菌(CICC 6069)的菌液，体积百分比为0.2％的粪肠球菌(CGMCC 1.15424)的菌液，体积百分比各为0.2％的德氏乳杆菌(AS 1.1480)、干酪乳杆菌(CGMCC 1.29)和鼠李糖乳杆菌(CGMCC 1.26)的菌液，28℃培养24h，得益生菌扩大混合培养液。

将益生菌扩大混合培养液加入上述已灭菌的中药待发酵液中，28℃继续培养48h。检测pH值，当pH值降至4.0以下时结束发酵，稳定化处理，无菌分装，即得抗HP益生菌发酵中药组合物C。

实施例4：抗HP益生菌发酵中药组合物A在制备预防和治疗幽门螺杆菌感染药物中的应用

取本实施例1中抗HP益生菌发酵中药组合物A 1000ml，加入100g可溶性淀粉，充分溶解，喷雾干燥，制得固体粉末，经干法制粒，分装制得颗粒剂；或装入胶囊，制得胶囊剂；或经压片制得片剂。

本实施例1中抗HP益生菌发酵中药组合物A，口感适中，也可直接作为口服液制剂应用。

由对合并HP感染慢性胃炎模型大鼠HP清除情况及胃粘液层磷脂含量影响实验结果可知：抗HP益生菌发酵中药组合物A在体内具有较好的清除幽门螺杆菌的作用，并可保护胃粘液层磷脂含量(详见实验例2)。

实施例5：抗HP益生菌发酵中药组合物A在制备预防和治疗幽门螺杆菌药物中的应用

取本实施例1中抗HP益生菌发酵中药组合物A 400ml，按体积比例(1∶1)加入去离子水400ml，按质量比依次加入适量香精、甜味剂、磷酸二氢钠、表面活性剂、防腐剂；充分搅拌均匀，搅拌速率为120～150转/min，加去离子水定容至1000ml，再使用均质机进行二次均质，均质完成罐装，制得漱口水或喷剂。

由体外抑菌试验可知：在400μl/ml的浓度下，发酵组合物A原液的抑菌率为99.9％，制得漱口水或喷剂中抗HP益生菌发酵中药组合物A含量400μl/ml，可有效抑制口腔中幽门螺杆菌(详见实验例1)。

实验例1：本发明益生菌发酵中药组合物A与未经发酵的相同中药复方提取液对幽门螺杆菌的体外抗菌活性检测

本试验例旨在利用体外抗幽门螺杆菌实验，举例描述按本发明方法制备益生菌发酵中药组合物优于未经发酵的中药复方提取液。

实验样品：取实施例1制备的益生菌发酵中药组合物A和按相似方法制备的未经益生菌发酵的相同中药复方提取液，分别制备相同浓度，作为测试样品。

测试样品分为样品原液和离心上清液(原液离心：3000rpm/min，10分钟)。菌株来源：幽门螺杆菌26695标准株。

实验步骤：

菌体悬液制备：用PBS将生长至对数期的幽门螺杆菌冲洗收集至1.5ml离心管中，调整浓度至1x 10⁷CFU/ml。

最适的样品抑菌时间筛选：在1.5ml离心管中加入200μl的不同种类各样品药液，再加入100ul调整浓度后的幽门螺杆菌菌液，用PBS补齐至总体积为1ml(菌液终浓度1x10⁶CFU/ml)，在37℃微需氧环境中孵育0min，15min，30min，60min，120min，分别取200ul混合液涂布在不添加其他药物的鸡蛋黄营养琼脂平板上，与不加其他药物的涂布平板对照，观察抑菌率，选出最适的药物抑菌时间。在37℃微需氧环境中孵育0min的平板与对照平板的生长无明显差别，孵育30min及以上的完全抑制细菌生长，无法形成单克隆，故而选择孵育15min作为进行下一步药物抑制实验的条件。

体外抑菌检测：在1.5ml离心管中分别加入0μl(对照)，25μl，50μl，100μl，200μl，400μl的不同种类样品药液，再加入100μl调整浓度后的菌液，用PBS补齐至总体积为1ml(菌液终浓度1x 10⁶CFU/ml)，在37℃微需氧环境中孵育15min。取200μl混合液涂布在不添加其他药物的鸡蛋黄营养琼脂上，待平板稍干后放在37℃微需氧环境中培养三天，观察结果，进行菌落计数并测量抑菌率。

实验结果：

各样品原液、上清液抑菌效果图片如附图1-图4所示。

各样品原液、上清液抑菌情况如表1所示。

表1各样品不同添加量对幽门螺杆菌的抑菌率

由实验结果可知：在25μl/ml、50μl的浓度下，发酵组合物A原液的抑菌率分别为20％、40％，未发酵组合物原液的抑菌率均为0％；在100μl/ml的浓度下，发酵组合物A原液的抑菌率为80％，未发酵组合物原液的抑菌率仅为20％；在200μl/ml的浓度下，发酵组合物A原液的抑菌率为99％，未发酵组合物原液的抑菌率为50％；在400μl/ml的浓度下，发酵组合物A原液的抑菌率为99.9％，未发酵组合物原液的抑菌率为80％。发酵组合物A原液的抑菌效果明显优于未发酵组合物原液，各样品原液的抑菌效果分别优于其上清液。

实验例2本发明益生菌发酵中药组合物对合并HP感染慢性胃炎模型大鼠HP清除情况及胃粘液层磷脂含量影响将健康雄性Wister大鼠60只，体重180～200g，随机分成6组，每组10只，即正常对照组、阴性(模型)对照组、阳性(三联疗法)对照组、治疗组A、治疗组B、治疗组C。正常对照组正常喂养，其余大鼠均行造模。

采用综合法造模。首先适应性饲养大鼠1周，其后，除正常组外，其余各组大鼠在第1～5周每隔5d，第5～8周每隔7d，经口灌服乙醇溶液，初次浓度为50％，以后为60％，每次每只2ml，并以20mmol/L的脱氧胆酸钠溶液为饮料自由饮用；第9～12周则分别用30％的乙醇溶液及20mmol/L的脱氧胆酸钠溶液为饮料，每隔7d轮换1次，任意饮用，并在饮用脱氧胆酸钠溶液7d里的第2、5天灌服乙醇溶液各1次以加强刺激。

HP感染。在造模第9～12周，除正常组外，均进行HP感染，每次感染前禁食12～14h，用胃管灌以5％碳酸氢钠溶液2ml，15min后，用胃管灌入HP菌液2ml(10¹²cfu/m1)，30min后给食，每周感染1次。造模期间，配合饥饱失常、寒热失调等综合法造模。

实验动物用药：阴性(模型)对照组，每日1次灌服生理盐水2mL/只；治疗组A、B、C每日1次分别灌服本发明实施例1、2、3制备的益生菌发酵中药组合物A、B、C2mL/只；阳性(三联疗法)对照组，每日1次灌服三联药物(枸橼酸铋钾胶囊8mg/kg，羟氨苄青霉素40mg/kg，甲硝唑20mg/kg)。各组灌胃均4周。检测实验动物HP情况及胃粘液层磷脂含量。

所有大鼠乙醚麻醉后，剑突下正中切开腹壁，暴露胃，切下全胃，沿大弯侧剪开，生理盐水冲洗后，滤纸吸干，取1/4大鼠胃，用载玻片刮取胃粘液，称重，供测磷脂。剩余鼠胃，固定于中性福尔马林缓冲液中。

HP检测

切取胃窦小弯侧2cm×lcm大小的组织条块，快速尿素酶法检测HP，确定幽门螺杆菌阳性或阴性，比较各组清除HP的效果。

表2各组对幽门螺杆菌的清除率

组别	n	HP阳性	HP阴性	转阴率(％)
					正常对照组	10	0	10	----
阴性对照组	10	10	0	0
					阳性(三联疗法)对照组	10	3	7	70
治疗组A	10	1	9	90
					治疗组B	10	2	8	80
治疗组C	10	2	8	80

通过对合并HP感染慢性胃炎模型大鼠体内清除HP试验可知：本发明益生菌发酵中药组合物可有效清除模型大鼠胃内HP，治疗组A、B、C均优于阳性(三联疗法)对照组。

胃粘液层磷脂含量测定

参考高氯酸消化法改良。取上述胃窦部粘膜组织5～10mg，用1.5ml生理盐水匀浆，移入小试管，2500r/min离心5min，取上清液lml加醇醚混合液4ml，混匀煮沸1min，冷却，加醇醚混合液补足5ml，离心沉淀。取上清液4ml置于NPN管，置沸水浴蒸干，冷却后加60％过氯酸0.25ml，置砂浴消化。冷却后加蒸馏水lml、钼酸试剂0.5ml、三氯醋酸亚铁3ml，置37℃水浴中l0min，用722分光光度计(620nm)比色，标准管用磷标准液制备。胃粘膜磷脂(mg/g)＝(测定管光密度×375)÷[标准管光密度×粘膜重量(mg)]。

表3各组大鼠胃粘液层磷脂含量(x±s)

组别	n	磷脂(mg/g)
			正常对照组	10	28.92±6.14
阴性(模型)对照组	10	17.26±3.21^※※
			阳性(三联疗法)对照组	10	22.65±4.68^※#
治疗组A	10	27.94±5.82^##*
			治疗组B	10	25.16±6.01^##
治疗组C	10	24.38±5.79^##

注：与正常对照组比，※p<0.05，※※p<0.01；与阴性(模型)组比，#p<0.05，##p<0.01；与阳性(三联疗法)对照组比，*p<0.05。

由试验结果知：本发明益生菌发酵中药组合物治疗组大鼠胃粘液层磷脂含量均显著高于阴性(模型)对照组，且治疗组A显著高于阳性(三联疗法)对照组。

胃粘膜表面粘液层是胃粘膜抗损伤的第一道防线。正常情况下，胃粘膜由表面上皮细胞、贲门腺、幽门腺和粘液颈细胞分泌的粘液所覆盖，粘液的主要成分为糖蛋白与脂类。完整的上皮细胞膜的脂蛋白层及细胞间连接形成一道防线，称为粘液--粘膜屏障。近年来逐渐认识到脂质物质，尤其是磷脂对胃黏膜保护的重要性，磷脂既是胃粘液中的重要成分，又能单独或和粘蛋白形成疏水屏障。因此，测定胃粘液层磷脂含量反映出对胃黏膜的保护程度。

本发明抗HP感染发酵中药组合物的口服给药剂量可根据待治疗的病症或病理状态的性质、严重程度、病人的年龄、体重、一般健康状态，以及病人对所用药物的敏感性、耐受性和给药方式等因素，按照个体化的原则由临床医生确定。

经体外试验证明，本发明的益生菌发酵中药组合物在体外对HP有显著的抑制作用；经模型大鼠(合并HP感染慢性胃炎)体内试验证明，本发明的益生菌发酵中药组合物在体内对HP有显著的抑制作用，同时，对模型大鼠胃粘膜起到保护作用，治疗组磷脂含量显著高于阴性(模型)对照组，并且治疗组与正常组无显著性差异。

本发明解决了现有技术中使用抗生素产生耐药性的问题。一方面，本发明采用厚朴、党参、炒黄芩、干姜、陈皮、醋元胡、姜半夏、黄连、甘草几味中药进行配伍，具有多成分、多途径、多靶点的作用特点，并且中药疗法耐药发生率低。另一方面，益生菌菌液在扩大培养以及与中药混合培养的过程中，产生大量益生菌代谢产物及益生菌菌体。益生菌代谢过程中产生大量的酶，可将部分中药前体物质转化为药效成分，利于中药成分的吸收利用。益生菌代谢产物(如短链脂肪酸等)及益生菌菌体具有改善胃肠道微生态环境的作用，并且益生菌代谢产物(如芳香类成分等)能较好的改善中药汤剂的口感，减少中药汤剂的不良反应，患者依从性好。

本发明益生菌发酵中药组合物配伍合理，对幽门螺杆菌具有很强抑制作用，并避免了苦寒伤胃，适用于幽门螺杆菌感染者，并且益生菌与中药的应用能减少抗生素的使用，从而降低幽门螺杆菌耐药率；另一方面，本发明组合物是在中药组合物基础上经过益生菌发酵，含有大量中药有效成分、益生菌代谢产物、益生菌菌体。三者之间发挥协同配合作用，既能够抑制有害菌幽门螺杆菌，又能增殖胃部有益菌，起到调节胃部菌群的作用，还能保护和修复胃黏膜，改善慢性胃炎所引起的不适症状。

Claims

1.一种抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物，其特征在于，所述的益生菌发酵中药组合物，每1000mL中由如下重量份的药材制成：厚朴36g、党参36g、炒黄芩24g、干姜20g、陈皮20g、醋元胡20g、姜半夏16g、黄连12g、甘草12g；其制备方法步骤如下：

(4)稳定化处理，无菌分装，即得；

所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌CICC 6166、短双歧杆菌AS 1.2213、长双歧杆菌CICC 6195、动物双歧杆菌CGMCC 1.3003、青春双歧杆菌CGMCC1.2190和婴儿双歧杆菌CICC6069中的至少一种；所述的肠球菌选自粪肠球菌CGMCC 1.15424；所述的乳杆菌选自罗伊氏乳杆菌CICC 6118、嗜酸乳杆菌AS 1.1854、德氏乳杆菌AS 1.1480、植物乳杆菌AS 1.19、瑞士乳杆菌CGMCC 1.2903、唾液乳杆菌CGMCC 1.1881、副干酪乳杆菌CGMCC 1.2744、发酵乳杆菌CGMCC 1.122、干酪乳杆菌CGMCC 1.29和鼠李糖乳杆菌CGMCC 1.26中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物，其特征在于，益生菌菌液扩大混合培养所用培养基中：所述葡萄糖的含量为0.5～3.0g/100mL、所述酵母粉的含量0.1～0.5g/100mL、所述酵母膏的含量0.1～0.6g/100mL、所述大豆肽粉的含量为0.1～1.0g/100mL。

3.根据权利要求1所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物，其特征在于，益生菌菌液扩大混合培养所用培养基中：所述无机盐及含量为：FeSO₄·7H₂O 5.0～15.0mg/100mL、ZnSO₄·7H₂O 4.4～13.2mg/100mL、MgSO₄·7H₂O 30～90mg/100mL、KH₂PO₄ 100～300mg/100mL、K₂HPO₄·3H₂O 100～300mg/100mL。

4.根据权利要求1所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物，其特征在于，所述的甜味剂为三氯蔗糖，其添加量为：0.01～0.03g/100mL。

5.根据权利要求1所述的抗幽门螺杆菌感染的益生菌发酵中药组合物，其特征在于，所述的双歧杆菌为短双歧杆菌AS 1.2213，所述的肠球菌为粪肠球菌CGMCC 1.15424，所述的乳杆菌为罗伊氏乳杆菌CICC 6118、植物乳杆菌AS 1.19、嗜酸乳杆菌AS 1.1854。

6.权利要求1-5任一项所述的益生菌发酵中药组合物在制备预防和治疗幽门螺杆菌感染药物中的应用，其特征在于，所述的应用为：将所述的益生菌发酵中药组合物制成药剂学上可接受的胶囊剂、片剂、颗粒剂。

7.权利要求1-5任一项所述的益生菌发酵中药组合物在制备防治口腔幽门螺杆菌感染的药物中的应用。