CN116076721A

CN116076721A - 一种藤茶黄酮在制备美白剂中的应用

Info

Publication number: CN116076721A
Application number: CN202211665078.6A
Authority: CN
Inventors: 何美军; 李宇; 赵苓云; 孙慧茹; 谭旭辉; 罗建群; 方昕悦; 黄东海
Original assignee: Enshi Selenium Commander Ecological Agriculture Technology Development Co ltd; INSTITUTE OF CHINESE HERBAL MEDICINES HUBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: Enshi Selenium Commander Ecological Agriculture Technology Development Co ltd; INSTITUTE OF CHINESE HERBAL MEDICINES HUBEI ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2022-12-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2023-05-09

Abstract

本发明提供了一种藤茶黄酮在制备美白剂中的应用，属于功能性食品加工技术领域。本发明首次将藤茶黄酮用于制备美白剂，采用高效的体外酪氨酸酶催化反应筛选体系评价藤茶黄酮的美白活性，藤茶黄酮对酪氨酸酶的抑制IC₅₀值为3.24mg/mL。

Description

一种藤茶黄酮在制备美白剂中的应用

技术领域

本发明涉及功能性食品加工技术领域，尤其涉及一种藤茶黄酮在制备美白剂中的应用。

背景技术

目前，女性希望用美白化妆品减轻色斑，美白产品具有广阔的市场前景。酪氨酸酶是黑色素合成中的关键酶，酪氨酸酶的过量表达会致使黑色素生成过量进而引起引起黑雀斑、黑斑病、老年斑等各种色素性疾病。因此，寻找具有酪氨酸酶抑制活性的成分成为近年来国内外美白产业发展研究热点之一。化学合成的美白剂如熊果苷、维生素C等具有安全隐患、稳定性不佳或功效显现缓慢等缺点。植物来源的天然酪氨酸酶抑制剂，通过多途径、多系统、多靶点发挥美白功效，具有更小的毒副作用。因此，寻找新型植物美白成分的应用前景广阔。

发明内容

本发明的目的在于提供一种藤茶黄酮在制备美白剂中的应用，藤茶黄酮具有优异的酪氨酸酶抑制活性功效。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种藤茶黄酮在制备美白剂中的应用。

优选的，所述藤茶黄酮中黄酮成分包括二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素，所述二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素在藤茶黄酮中的含量分别为395.47±3.53mg/g、36.78±3.28mg/g、39.42±6.81mg/g和22.51±5.49mg/g。

优选的，所述藤茶黄酮的提取方法包括以下步骤：

将藤茶废料和乙醇混合，进行超声提取，分离后，得到提取液；

将所述提取液进行真空冷冻干燥，得到藤茶黄酮。

优选的，所述藤茶废料的粒度≤75μm。

优选的，所述藤茶废料和乙醇的料液比为1kg:(40～50)L。

优选的，所述超声提取的时间为25～30min，温度为30～40℃，功率为200～220W。

优选的，所述真空冷冻干燥的真空度为-20～-25Hg，温度为-40～-45℃，时间为10～12h。

优选的，采用HPLC外标法检测所述藤茶黄酮；所述HPLC外标法所用流动相A相为乙酸+甲醇混合水溶液，所述流动相A相中，乙酸的体积分数为0.1～0.12％，甲醇的体积分数为5～6％；流动相B相为甲醇+乙酸混合溶剂，所述流动相B相中，乙酸的体积分数为0.1～0.12％；流速1～1.2mL/min。

优选的，所述HPLC外标法的梯度洗脱条件为：0→20.5min，A相100％→20％；20.5→23.5～24.0min，A相20％→0％；24.5→27.0～27.5min，A相0％→0％；27.5→30.0～30.5min，A相100％→100％。

优选的，所述HPLC外标法检测的检测波长为265～285nm。

本发明提供了一种藤茶黄酮在制备美白剂中的应用。本发明首次将藤茶黄酮用于制备美白剂，采用高效的体外酪氨酸酶催化反应筛选体系评价藤茶黄酮的美白活性，藤茶黄酮对酪氨酸酶的抑制IC₅₀值为3.24mg/mL。

进一步的，本发明采用乙醇提取藤茶废料，所提取的藤茶黄酮提取物的得率达421.16±13.47mg/g，能够实现高效提取藤茶中美白活性成分(藤茶黄酮)，方法操作简便，成本低，重复性好，为藤茶废料的开发为更高功效的美白产品和功能性食品方面的运用提供基础。

进一步的，本发明采用HPLC外标法检测并定量藤茶黄酮提取物中主要黄酮类成分为二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素，二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、花旗松素含量分别为395.47±3.53、36.78±3.28、39.42±6.81、22.51±5.49mg/g(杨梅素、二氢杨梅素含量高于现有方法提取获得的藤茶提取物，二氢杨梅素≤300mg/g、杨梅素≤30mg/g、杨梅苷≤20mg/g、花旗松素≤10mg/g)，其酪氨酸酶抑制IC₅₀值分别为3.45、1.00、7.76、6.13mmoL/L；所得藤茶黄酮提取物的酪氨酸酶抑制IC₅₀值为3.24mg/mL。本发明限定洗脱条件，使得四种黄酮成分具有很好的分离度，且重复性好，峰面积测量值的RSD≤5％；具有宽的线性范围15～600μg/mL和线性相关性R²≧0.999。此外，HPLC外标法检测定量联合紫外吸收光谱对比、保留时间分析的方法检测，对藤茶提取物中黄酮类化合物进行分析定量，具有精确、重复性高、可操作性强的优点。

综上，本发明以乙醇作为提取溶剂，超声辅助提取，HPLC检测主要黄酮类活性成分，构建高效的体外酪氨酸酶催化反应筛选体系，高效提取藤茶中美白活性成分。

附图说明

图1为优质藤茶原料(A、B)与藤茶“废料”实物照片(C、D)；

图2为采用HPLC建立的黄酮标准曲线图；

图3为藤茶黄酮提取物及黄酮标准品对TYR酶反应体系HPLC谱图；

图4为不同浓度的黄酮标准品抑制TYR酶的抑制率；

图5为不同浓度实施例1所得藤茶黄酮提取物抑制TYR酶的抑制率；

图6为实施例1所得藤茶黄酮提取物及主要黄酮抑制黑色素生成过程图。

具体实施方式

本发明提供了一种藤茶黄酮在制备美白剂中的应用。

在本发明中，若无特殊说明，所需材料或试剂均为本领域技术人员熟知的市售商品。

本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，按照本领域熟知的方法应用即可。

在本发明中，所述藤茶黄酮中黄酮成分优选包括二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素，所述二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素在藤茶黄酮中的含量分别优选为395.47±3.53mg/g、36.78±3.28mg/g、39.42±6.81mg/g和22.51±5.49mg/g。

在本发明中，所述藤茶黄酮的提取方法优选包括以下步骤：

将所述提取液进行真空冷冻干燥，得到藤茶黄酮。

在本发明中，所述藤茶废料优选为藤茶加工企业的碎末、“白霜”等形成的边角废料。本发明对所述藤茶废料的获取没有特殊的限定，按照本领域熟知的方式获取即可。

在本发明中，所述藤茶废料的粒度优选≤75μm。本发明优选将所述藤茶废料用粉碎机(ZGP-2320Q)粉碎后，过200目筛，达到所需粒径。本发明以藤茶废料为原料，能够实现藤茶废料的综合利用，变废为宝；以乙醇为提取溶剂，乙醇毒性较甲醇、乙酸乙酯等具有更小的毒性。同时，限定藤茶废料的粒度，避免粒度太大与乙醇作用不充分，活性成分提取不完全；避免粒度太小，加大粉碎成本，形成的粉尘对加工人员身体不利。

在本发明中，所述藤茶废料和乙醇的料液比优选为1kg:(40～50)L，更优选为1kg:45L。

本发明对所述藤茶废料和乙醇混合没有特殊的限定，按照本领域熟知的方式将物料混合均匀即可。

在本发明中，所述超声提取的时间优选为25～30min，温度优选为30～40℃，更优选为35℃，功率优选为200～220W，更优选为210W；所述超声提取的次数优选为2～3次；所述超声提取所用仪器优选为kq5200e型超声波仪。藤茶中主要活性成分二氢杨梅素、杨梅素等活性结构含有丰富的不饱和双键，容易被空气中的氧气、光照、高温等破坏失去活性；过大溶剂比例、过长提取时间会加大提取成本。本发明采用低温短时的活性成分提取方法，避免活性成分损失，提高了黄酮活性成分的含量。

完成所述超声提取后，本发明优选将所得产物用离心机(型号200)，1000目滤袋离心过滤，得到提取液；所述离心过滤的转速优选为3000～4000r/min，更优选为3500r/min。

得到提取液后，本发明将所述提取液进行真空冷冻干燥，得到藤茶黄酮。

在本发明中，所述真空冷冻干燥的真空度优选为-20～-25Hg，温度优选为-40～-45℃，时间优选为10～12h，更优选为11h；所述冷冻干燥所用仪器优选为冷冻干燥机(SCIENTZ-30F)。本发明采用低温冷冻干燥能极大程度保持提取物中易高温变质的活性成分，获得具有美白活性的藤茶黄酮提取物，同时能减小提取成本。

得到所述藤茶黄酮后，本发明优选采用HPLC外标法检测所述藤茶黄酮，并定量藤茶黄酮的含量，步骤优选包括；

1)采用乙醇配制二氢杨梅素(160～200μg/mL)、杨梅素(160～200μg/mL)、杨梅苷(160～200μg/mL)、花旗松素(160～200μg/mL)标准品溶液，分别稀释成160～140、120～140、100～80、60～40、30～20μg/mL系列标准品溶液；

2)采用乙醇配制浓度为40～50μg/mL的藤茶黄酮溶液；

3)通过HPLC外标法检测标准品溶液，建立标准曲线，然后采用HPLC外标法检测藤茶黄酮溶液，根据标准曲线定量藤茶黄酮溶液中黄酮含量；所述HPLC外标法所用检测器优选为PDA二极管阵列检测器，检测波长优选为265～285nm，更优选为270nm，同时全波长扫描检测化合物的吸收光谱；所述HPLC外标法所用流动相A相优选为乙酸+甲醇混合水溶液，所述流动相A相中，乙酸的体积分数为0.1～0.12％，甲醇的体积分数为5～6％；流动相B相为甲醇+乙酸混合溶剂，所述流动相B相中，乙酸的体积分数为0.1～0.12％，流速优选为1～1.2mL/min；所述HPLC外标法的梯度洗脱条件优选为：0→20.5min，A相100％→20％；20.5→23.5～24.0min，A相20％→0％；24.5→27.0～27.5min，A相0％→0％；27.5→30.0～30.5min，A相100％→100％。

本发明优选建立酪氨酸酶(TYR)抑制活性评价方法：

黄酮标准品用二甲基亚砜(DMSO)溶解，浓度为80～100mmoL/mL，并稀释成100～80、60～40、20～10、5～2.5、1.25～0.75mmoL/mL标准品溶液；

藤茶黄酮提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，浓度为40～60mg/mL，并稀释成60～40、20～10、5～2.5、1.25～0.75、0.75～0.35mg/mL；

酪氨酸酶反应体系400μL：TYR酶80～100μL(酶总活性2～2.5U)；藤茶黄酮提取物/黄酮标准品50～75uL；酪氨酸50～60μL(浓度0.23～0.25mmoL/L)，剩余体积用磷酸缓冲溶液(pH 6.8～7.0)补齐400μL；将所述酪氨酸酶反应体系在37℃反应40～50min，93～95℃灭活，通过HPLC外标法检测(检测波长265～285nm)酪氨酸被反应的量；流动相A相优选为乙酸+甲醇混合水溶液，所述流动相A相中，乙酸的体积分数为0.1～0.12％，甲醇的体积分数为5～6％；流动相B相为甲醇+乙酸混合溶剂，所述流动相B相中，乙酸的体积分数为0.1～0.12％，流速1～1.2mL/min。梯度洗脱条件：0.1→16～16.5min，A相100％→0％；时间16.5→20.0～20.5min，A相0％→0％；时间20.5→23.0min，A相100％→100％，通过酪氨酸被反应的量计算藤茶黄酮提取物、黄酮标准品对酪氨酸酶抑制率，计算其IC₅₀值。

本发明通过构建高效的体外酪氨酸酶催化反应体系，深度还原体内黑色素生成过程；通过HPLC精确分析检测酪氨酸氧化减少量，精确、可靠地检测藤茶提取物、主要黄酮的体外抑制酪氨酸酶的美白活性。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下各实施例所用原料和设备：

藤茶“废料”：咸丰县筒车坝藤茶专业合作社；

溶剂乙醇：国药集团化学试剂有限公司；

粉碎机：广东中科华恒科技有限公司；

分离筛：安平县腾德金属丝网制品有限公司；

kq5200e型超声波仪：昆山舒美超声仪器有限公司；

冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；

二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、花旗松素标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

酪氨酸酶：上海麦克林生化科技股份有限公司；

C18色谱柱:阿克苏·诺贝尔公司；

高效液相色谱仪：安捷伦科技(中国)有限公司；

离心机(型号200)：张家港市乐余电机设备厂；

滤袋：佛山市精柯纺织印染设备有限公司。

实施例1

将藤茶废料(图1中C和D)10kg用粉碎机(ZGP-2320Q)粉碎，过200目筛，得到藤茶样品，粒度≤75μm；

采用kq5200e型超声波仪，以乙醇为提取溶剂，按料液比1:45(kg:L)与粉碎后藤茶废料混合，提取时间30min，提取温度35℃，功率210w，将所得产物用离心机(型号200)，设置3500r/min、1000目滤袋离心过滤，得到提取液；

将所述提取液采用冷冻干燥机(SCIENTZ-30F)进行冷冻干燥，真空度-25Hg，温度-45℃，时间为12h，得到藤茶黄酮提取物。

对比例1

与实施例1的区别仅在于：以优质藤茶为原料(图1中A和B)。

对比例2

与实施例1的区别仅在于：过400目筛，得到藤茶样品粉碎的粒度≤37.5μm。

对比例3

与实施例1的区别仅在于：提取料液比1:30。

对比例4

与实施例1的区别仅在于：提取时间20min。

对比例5

与实施例1的区别仅在于：提取温度45℃。

对比例6

与实施例1的区别仅在于：超声功率180W。

对比例7

与实施例1的区别仅在于：真空度-15Hg。

对比例8

与实施例1的区别仅在于：真空冷冻干燥温度-30℃。

对比例9

与实施例1的区别仅在于：采用旋转蒸发浓缩干燥提取液，干燥条件：真空度-25Hg，温度40℃，转速200r/min，时间为50min，得到藤茶黄酮提取物浸膏。

检测与活性验证

1、藤茶黄酮含量检测

采用乙醇配制浓度均为200μg/mL的二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、花旗松素标准品母液，分别稀释成200、160、120、80、40μg/mL系列标准品溶液；

采用乙醇配制浓度为40μg/mL藤茶黄酮溶液；

通过HPLC外标法检测标准品溶液，建立标准曲线，然后采用HPLC外标法检测藤茶黄酮溶液，根据标准曲线定量藤茶黄酮溶液中黄酮含量；所述HPLC外标法所用检测器为PDA二极管阵列检测器，检测波长270nm，同时全波长扫描检测化合物的吸收光谱；所述HPLC外标法所用流动相A相为水溶液(体积分数0.1％乙酸，体积分数5％甲醇)，流动相B相为甲醇(含有体积分数0.1％乙酸)，流速为1mL/min；所述HPLC外标法的梯度洗脱条件为：0→20min，A相100％→20％；时间20.1→24.5min，A相20％→0％；时间24.5→27.0min，A相0％→0％；时间27.5→30min，A相100％→100％。

图2为采用HPLC建立的黄酮标准曲线图，标准曲线分别为：

y_{二氢杨梅素}＝5.146×x+30.92，R²＝0.9990；

y_杨梅苷＝43.81×x+408.8，R²＝0.9993；

y_花旗松素＝17.26×x-151.0，R²＝0.9998；

y_杨梅素＝41.04×x-23.81，R²＝0.9995(y为吸收峰面积，x为对应标准品浓度μg/mL)。

由图2可知，二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、花旗松素的检测方法具有宽的线性范围15～600μg/mL和线性相关性R²≧0.999。

2、酪氨酸酶(TYR)抑制活性评价方法：

将黄酮标准品(二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、花旗松素)分别用二甲基亚砜(DMSO)溶解，使其浓度为100mmoL/mL，并稀释成100、60、20、5、1.25、0.75mmoL/mL，得到系列黄酮标准品溶液；

将实施例1制备的藤茶黄酮提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，使其浓度为40mg/mL，并稀释成40、20、10、5、2.5mg/mL，得到系列藤茶黄酮提取物溶液，将该系列浓度的提取物溶液分别等体积加入到酪氨酸酶反应体系中，测定对应浓度的抑制率，再运用log(inhitor)vs.normalized response进行拟合，计算藤茶黄酮提取物的IC₅₀值。

酪氨酸酶反应体系400μL：TYR酶100μL(酶总活性2.5U)；藤茶黄酮提取物溶液或黄酮标准品溶液50uL；酪氨酸50μL(浓度0.23mmoL/L)，剩余体积用磷酸缓冲溶液(pH 7.0)补齐至400μL，将所得酪氨酸酶反应体系在37℃反应40min，95℃灭活，通过HPLC外标法检测(检测波长270nm)被反应的酪氨酸的量；流动相A相水溶液(含有体积分数0.1％乙酸，体积分数5％甲醇)，B相甲醇(含有体积分数0.1％乙酸)，流速1mL/min；梯度洗脱条件：时间0→16.0min，A相100％→0％；时间16.1→20.5min，A相0％→0％；时间20.5→23.0min，A相100％→100％。

首先利用所述酪氨酸酶反应体系按照所述系列黄酮标准品溶液建立标准曲线，A(酪氨酸+缓冲溶液PBS+TYR酶+抑制剂(黄酮标准品浓度1mmoL/mL)；B(酪氨酸+缓冲溶液PBS+TYR酶+抑制剂(黄酮标准品浓度0.5mmoL/mL)；C(酪氨酸+缓冲溶液PBS+TYR酶+抑制剂(黄酮标准品浓度0.25mmoL/mL)；D(酪氨酸+缓冲溶液PBS+TYR酶+抑制剂(黄酮标准品浓度0.125mmoL/mL)；E(酪氨酸+缓冲溶液PBS+TYR酶+抑制剂(黄酮标准品浓度0.075mmoL/mL)，测定对应浓度标准品对酪氨酸酶的抑制率，再运用log(inhitor)vs.normalized response进行拟合，计算标准品的IC₅₀值；

HPLC建立的标准曲线为：y_酪氨酸＝1316×x+24.30，R²＝0.9994(y为吸收峰面积，x为对应标准品溶液的浓度μg/mL)。

设置实验组：酪氨酸+TYR酶+抑制剂藤茶黄酮提取物(实施例1，浓度为1mg/mL)；酪氨酸+TYR酶+抑制剂二氢杨梅素(浓度为1mmoL/mL)；酪氨酸+TYR酶+抑制剂花旗松素(浓度为1mmoL/mL)；酪氨酸+TYR酶+抑制剂杨梅苷(浓度为1mmoL/mL)；酪氨酸+TYR酶+抑制剂杨梅素(浓度为1mmoL/mL)；

空白组：酪氨酸；

阳性对照组:酪氨酸+TYR酶；

通过HPLC检测酪氨酸被反应的量，所得HPLC谱图见图3(注：箭头所指为酪氨酸的峰)；由图3可知，与阳性对照比较酪氨酸峰的高度，实验组均有酪氨酸没有被反应，说明TYR酶催化活性受到抑制，证明藤茶黄酮提取物和主要黄酮对TYR酶均有显著抑制活性；其次相同浓度的实验组相比，酪氨酸的峰高依次为杨梅素、提取物、二氢杨梅素、杨梅苷、花旗松素，证明对TYR酶抑制活性的强弱顺序为：杨梅素>提取物>二氢杨梅素>杨梅苷>花旗松素。

根据图3计算藤茶黄酮提取物或黄酮标准品对酪氨酸酶的抑制率，计算公式如下：

抑制率(％)＝(n_实验组-n_{阳性对照组})/(n_空白组-n_{阳性对照组})，n为各组的酪氨酸浓度。

所得结果见图4～5；图4为不同浓度的黄酮标准品抑制TYR酶的抑制率；

图5为不同浓度实施例1所得藤茶黄酮提取物抑制TYR酶的抑制率。

通过图4～5的抑制率与抑制剂的浓度关系计算IC₅₀值，使用软件GraphPad Prism8.0.1中log(inhitor)vs.normalized response方法计算IC₅₀值，评价其美白活性，所得结果见表1，表1中，得率和含量为三次测定平均值。

表1实施例1中藤茶黄酮提取物得率及主要黄酮含量和美白活性

注：同一列不同小写字母代表具有显著性差异

由表1可知，本发明所提取的藤茶黄酮可使实施例1提取物的美白活性显著显著优于对比例，同时也具有较高的提取物得率。且与选用优质藤茶为原料的对比例1相比，其提取物得率、主要黄酮含量、美白活性均无显著性差异，因此，藤茶废料可以作为优质提取原料替代优质藤茶，降低生产成本；虽然对比例2、3、4、6、7能微弱减小成本，但是其显著降低了提取物得率；对比对比例5、8、9，提高提取温度、干燥温度、或者常温浓缩干燥能显著增加提取物率，在一定程度上增加杨梅苷、花旗松素的含量，但是高温会破坏具有更强美白活性的二氢杨梅素、杨梅素等活性成分结构，导致提取物的整体美白活性下降。

图6为实施例1所得藤茶黄酮提取物及主要黄酮抑制黑色素生成过程图，其中，1.酪氨酸；2.酪氨酸+TYR酶+杨梅苷；3.酪氨酸+TYR酶+藤茶黄酮提取物；4.酪氨酸+TYR酶+二氢杨梅素；5.酪氨酸+TYR酶+花旗松素；6.酪氨酸+TYR酶+杨梅素；7.酪氨酸+TYR酶；由图6可知：与阳性对照组相比，实验组的黑色素生成量显著减少，说明TYR酶催化活性受到抑制，证明藤茶提取物及其主要黄酮对TYR酶均有显著的抑制活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种藤茶黄酮在制备美白剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述藤茶黄酮中黄酮成分包括二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素，所述二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素在藤茶黄酮中的含量分别为395.47±3.53mg/g、36.78±3.28mg/g、39.42±6.81mg/g和22.51±5.49mg/g。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述藤茶黄酮的提取方法包括以下步骤：

将所述提取液进行真空冷冻干燥，得到藤茶黄酮。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述藤茶废料的粒度≤75μm。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述藤茶废料和乙醇的料液比为1kg:(40～50)L。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述超声提取的时间为25～30min，温度为30～40℃，功率为200～220W。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述真空冷冻干燥的真空度为-20～-25Hg，温度为-40～-45℃，时间为10～12h。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用HPLC外标法检测所述藤茶黄酮；所述HPLC外标法所用流动相A相为乙酸+甲醇混合水溶液，所述流动相A相中，乙酸的体积分数为0.1～0.12％，甲醇的体积分数为5～6％；流动相B相为甲醇+乙酸混合溶剂，所述流动相B相中，乙酸的体积分数为0.1～0.12％，流速1～1.2mL/min。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述HPLC外标法的梯度洗脱条件为：0→20.5min，A相100％→20％；20.5→23.5～24.0min，A相20％→0％；24.5→27.0～27.5min，A相0％→0％；27.5→30.0～30.5min，A相100％→100％。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述HPLC外标法检测的检测波长为265～285nm。