CN116196362A - 一种藤茶黄酮在制备降尿酸药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种藤茶黄酮在制备降尿酸药物中的应用，属于功能性食品加工技术领域。本发明首次将藤茶黄酮用于制备降尿酸药物，采用黄嘌呤氧化酶抑制活性评价藤茶黄酮的降尿酸活性，藤茶黄酮对黄嘌呤氧化酶(XOD)的抑制IC₅₀值为1.22mg/mL。

Description

一种藤茶黄酮在制备降尿酸药物中的应用

技术领域

本发明涉及功能性食品加工技术领域，尤其涉及一种藤茶黄酮在制备降尿酸药物中的应用。

背景技术

高尿酸血症是痛风的发病基础和主要生化特征，会发展成为痛风或慢性肾脏疾病。由于高尿酸症的发病机制复杂，目前已有的降尿酸化学药物别嘌呤醇等，存在损坏胃肠道、肝、心脑血管疾病等副作用。因此，迫切需要研发新型无副作用的降尿酸药物。植物来源的天然药物，通过多途径、多系统、多靶点发挥降尿酸功效，比西药化学药具有更小的毒副作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种藤茶黄酮在制备降尿酸药物中的应用，藤茶黄酮具有优异的降尿酸功效。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种藤茶黄酮在制备降尿酸药物中的应用。

优选的，所述藤茶黄酮中黄酮成分包括二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素，所述二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素在藤茶黄酮中的含量分别为360.17±24.17mg/g、42.17±8.72mg/g、26.39±5.47mg/g和16.58±4.62mg/g。

优选的，所述藤茶黄酮的提取方法包括以下步骤：

将藤茶废料和甲醇混合，进行超声提取，分离后，得到提取液；

将所述提取液进行真空冷冻干燥，得到藤茶黄酮。

优选的，所述藤茶废料的粒度≤75μm。

优选的，所述藤茶废料和甲醇的料液比为1kg:(30～40)L。

优选的，所述超声提取的时间为20～30min，温度为20～30℃，功率为190～200W。

优选的，所述真空冷冻干燥的真空度为-25～-30Hg，温度为-30～-35℃，时间为6～8h。

优选的，采用HPLC外标法检测所述藤茶黄酮；所述HPLC外标法所用流动相A相为体积分数0.1～0.12％乙酸水溶液，流动相B相为含有体积分数0.1～0.12％乙酸的乙腈，流速1～1.2mL/min。

优选的，所述HPLC外标法的梯度洗脱条件为：时间0→20～20.1min，A相100％→20％；时间20.1→25min，A相0％→0％；时间25.1→30min，A相100％→100％。

优选的，所述HPLC外标法检测的检测波长为265～285nm。

本发明提供了一种藤茶黄酮在制备降尿酸药物中的应用。本发明采用黄嘌呤氧化酶抑制活性评价藤茶黄酮的降尿酸活性，结果表明，藤茶黄酮对黄嘌呤氧化酶(XOD)的抑制IC₅₀值为1.22mg/mL。

进一步的，本发明采用甲醇提取藤茶废料，所提取的藤茶黄酮提取物的得率达359.44±18.14mg/g，能够实现高效提取藤茶中具有降尿酸的活性成分，方法操作简便，成本低，重复性好，为藤茶废料的开发利用提供参考。

进一步的，本发明采用HPLC外标法检测并定量藤茶黄酮提取物中主要黄酮类成分为二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素，二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、花旗松素含量分别为360.17±24.17、42.17±8.72、26.39±5.47、16.58±4.62mg/g(杨梅素、二氢杨梅素含量高于现有方法提取的藤茶提取物，二氢杨梅素≤300mg/g、杨梅素≤30mg/g、杨梅苷≤20mg/g、花旗松素≤10mg/g)，其黄嘌呤氧化酶抑制IC₅₀值分别为0.87、0.12、3.48、4.33mmoL/L；本发明限定洗脱条件，使得四种黄酮成分具有很好的分离度，且重复性好，峰面积测量值的RSD≤5％；具有宽的线性范围50～160μg/mL和线性相关性R²≧0.999；本发明采用全波长扫描获得光谱数据对比、保留时间对比，双重鉴定，能够增加检测结果的可靠性。此外，HPLC外标法检测定量联合紫外吸收光谱对比、保留时间分析的方法检测，对藤茶提取物中黄酮类化合物进行分析定量，具有精确、重复性高、可操作性强的优点。

综上，本发明以甲醇作为提取溶剂，超声辅助提取，HPLC检测主要黄酮类活性成分，构建高效的体外黄嘌呤氧化酶催化反应筛选体系，能够高效提取藤茶中降尿酸活性成分。

附图说明

图1为优质藤茶原料(A、B)与藤茶“废料”实物照片(C、D)；

图2为藤茶黄酮提取物及藤茶主要黄酮混标HPLC图；

图3为藤茶黄酮提取物及主要黄酮标准品紫外吸收光谱图(A为二氢杨梅素；B为杨梅苷；C为花旗松素；D为杨梅素)；

图4为采用HPLC建立的黄酮标准曲线图；

图5为藤茶黄酮提取物及黄酮标准品对XOD酶反应体系HPLC谱图；

图6为不同浓度黄酮标准品抑制XOD酶的抑制率；

图7为不同浓度实施例1所得藤茶黄酮提取物抑制XOD酶的抑制率。

具体实施方式

本发明提供了一种藤茶黄酮在制备降尿酸药物中的应用。

在本发明中，若无特殊说明，所需材料或试剂均为本领域技术人员熟知的市售商品。

本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，按照本领域熟知的方法应用即可。

在本发明中，所述藤茶黄酮中黄酮成分优选包括二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素，所述二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素在藤茶黄酮中的含量分别优选为360.17±24.17mg/g、42.17±8.72mg/g、26.39±5.47mg/g和16.58±4.62mg/g。

在本发明中，所述藤茶黄酮的提取方法优选包括以下步骤：

将藤茶废料和甲醇混合，进行超声提取，分离后，得到提取液；

将所述提取液进行真空冷冻干燥，得到藤茶黄酮。

在本发明中，所述藤茶废料优选为藤茶加工企业的碎末、“白霜”等形成的边角废料。本发明对所述藤茶废料的获取没有特殊的限定，按照本领域熟知的方式获取即可。

在本发明中，所述藤茶废料的粒度优选≤75μm。本发明优选将所述藤茶废料用粉碎机(ZGP-2320Q)粉碎后，过200目筛，达到所需粒径。本发明以藤茶废料为原料，能够实现藤茶废料的综合利用，变废为宝。同时，限定藤茶废料的粒度，避免粒度太大与甲醇作用不充分，活性成分提取不完全；避免粒度太小，加大粉碎成本，形成的粉尘对加工人员身体不利。

在本发明中，所述藤茶废料和甲醇的料液比优选为1kg:(30～40)L，更优选为1kg:35L。

本发明对所述藤茶废料和甲醇混合没有特殊的限定，按照本领域熟知的方式将物料混合均匀即可。

在本发明中，所述超声提取的时间优选为20～30min，温度优选为20～30℃，功率优选为190～200W；所述超声提取的次数优选为2～3次；所述超声提取所用仪器优选为kq5200e型超声波仪。藤茶中主要活性成分二氢杨梅素、杨梅素等活性结构含有丰富的不饱和双键，容易被空气中的氧气、光照、高温等破坏失去活性；过大溶剂比例、过长提取时间会加大提取成本。本发明采用低温短时的活性成分提取方法，避免活性成分损失，提高了黄酮活性成分的含量。

完成所述超声提取后，本发明优选将所得产物用离心机(型号200)，1000目滤袋离心过滤，得到提取液；所述离心过滤的转速优选为2300～3500r/min。

得到提取液后，本发明将所述提取液进行真空冷冻干燥，得到藤茶黄酮。

在本发明中，所述真空冷冻干燥的真空度优选为-25～-30Hg，温度优选为-30～-35℃，时间优选为6～8h，更优选为7h；所述冷冻干燥所用仪器优选为冷冻干燥机(SCIENTZ-30F)。本发明采用低温冷冻干燥能极大程度保持提取物中易高温变质的活性成分，获得具有降尿酸活性的藤茶黄酮提取物，同时能减小提取成本。

得到所述藤茶黄酮后，本发明优选采用HPLC外标法检测所述藤茶黄酮，并定量藤茶黄酮的含量，步骤优选包括；

1)采用甲醇配制二氢杨梅素(180～200μg/mL)、杨梅素(180～200μg/mL)、杨梅苷(180～200μg/mL)、花旗松素(180～200μg/mL)标准品溶液，分别稀释成160～150μg/mL、140～120μg/mL、110～100μg/mL、90～80μg/mL、60～50μg/mL系列标准品溶液；

2)采用甲醇配制浓度为1～2.0μg/mL的藤茶黄酮溶液；

3)通过HPLC外标法检测标准品溶液，建立标准曲线，然后采用HPLC外标法检测藤茶黄酮溶液，根据标准曲线定量藤茶黄酮溶液中黄酮含量；所述HPLC外标法所用检测器优选为PDA二极管阵列检测器，检测波长优选为265～285nm，更优选为270nm，同时全波长扫描检测化合物的吸收光谱；所述HPLC外标法所用流动相A相优选为体积分数0.1～0.12％乙酸水溶液，流动相B相为含有体积分数0.1～0.12％乙酸的乙腈，流速优选为1～1.2mL/min；所述HPLC外标法的梯度洗脱条件优选为：时间0→20～20.1min，A相100％→20％；时间20.1→25min，A相0％→0％；时间25.1→30min，A相100％→100％。本发明在流动相中添加乙酸防止黄酮峰在色谱柱上拖尾。

本发明优选建立黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制活性评价方法：

黄酮标准品用二甲基亚砜(DMSO)溶解，浓度为2～4mmoL/mL，并稀释成1～2、0.5～1、0.25～0.5、0.125～0.25、0.075～0.125mmoL/mL标准品溶液；

藤茶黄酮提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，浓度为20～40mg/mL，并稀释成10～20、5～10、2.5～5、1.25～2.5、0.75～1.25mg/mL；

黄嘌呤氧化酶反应体系400μL：XOD酶60～80μL(酶总活性1～2U)；藤茶黄酮提取物/黄酮标准品20～25uL；黄嘌呤100～120μL(浓度0.04mmoL/L)，剩余体积用磷酸缓冲溶液(pH6.5)补齐400μL；将所述黄嘌呤氧化酶反应体系在37℃反应28～31min，93～95℃灭活，通过HPLC外标法检测(检测波长265～285nm)黄嘌呤被反应的量；流动相A相体积分数0.1～0.12％乙酸水溶液，B相含有体积分数0.1～0.12％乙酸的乙腈，流速1～1.2mL/min。梯度洗脱条件：时间0→10～10.5min，A相95％→60％；时间10.1→13～13.8min，A相0％→0％；时间13.1→16min，A相95％→95％，通过黄嘌呤被反应的量计算藤茶黄酮提取物、黄酮标准品对黄嘌呤氧化酶抑制率，计算其IC₅₀值。

本发明通过构建高效的体外黄嘌呤氧化酶催化反应体系，深度模拟、还原人体内XOD催化黄嘌呤生成尿酸过程，为藤茶提取物及主要黄酮在人体内发挥降尿酸提供强有力的支持依据。与常规的酶标仪等检测手段相比，通过HPLC精确分析检测黄嘌呤氧化减少量，精确、可靠地评价藤茶提取物、主要黄酮的体外降尿酸活性，可以有效排除在波段265～285nm处有紫外吸收的杂质的干扰，提高检测的准确性。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下各实施例所用原料和设备：

藤茶“废料”：咸丰县筒车坝藤茶专业合作社；

溶剂甲醇、二氯甲烷：国药集团化学试剂有限公司；

粉碎机：广东中科华恒科技有限公司；

分离筛：安平县腾德金属丝网制品有限公司；

kq5200e型超声波仪：昆山舒美超声仪器有限公司；

冷冻干燥机：宁波新芝生物科技股份有限公司；

二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、花旗松素标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

黄嘌呤氧化酶：上海麦克林生化科技股份有限公司；

C18色谱柱:阿克苏·诺贝尔公司；

高效液相色谱仪：安捷伦科技(中国)有限公司；

离心机(型号200)：张家港市乐余电机设备厂；

滤袋：佛山市精柯纺织印染设备有限公司。

实施例1

将藤茶废料(图1中C和D)10kg用粉碎机(ZGP-2320Q)粉碎，过200目筛，得到藤茶样品，粒度≤75μm；

采用kq5200e型超声波仪，以甲醇为提取溶剂，按料液比1:35(kg:L)与粉碎后藤茶废料混合，提取时间25min，提取温度25℃，功率190w，将所得产物用离心机(型号200)，设置2300r/min、1000目滤袋离心过滤，得到提取液；

将所述提取液采用冷冻干燥机(SCIENTZ-30F)进行冷冻干燥，真空度-25Hg，温度-35℃，时间为7h，得到藤茶黄酮提取物。

对比例1

与实施例1的区别仅在于：以优质藤茶为原料(图1中A和B)。

对比例2

与实施例1的区别仅在于：过400目筛，得到藤茶样品粉碎的粒度≤37.5μm。

对比例3

与实施例1的区别仅在于：提取料液比1:20。

对比例4

与实施例1的区别仅在于：提取时间10min。

对比例5

与实施例1的区别仅在于：提取温度40℃。

对比例6

与实施例1的区别仅在于：超声功率180W。

对比例7

与实施例1的区别仅在于：真空度-10Hg。

对比例8

与实施例1的区别仅在于：真空冷冻干燥温度-10℃。

对比例9

与实施例1的区别仅在于：采用旋转蒸发浓缩干燥提取液，干燥条件：真空度-25Hg，温度40℃，转速200r/min，时间为40min，得到藤茶黄酮提取物浸膏。

检测与活性验证

1、藤茶黄酮含量检测

采用甲醇配制浓度均为200μg/mL的二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、花旗松素标准品母液，分别稀释成160、140、100、80、60μg/mL系列标准品溶液；

采用甲醇配制浓度为2.0μg/mL藤茶黄酮溶液；

通过HPLC外标法检测标准品溶液，建立标准曲线，然后采用HPLC外标法检测藤茶黄酮溶液，根据标准曲线定量藤茶黄酮溶液中黄酮含量；所述HPLC外标法所用检测器为PDA二极管阵列检测器，检测波长270nm，同时全波长扫描检测化合物的吸收光谱；所述HPLC外标法所用流动相A相为体积分数0.1％乙酸水溶液，流动相B相为乙腈(含有体积分数0.1％乙酸)，流速为1mL/min；所述HPLC外标法的梯度洗脱条件为：时间0→20min，A相100％→20％；时间20.1→25min，A相0％→0％；时间25.1→30min，A相100％→100％。

图2为藤茶黄酮提取物及藤茶主要黄酮混标HPLC图；

图3为藤茶黄酮提取物及主要黄酮标准品紫外吸收光谱图(A为二氢杨梅素；B为杨梅苷；C为花旗松素；D为杨梅素)；

图4为采用HPLC建立的黄酮标准曲线图，标准曲线分别为：

y_{二氢杨梅素}＝4.770×x-17.47，R²＝0.9998；

y_杨梅苷＝38.78×x+114.7，R²＝0.9996；

y_花旗松素＝9.610×x+139.7，R²＝0.9998；

y_杨梅素＝33.39×x-97.19，R²＝0.9994(y为吸收峰面积，x为对应标准品浓度μg/mL)。

由图4可知，二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、花旗松素检测方法具有宽的线性范围50～160μg/mL和线性相关性R²≧0.999。

2、黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制活性评价方法：

将黄酮标准品(二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷、花旗松素)分别用二甲基亚砜(DMSO)溶解，使其浓度为4mmoL/mL，并稀释成1、0.5、0.25、0.125、0.075mmoL/mL，得到系列黄酮标准品溶液；

将实施例1制备的藤茶黄酮提取物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，使其浓度为40mg/mL，并稀释成20、10、5、2.5、1.25mg/mL，得到系列藤茶黄酮提取物溶液，将该系列浓度的提取物溶液分别等体积加入到酪氨酸酶反应体系中，测定不同浓度的藤茶黄酮提取物对XOD酶的抑制率，再运用log(inhitor)vs.normalizedresponse进行拟合，计算藤茶黄酮提取物的IC₅₀值。

黄嘌呤氧化酶反应体系400μL：XOD酶80μL(酶总活性2U)；藤茶黄酮提取物溶液或黄酮标准品溶液25uL；黄嘌呤120μL(浓度0.04mmoL/L)，剩余体积用磷酸缓冲溶液(pH 6.5)补齐至400μL，将所得黄嘌呤氧化酶反应体系在37℃反应30min，95℃灭活，通过HPLC外标法检测(检测波长270nm)被反应的黄嘌呤的量；流动相A相体积分数0.1％乙酸水溶液，B相乙腈(含有体积分数0.1％乙酸)，流速1mL/min；梯度洗脱条件：时间0→10min，A相95％→60％；时间10.1→13min，A相0％→0％；时间13.1→16min，A相95％→95％。

首先利用所述黄嘌呤氧化酶反应体系按照所述系列黄酮标准品溶液建立标准曲线，A(黄嘌呤+缓冲溶液PBS+XOD酶+抑制剂(黄酮标准品浓度1mmoL/mL)；B(黄嘌呤+缓冲溶液PBS+XOD酶+抑制剂(黄酮标准品浓度0.5mmoL/mL)；C(黄嘌呤+缓冲溶液PBS+XOD酶+抑制剂(黄酮标准品浓度0.25mmoL/mL)；D(黄嘌呤+缓冲溶液PBS+XOD酶+抑制剂(黄酮标准品浓度0.125mmoL/mL)；E(黄嘌呤+缓冲溶液PBS+XOD酶+抑制剂(黄酮标准品浓度0.075mmoL/mL)，测定不同浓度标准品对酪氨酸酶的抑制率，再运用log(inhitor)vs.normalizedresponse进行拟合，计算标准品对XOD酶的抑制IC₅₀值；

HPLC建立的标准曲线为：y_黄嘌呤＝667.8×x+6.300，R²＝0.9994(y为吸收峰面积，x为对应标准品溶液的浓度μg/mL)。

设置实验组：黄嘌呤+XOD酶+抑制剂藤茶黄酮提取物(实施例1，浓度为1mg/mL)；黄嘌呤+XOD酶+抑制剂二氢杨梅素(浓度为1mmoL/mL)；黄嘌呤+XOD酶+抑制剂花旗松素(浓度为1mmoL/mL)；黄嘌呤+XOD酶+抑制剂杨梅苷(浓度为1mmoL/mL)；黄嘌呤+XOD酶+抑制剂杨梅素(浓度为1mmoL/mL)；

空白组：黄嘌呤；

阳性对照组:黄嘌呤+XOD酶；

通过HPLC检测黄嘌呤被反应的量，所得HPLC谱图见图5(注：箭头所指为黄嘌呤的峰)；由图5可知，与阳性对照组比较黄嘌呤峰的高度，实验组均有黄嘌呤没有被反应，说明XOD酶催化活性受到抑制，证明藤茶黄酮提取物和黄酮标准品对XOD酶均有显著抑制活性；其次相同浓度的实验组相比，黄嘌呤的峰高依次为杨梅素、提取物、二氢杨梅素、花旗松素、杨梅苷，证明对XOD酶抑制活性的强弱顺序为：杨梅素>提取物>二氢杨梅素>花旗松素>杨梅苷。

根据图5计算藤茶黄酮提取物或黄酮标准品对黄嘌呤氧化酶的抑制率，计算公式如下：

抑制率(％)＝(n_实验组-n_{阳性对照组})/(n_空白组-n_{阳性对照组})，n为各组的黄嘌呤浓度。

所得结果见图6～7；图6为不同浓度的黄酮标准品抑制XOD酶的抑制率；

图7为不同浓度实施例1所得藤茶黄酮提取物抑制XOD酶的抑制率。

通过图6～7的抑制率与抑制剂的浓度关系计算IC₅₀值，使用软件GraphPadPrism8.0.1中log(inhitor)vs.normalizedresponse方法计算IC₅₀值，评价其降尿酸活性，所得结果见表1，表1中，得率和含量为三次测定平均值。

表1实施例1中藤茶黄酮提取物得率及主要黄酮含量和降尿酸活性

注：同一列不同小写字母代表具有显著性差异

由表1可知，本发明所提取的藤茶黄酮可使实施例1提取物的降尿酸活性显著显著优于对比例，同时也具有较高的提取物得率。且与选用优质藤茶为原料的对比例1相比，其提取物得率、主要黄酮含量、降尿酸活性均无显著性差异，说明可以节省成本；虽然对比例2～4、6～7能微弱减小成本，但是其显著降低了提取物得率；对比例5、8、9，提高提取温度、干燥温度、或者常温浓缩干燥能显著增加提取物率，但是高温会破坏具有强降尿酸活性的二氢杨梅素、杨梅素等活性成分结构，导致提取物的降尿酸活性下降。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种藤茶黄酮在制备降尿酸药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述藤茶黄酮中黄酮成分包括二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素，所述二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷和花旗松素在藤茶黄酮中的含量分别为360.17±24.17mg/g、42.17±8.72mg/g、26.39±5.47mg/g和16.58±4.62mg/g。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述藤茶黄酮的提取方法包括以下步骤：

将藤茶废料和甲醇混合，进行超声提取，分离后，得到提取液；

将所述提取液进行真空冷冻干燥，得到藤茶黄酮。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述藤茶废料的粒度≤75μm。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述藤茶废料和甲醇的料液比为1kg:(30～40)L。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述超声提取的时间为20～30min，温度为20～30℃，功率为190～200W。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述真空冷冻干燥的真空度为-25～-30Hg，温度为-30～-35℃，时间为6～8h。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，采用HPLC外标法检测所述藤茶黄酮；所述HPLC外标法所用流动相A相为体积分数0.1～0.12％乙酸水溶液，流动相B相为含有体积分数0.1～0.12％乙酸的乙腈，流速1～1.2mL/min。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述HPLC外标法的梯度洗脱条件为：时间0→20～20.1min，A相100％→20％；时间20.1→25min，A相0％→0％；时间25.1→30min，A相100％→100％。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述HPLC外标法检测的检测波长为265～285nm。

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