CN116076438A - 类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物模型构建技术领域，具体地涉及一种类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型及其构建方法和应用。本发明提供的构建方法包括以下步骤：于大鼠尾根部皮下注射完全弗氏佐剂，N天后，采用雾化式给药装置向所述大鼠的肺部推注博来霉素溶液，M天后，完成所述类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建。本发明提供的构建方法能够实现无创制备类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型，具有可重复性强、易于操作的优点，构建得到的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型病理状态稳定，与人类疾病反应的病理程度差异性小。

Description

类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及动物模型构建技术领域，具体地涉及一种类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型及其构建方法和应用。

背景技术

类风湿关节炎是一种常见以关节滑膜慢性炎症、软骨及骨组织侵蚀，最终导致关节结构破坏为临床特征的慢性自身免疫性疾病。类风湿关节炎患者除关节表现外，可有全身多个器官和系统的受累，常合并多种疾病，其中间质性肺病是类风湿关节炎相关肺部疾病最常见的表现，其发生率是是普通人群的9倍，中位生存期仅为2.6年。临床表现为咳嗽、咳痰、进行性呼吸困难、乏力等，甚至出现不同程度的呼吸衰竭及继发性肺部感染，危及患者生命安全。因此，亟需深入研究类风湿关节炎合并间质性肺病的病理机制，研发切实有效的治疗药物与手段，以期延长患者生命，改善预后。

动物模型是研究人类疾病的重要途径之一。在动物水平建立具有类风湿关节炎合并间质性肺病特征的疾病模型，是探索类风湿关节炎合并间质性肺疾病发生发展机理、发现药物新靶点、进行临床前药效学评价的基础，亦是推动医药学发展的关键，具有重要的科学意义和临床意义。但目前，尚无公认使用、规范的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型造模方法。

CN110604098A公开了一种类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建方法，在胶原型关节炎小鼠模型构建后第4天，采用逐层分离组织暴露气管的方法，用微量注射器将博来霉素溶液注入气管。该模型构建方法过程繁琐，存在明显的创伤、刺激性大、疾病程度不均一等缺陷。

针对现有的操作技术，目前亟需一种操作方便，疾病程度均一、损伤小的方法制备类风湿关节炎合并间质性肺病模型。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建方法构建过程复杂、刺激性大、存在明显的创伤、疾病程度不均一等缺陷。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

于大鼠尾根部皮下注射完全弗氏佐剂，N天后，采用雾化式给药装置向所述大鼠的肺部推注博来霉素溶液，M天后，完成所述类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建；

其中，所述采用雾化式给药装置向所述大鼠的肺部注射博来霉素溶液包括以下步骤：

气管插管：将内置导引件的气管插管针插入所述大鼠的气管内，深入所述大鼠的声门下15-20mm处，取出所述导引件；

雾化给药：在所述气管插管成功后，将所述气管插管针暴露于所述大鼠体外的一端与所述雾化式给药装置相连接，推注所述博来霉素溶液；

所述N为0～14的整数，所述M为21～35的整数，所述N的计时起点为注射所述完全弗氏佐剂当天，所述M的计时起点为推注所述博来霉素溶液的当天。

优选地，所述N为7～9的整数，所述M为27～29的整数。

优选地，所述完全弗氏佐剂包含热灭活结核杆菌和矿物油，所述完全弗氏佐剂的注射剂量为0.1mL，其中，0.1mL所述完全弗氏佐剂含所述热灭活结核杆菌200μg～400μg。

优选地，所述博来霉素溶液的浓度为4mg/mL～5mg/mL；以所述大鼠的体质量为基准，所述博来霉素溶液的推注剂量为4mg/kg～5mg/kg。

优选地，所述气管插管成功的标准为：在所述导引件取出后，在所述气管插管针的暴露于所述大鼠体外的一端口放置棉花丝，所述棉花丝随着所述大鼠的呼吸晃动。

更优选地，在进行所述气管插管前，将所述大鼠进行麻醉固定处理。

更优选地，所述大鼠为雄性SD大鼠，体质量为220±20g。

更优选地，所述皮下注射的位置是在所述大鼠的背侧，并且距离所述大鼠的尾根部0.3cm～1cm处。

本发明第二方面提供本发明第一方面所述的构建方法构建的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型。

本发明第三方面提供本发明第二方面所述的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型在医药技术领域的应用。

本发明提供的构建方法能够实现无创制备类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型，具有可重复性强、易于操作的优点。构建得到的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型病理状态稳定，与人类疾病反应的病理程度差异性小，能够真实模拟类风湿关节炎合并间质性肺疾病的组织学特征和病理表现，同时，也能够模拟自身免疫病所导致的慢性进行性肺纤维化发展及微环境损伤修复过程，为后续的病理机制与疾病治疗研究提供了良好的动物模型实验平台。

附图说明

图1为本发明根据一种优选的实施方式提供的步骤1的实验操作示意图；

图2为本发明根据一种优选的实施方式提供的步骤2的实验操作示意图；

图3为本发明实施例1、对比例2、对比例3的大鼠在第7天的双后足肿胀临床特征图；

图4为本发明实施例1、对比例2、对比例3的大鼠的后足肿胀容积变化图；

图5为本发明实施例1、对比例2和对比例3的大鼠的平均关节炎评分曲线变化图；

图6为本发明实施例1、对比例2和对比例3的大鼠在第35天的肺组织HE染色图；

图7为本发明实施例1、对比例2、对比例3的大鼠在第35天的肺泡炎评分柱状示意图；

图8为本发明实施例1、对比例2和对比例3的大鼠在第35天的肺组织Masson染色图；

图9为本发明实施例1、对比例2、对比例3的大鼠在第35天的肺纤维化程度评分柱状示意图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

如前所述，本发明的第一方面提供了一种类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

于大鼠尾根部皮下注射完全弗氏佐剂，N天后，采用雾化式给药装置向所述大鼠的肺部推注博来霉素溶液，M天后，完成所述类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建；

其中，所述采用雾化式给药装置向所述大鼠的肺部注射博来霉素溶液包括以下步骤：

气管插管：将内置导引件的气管插管针插入所述大鼠的气管内，深入所述大鼠的声门下15-20mm处，取出所述导引件；

雾化给药：在所述气管插管成功后，将所述气管插管针暴露于所述大鼠体外的一端与所述雾化式给药装置相连接，推注所述博来霉素溶液；

所述N为0～14的整数，所述M为21～35的整数。所述N的计时起点为注射所述完全弗氏佐剂当天，也就是说，以注射完全弗氏佐剂的当天为第0天，注射完全弗氏佐剂第0天～14天后，采用雾化式给药装置向所述大鼠的肺部推注博来霉素溶液；所述M的计时起点为推注所述博来霉素溶液的当天，也就是说，以推注所述博来霉素溶液的当天为第0天，推注所述博来霉素溶液第21天～35天后，完成所述类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建。

本发明提供的构建方法对实验动物的刺激性小，能够在不损伤实验动物正常生理结构的情况下制备类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型，具有可重复性强、易于操作的优点，构建得到的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型病理状态稳定，与人类疾病反应的病理程度差异性小，能够真实模拟类风湿关节炎合并间质性肺疾病的组织学特征和病理表现，同时，也能够模拟自身免疫病所导致的慢性进行性肺纤维化发展及微环境损伤修复过程，为后续的病理机制与疾病治疗研究提供了良好的动物模型实验平台。

根据本发明一些优选的实施方式，所述N为7～9的整数，所述M为27～29的整数。该优选情况下，构建得到的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型病理程度差异更小、病理状态更加稳定。

根据本发明一些优选的实施方式，所述完全弗氏佐剂包含热灭活结核杆菌和矿物油，所述完全弗氏佐剂的注射剂量为0.1mL，其中，0.1mL所述完全弗氏佐剂含所述热灭活结核杆菌200μg～400μg。

根据本发明一些优选的实施方式，所述皮下注射的位置是在所述大鼠的背侧，并且距离所述大鼠的尾根部0.3cm～1cm处。

根据本发明一些优选的实施方式，所述大鼠为雄性SD大鼠，体质量为220±20g。本发明的方法采用该优选的雄性SD大鼠的模型构建成功率100％。该优选情况下，本发明提供的方法具有模型构建成功率更高、重复性好、与人类疾病反应的病理程度差异性更小的优点。

根据本发明一些更加优选的实施方式，所述大鼠在注射所述完全弗氏佐剂之前还经过一周的适应性饲养。

根据本发明一些优选的实施方式，所述气管插管针的型号为18G，所述导引件为所述气管插管针自带的钢芯。该优选型号的气管插管针，对所述大鼠的刺激性更小，能够实现无创构建动物模型。

根据本发明一些优选的实施方式，所述博来霉素溶液的浓度为4mg/mL～5mg/mL，溶剂为0.8wt％～1.0wt％的生理盐水；以所述大鼠的体质量为基准，所述博来霉素溶液的推注剂量为4mg/kg～5mg/kg。

根据本发明一些更加优选的实施方式，所述博来霉素溶液为硫酸博来霉素溶液。

根据本发明一些优选的实施方式，所述博来霉素溶液的推注时间不超过2s。该优选情况下，能够使得所述博来霉素溶液更均匀地以雾化状态分布于所述大鼠的肺组织。

根据本发明一些优选的实施方式，所述气管插管成功的标准为：在所述导引件取出后，在所述气管插管针的暴露于所述大鼠体外的一端口放置棉花丝，棉花丝随着所述AIA模型大鼠的呼吸晃动。

根据本发明一些优选的实施方式，在进行所述气管插管前，将所述大鼠进行麻醉固定处理。

根据本发明一些更加优选的实施方式，所述麻醉固定处理以腹腔注射麻醉剂的方式进行，所述麻醉剂为2wt％～5wt％的戊巴比妥钠溶液。

根据本发明一些更加优选的实施方式，以所述大鼠的体质量为基准，所述戊巴比妥钠溶液的注射剂量为3mL/kg～5mL/kg。

根据本发明一些优选的实施方式，所述麻醉固定处理按照如下方式进行：向所述大鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液后，得到麻醉状态的大鼠，将麻醉状态的大鼠仰面放置于约60°～70°的倾斜鼠板上，四肢和上切牙分别用橡皮筋和尼龙绳固定在大鼠手术台上，头部朝向实验者。

本发明的第二方面提供了本发明第一方面所述的构建方法构建的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型。

本发明的第二方面提供的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型，病理状态稳定，与人类疾病反应的病理程度差异性小，能够真实模拟类风湿关节炎合并间质性肺疾病的组织学特征和病理表现，同时，也能够模拟自身免疫病所导致的慢性进行性肺纤维化发展及微环境损伤修复过程，为后续的病理机制与疾病治疗研究提供了良好的动物模型实验平台。

本发明的第三方面提供了本发明第二方面所述的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型在医药技术领域的应用。

本发明提供的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型能够用于研究类风湿关节炎合并间质性肺疾病相关疾病的机制、研究类风湿关节炎合并间质性肺疾病及相关疾病的药物筛选和治疗方法。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

完全弗氏佐剂(CFA)：采用手工研磨法将热灭活结核杆菌和矿物油混合制得，其中，每1mLCFA含热灭活结核杆菌300μg。

热灭活结核杆菌(Mtb)H37Ra，购于美国BD公司，牌号为6183641；

矿物油，购于美国Sigma-Aldrich公司，牌号为M8410；

硫酸博来霉素，购自美国Selleck公司，牌号为NSC125066，规格50mg/瓶；

雾化式给药装置购自北京易则佳科技有限公司，型号为HY-LWH02；

气管插管针，型号18G，带钢芯，购于南京卡尔文生物科技有限公司；

Masson试剂盒，购于北京索莱宝科技有限公司，型号为G1340；

足肿测定仪，购于意大利UGO公司，型号为Basile 37140；

注射器，购于瑞士Hamilton公司，型号250μL；

电子天平，购于日本岛津公司，型号ATY224。

60只雄性SD大鼠，体质量220±20g，在进行模型构建前经过7天适应性饲养。将60只雄性SD大鼠随机分为6组(每组10只)，6组雄性SD大鼠分别以下述实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2和对比例3的方式进行模型构建。

一、模型构建

实施例1：

步骤1：AIA模型(类风湿关节炎模型)构建：如图1所示，向健康雄性SD大鼠的尾根部0.5cm处进行皮下注射CFA，剂量为0.1mL/只。

步骤2：BLM模型(间质性肺病模型)构建：如图2所示，将注射CFA7天后得到的AIA大鼠麻醉后固定，将麻醉状态的AIA大鼠仰面放置于60°倾斜鼠板上，四肢和上切牙分别用橡皮筋和尼龙绳固定在大鼠手术台上，头部朝向实验者，在大鼠后颈部垫一小块纱布以抬高气管口位置；手指夹棉球轻轻地拉出鼠的舌头，将棉签后端深入口腔3cm抵住舌头正中间，用灯的支架往外卡住棉签，暴露声门区域，将内置钢芯的气管插管针插入气管，并深入声门20mm处，轻轻将钢芯从套管中抽出，将棉花丝放置于插管针的注射器接口，若棉花随着大鼠的呼吸上下摆动，则表明插管成功。插管成功后，将雾化注射器插入气管插管针内，1s内迅速推入硫酸博来霉素溶液，使之成雾化状态均匀分布于AIA大鼠的肺组织；

以所述AIA大鼠的体质量为基准，所注入的硫酸博来霉素剂量为4.5mg/kg，硫酸博来霉素以博来霉素溶液的形式注入，博来霉素溶液中硫酸博来霉素的浓度为4.5mg/mL，溶剂为0.9wt％的生理盐水；

注射硫酸博来霉素溶液后28天，完成BLM模型的构建，得到类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型I(AIA+BLM@I模型)。

10只雄性SD大鼠平行实验，其中，构建成功的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型为10只，也即，类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的造模成功率100％。

实施例2

步骤1同实施例1。

步骤2按照以下方式进行：

将注射CFA14天后得到的AIA大鼠麻醉后固定，将麻醉状态的AIA大鼠仰面放置于60°倾斜鼠板上，四肢和上切牙分别用橡皮筋和尼龙绳固定在大鼠手术台上，头部朝向实验者，在大鼠后颈部垫一小块纱布以抬高气管口位置；手指夹棉球轻轻地拉出鼠的舌头，将棉签后端深入口腔3cm抵住舌头正中间，用灯的支架往外卡住棉签，暴露声门区域，将内置钢芯的气管插管针插入气管，并深入声门20mm处，轻轻将钢芯从套管中抽出，将棉花丝放置于插管针的注射器接口，若棉花随着大鼠的呼吸上下摆动，则表明插管成功。插管成功后，将雾化注射器插入气管插管针内，1s内迅速推入硫酸博来霉素溶液，使之成雾化状态均匀分布于AIA大鼠的肺组织；

以所述AIA大鼠的体质量为基准，所注入的硫酸博来霉素剂量为4.5mg/kg，硫酸博来霉素以博来霉素溶液的形式注入，博来霉素溶液中硫酸博来霉素的浓度为4.5mg/mL，溶剂为0.9wt％的生理盐水；

注射硫酸博来霉素溶液后21天，完成BLM模型的构建，得到类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型II(AIA+BLM@II模型)。

10只雄性SD大鼠平行实验，其中，构建成功的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型为8只，也即，类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的造模成功率80％。

实施例3

步骤1同实施例1。

步骤2按照以下方式进行：

注射CFA的当天，将得到的AIA大鼠麻醉后固定，将麻醉状态的AIA大鼠仰面放置于60°倾斜鼠板上，四肢和上切牙分别用橡皮筋和尼龙绳固定在大鼠手术台上，头部朝向实验者，在大鼠后颈部垫一小块纱布以抬高气管口位置；手指夹棉球轻轻地拉出鼠的舌头，将棉签后端深入口腔3cm抵住舌头正中间，用灯的支架往外卡住棉签，暴露声门区域，将内置钢芯的气管插管针插入气管，并深入声门20mm处，轻轻将钢芯从套管中抽出，将棉花丝放置于插管针的注射器接口，若棉花随着大鼠的呼吸上下摆动，则表明插管成功。插管成功后，将雾化注射器插入气管插管针内，1s内迅速推入硫酸博来霉素溶液，使之成雾化状态均匀分布于AIA大鼠的肺组织；

以所述AIA大鼠的体质量为基准，所注入的硫酸博来霉素剂量为4.5mg/kg，硫酸博来霉素以博来霉素溶液的形式注入，博来霉素溶液中硫酸博来霉素的浓度为4.5mg/mL，溶剂为0.9wt％的生理盐水；

注射硫酸博来霉素溶液后35天，完成BLM模型的构建，得到类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型III(AIA+BLM@III模型)。

10只雄性SD大鼠平行实验，其中，构建成功的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型为6只，也即，类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的造模成功率60％。

对比例1

步骤1同实施例1。

步骤2按照以下方式进行：

注射CFA的当天，将得到的AIA大鼠麻醉后固定，将麻醉状态的AIA大鼠仰面放置于60°倾斜鼠板上，四肢和上切牙分别用橡皮筋和尼龙绳固定在大鼠手术台上，采用注射器向所述AIA大鼠气管内推注硫酸博来霉素溶液；

以所述AIA大鼠的体质量为基准，所注入的硫酸博来霉素剂量为4.5mg/kg，硫酸博来霉素以博来霉素溶液的形式注入，博来霉素溶液中硫酸博来霉素的浓度为4.5mg/mL，溶剂为0.9wt％的生理盐水；

注射硫酸博来霉素溶液后35天，完成BLM模型的构建，得到类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型I(AIA+BLM@DI模型)。

10只雄性SD大鼠平行实验，构建成功的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型为4只，也即，类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的造模成功率40％。

对比例2

向体质量为220g的健康雄性SD大鼠的尾根部0.5cm处进行皮下注射CFA，剂量为0.1mL/只，7天后，得到AIA大鼠模型。

10只雄性SD大鼠平行实验，仅得到AIA大鼠模型，未得到类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型。

对比例3

步骤1：向体质量为220g的健康雄性SD大鼠的尾根部0.5cm处进行皮下注射0.9wt％的生理盐水，剂量为0.1mL/只。

步骤2：将注射0.9wt％的生理盐水7天后得到的大鼠麻醉后固定，将麻醉状态的大鼠仰面放置于60°倾斜鼠板上，四肢和上切牙分别用橡皮筋和尼龙绳固定在大鼠手术台上，头部朝向实验者，在大鼠后颈部垫一小块纱布以抬高气管口位置；手指夹棉球轻轻地拉出鼠的舌头，将棉签后端深入口腔3cm抵住舌头正中间，用灯的支架往外卡住棉签，暴露声门区域，将内置钢芯的气管插管针插入气管，并深入声门20mm处，轻轻将钢芯从套管中抽出，将棉花丝放置于插管针的注射器接口，若棉花随着大鼠的呼吸上下摆动，则表明插管成功。插管成功后，将雾化注射器插入气管插管针内，1s内迅速推入0.9wt％的生理盐水，使之成雾化状态均匀分布于大鼠的肺组织；

以所述大鼠的体质量为基准，所注入的0.9wt％的生理盐水剂量为4.5mg/kg；

第二次注射生理盐水后28天，得到假手术组大鼠模型。

10只雄性SD大鼠平行实验，未得到类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型。

二、模型评价指标

1、观察大鼠关节炎发病情况，记录病程，注射CFA后，大鼠出现精神萎靡，饮食、饮水、活动量减少，耳缘及尾根部出现风湿结节，进而转为溃疡面现象。示例性地，图3为本发明实施例1、对比例2、对比例3的大鼠在第7天的双后足肿胀临床特征图，其中，实施例1和对比例2以注射CFA的当天为第0天，对比例3以第一次注射生理盐水的当天为第0天。

由图3可以明显看出，本发明实施例1的大鼠在注射CFA后第7天，类风湿关节炎明显发病。

2、测量大鼠的后足肿胀容积，测量方法如下：

在注射CFA前，在大鼠的踝关节处打点并作永久性标记，采用足肿测定仪分别测量左后足体积和右后足体积，以所述左后足体积和所述右后足体积之和为基准总体积；

实施例、对比例1和对比例2以注射CFA的当天为第0天，对比例3以第一次注射生理盐水的当天为第0天，每7天测量一次大鼠的左后足实时体积和右后足实时体积，以所述左后足实时体积和所述右后足实时体积之和为实时总体积；

后足肿胀容积＝(实时总体积-基准总体积)/2，计算得到大鼠的后足肿胀容积。

按照以上测量方法分别测量实施例和对比例的每只大鼠的后足肿胀容积，并分别计算实施例和对比例的大鼠平均后足肿胀容积，并绘制变化曲线。结果如下表1所示，与对比例3相比，本发明实施例1构建的AIA+BLM@I模型的后足肿胀容积明显增大。示例性地，实施例1、对比例2和对比例3大鼠的后足肿胀容积曲线如图4所示。

表1各组大鼠后足肿胀容积变化

第0天

第7天

第14天

第21天

第28天

第35天

实施例1

0±0

0.30±0.02

0.93±0.28

2.36±0.24

2.78±0.26

2.63±0.22***

实施例2

0±0

0.26±0.01

0.69±0.27

2.08±0.16

2.50±0.07

2.52±0.13***

实施例3

0±0

0.27±0.02

0.93±0.23

1.92±0.13

2.42±0.13

2.23±0.16***

对比例1

0±0

0.27±0.02

1.00±0.26

1.89±0.52

2.12±0.50

2.04±0.53**

对比例2

0±0

0.25±0.04

0.94±0.27

1.64±0.33

2.24±0.62

2.14±0.59**

对比例3

0±0

0.28±0.02

0.22±0.04

0.17±0.06

0.25±0.03

0.23±0.04

注：*表示各组与对比例3相比，^**P<0.01，^***P<0.001

3、关节炎评分：实施例、对比例1和对比例2以注射CFA的当天为第0天，对比例3以第一次注射生理盐水的当天为第0天，每天观察并记录大鼠发病情况，统计关节评分值，关节炎计分表如下表2所示：

表2

正常情况，无红肿	0分
		局部关节或者脚趾轻度红肿	1分
趾关节/足趾/踝关节中度红肿	2分
		踝关节以下足爪全部红肿/踝关节重度红肿	3分
全部足爪红肿变形	4分

累计前后四肢关节炎计分值之和为每只大鼠的关节炎评分，最高每只可达16分。每组10只大鼠，按照该关节炎评分方法计算实施例和对比例的大鼠的平均关节炎评分，结果如下表3所示。示例性地，实施例1、对比例2和对比例3的大鼠的平均关节炎评分曲线如图5所示，本发明实施例1构建的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的关节炎评分明显高于对比例构建的动物模型的关节炎评分。

表3各组大鼠关节炎指数评分

第0天

第7天

第14天

第21天

第28天

第35天

实施例1

0±0

0±0

4.6±2.01

11.6±1.63

11.6±1.40

10±1.52***

实施例2

0±0

0±0

4.2±1.02

9.8±1.74

10.8±1.16

9.6±1.44***

实施例3

0±0

0±0

4.8±1.02

9.2±1.29

10.2±1.07

9.0±0.63***

对比例1

0±0

0±0

4.2±1.28

7.2±1.36

6.4±1.94

5.2±1.62*

对比例2

0±0

0±0

3.8±1.20

5.8±1.69

7.6±1.83

5.8±1.74**

对比例3

0±0

0±0

0±0

0±0

0±0

0±0

注：*表示各组与对比例3相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

4、肺泡炎评分：在第35天(对比例1、对比例2和实施例以CFA注射的当天为第0天，对比例3以第一次注射生理盐水的当天为第0天)，采用苏木精-伊红(HE)分别对实施例和对比例的大鼠肺组织进行染色处理。示例性地，图6为实施例1、对比例2和对比例3的大鼠在第35天的肺组织HE染色图，由图6可以明显看出，本发明实施例1构建的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的肺泡炎明显更加严重。

Szapiel方法评估肺泡炎的程度，肺泡炎程度计分表如下表4所示。

表4肺泡炎程度评分标准

无肺泡炎	1分
		病变范围不超过全肺20％，肺泡结构未见明显改变	2分
症病变面积占全肺的20％～50％，肺泡结构发生变化	3分
		病变范围超过全肺面积的50％，肺泡腔可见炎性细胞及红细胞	4分

按照表3的方式对实施例和对比例大鼠在第35天进行肺泡炎评分，评分结果如下表5所示。

表5各组肺组织HE染色肺泡炎评分

实施例1

实施例2

实施例3

对比例1

对比例2

对比例3

第35天

3.52±0.30**

2.42±0.33

1.94±0.22

1.72±0.52

1.32±0.21

1±0.00

注：*表示各组与对比例1相比，^**P<0.01

示例性地，图7为本发明实施例1、对比例2、对比例3的大鼠在第35天的肺泡炎评分柱状示意图，其中，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，ns表示无统计学差异。

5、肺纤维化程度评分：在第35天(对比例1、对比例2和实施例以CFA注射的当天为第0天，对比例3以第一次注射生理盐水的当天为第0天)，采用Masson试剂盒分别对实施例和对比例的大鼠肺组织进行染色处理。示例性的，图8是为实施例1、对比例2和对比例3的大鼠在第35天的肺组织Masson染色图，由图8可以看出，本发明实施例1构建的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的肺纤维化程度明显更高。

采用Image-J软件对Masson染色结果进行图像处理分析，每张大鼠肺组织切片随机选取5个不重叠视野(×200)，对实施例和对比例的大鼠进行肺纤维化程度评分，肺纤维化程度＝肺纤维化面积/肺组织面积×100％，评分结果如下表6所示。

表6

实施例1

实施例2

实施例3

对比例1

对比例2

对比例3

第35天

0.68±0.02*

0.63±0.02

0.59±0.02

0.56±0.05

0.54±0.02

0.54±0.01

注：*表示各组与对比例1相比，^*P<0.05

示例性地，图9为本发明实施例1、对比例2、对比例3的大鼠在第35天的肺纤维化程度评分柱状示意图，其中，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，ns表示无统计学差异。

综上，采用本发明实施例提供的构建方法构建类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型，构建过程简单，刺激性小，无明显创伤，模型构建成功率高，类风湿关节炎和间质性肺病的疾病程度均较高。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

于大鼠尾根部皮下注射完全弗氏佐剂，N天后，采用雾化式给药装置向所述大鼠的肺部推注博来霉素溶液，M天后，完成所述类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型的构建；

其中，所述采用雾化式给药装置向所述大鼠的肺部注射博来霉素溶液包括以下步骤：

气管插管：将内置导引件的气管插管针插入所述大鼠的气管内，深入所述大鼠的声门下15-20mm处，取出所述导引件；

雾化给药：在所述气管插管成功后，将所述气管插管针暴露于所述大鼠体外的一端与所述雾化式给药装置相连接，推注所述博来霉素溶液；

所述N为0～14的整数，所述M为21～35的整数，所述N的计时起点为注射所述完全弗氏佐剂当天，所述M的计时起点为推注所述博来霉素溶液的当天。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述N为7～9的整数，所述M为27～29的整数。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述完全弗氏佐剂包含热灭活结核杆菌和矿物油，所述完全弗氏佐剂的注射剂量为0.1mL，其中，0.1mL所述完全弗氏佐剂含所述热灭活结核杆菌200μg～400μg。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述博来霉素溶液的浓度为4mg/mL～5mg/mL；

以所述大鼠的体质量为基准，所述博来霉素溶液的推注剂量为4mg/kg～5mg/kg。

5.据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述气管插管成功的标准为：在所述导引件取出后，在所述气管插管针的暴露于所述大鼠体外的一端口放置棉花丝，所述棉花丝随着所述大鼠的呼吸晃动。

6.据权利要求1-5中任意一项所述的构建方法，其特征在于，在进行所述气管插管前，将所述大鼠进行麻醉固定处理。

7.根据权利要求1-5中任意一项所述的构建方法，其特征在于，所述大鼠为雄性SD大鼠，体质量为220±20g。

8.根据权利要求1-5中任意一项所述的构建方法，其特征在于，所述皮下注射的位置是在所述大鼠的背侧，并且距离所述大鼠的尾根部0.3cm～1cm处。

9.权利要求1～8中任意一项所述的构建方法构建的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型。

10.权利要求9所述的类风湿关节炎合并间质性肺病动物模型在医药技术领域的应用。

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