KR20210121366A - 류마티스 관절염 환자 폐섬유화 동반 질환 모델 평가 플랫폼 - Google Patents
류마티스 관절염 환자 폐섬유화 동반 질환 모델 평가 플랫폼 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폐섬유화를 동반한 류마티스 관절염 동물모델 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델은 종래 류마티스 동물모델에서도 일부 폐 섬유화가 발생하지만 발생율을 임의로 조절할 수 없었던 한계를 극복하고, 명확한 폐 섬유화를 동반한 류마티스 동물모델을 구축하였다. 따라서, 폐 섬유화로 인하여 발생되는 폐 질환을 동반한 류마티스 관절염의 치료제의 스크리닝 뿐만 아니라, 류마티스 관절염 환자 개인의 약물 평가 뿐만 아니라 병리기전을 이해하고 맞춤형 질병 진단 및 조절 시스템 개발에 활용될 수 있어, 관련 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 류마티스관절염 환자 폐섬유화 동반 질환 모델 평가 플랫폼에 관한 것이다.
관절염은 두 개 이상의 뼈가 접합되어 있는 부위에 염증이 발생하여 생기는 질환이다. 관절염은 여러 가지 원인에 의해 발병된다고 알려져 있으며, 일반적으로 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)과 골관절염(osteoarthritis, OA)로 크게 분류된다. 특히 류마티스 관절염은 만성 염증 질환의 하나로 관절내의 조직의 손실과 구조를 지탱하는 뼈의 파괴로 인한 기능 상실을 나타내며, 골관절염과 달리 관절 주위 뼈의 골다공증 및 골미란 등이 발생한다. 류마티스 관절염은 활막(synovial membrane)의 염증이 관절막(joint capsule)과 인대(ligament), 건(tendon)으로 퍼지는 단계(1 단계), 관절연골(joint cartilage)의 점차적인 파괴로 관절 간격이 좁아지고 관절막과 인대의 장력이 소실되는 단계(2 단계), 염증이 뼈로 침범하여 뼈의 부분적 침식이 발생하는 단계(3 단계), 및 관절기능이 소실되는 단계(4 단계)로 진행되게 된다.
류마티스 관절염의 증상은 크게 관절 증상과 관절 외 증상으로 나눌 수 있다. 상기 관절 증상은 손, 손목과 발의 작은 관절에 좌우 대칭적으로 염증이 발생하는 것이 특징이며, 이외에도 팔꿈치, 어깨, 턱, 엉덩이, 무릎, 발목 관절에도 관절염이 생길 수 있다. 관절에 염증이 생기면 관절이 빨갛게 부어 오르고, 심한 경우에는 가만히 있어도 심한 통증을 느끼게 되며, 관절을 움직이기 어렵게 되는 경직이 나타나게 된다. 또한, 류마티스 관절염은 관절을 침범하는 전신 질환인 바, 관절 외 증상이 나타나며, 심장과 폐를 침범하여 폐 섬유화, 심낭염, 심근염, 관상동맥질환, 흉막염, 간질성 폐렴 등의 다양한 합병증을 유발하기도 하며, 이외에도 빈혈, 혈관염, 신경염 및 피부질환을 일으킬 수 있다. 또한, 류마티스 관절염을 포함한 전신홍반루푸스, 쇼그렌증후군, 전신경화증, 염증성 근육염, 혈관염 등은 모두 폐섬유화와 밀접한 관련 있다.
류마티스 관절염 환자 치료를 위하여 치료 약물이나 면역억제제에 불응하거나 잘 치료되지 않으면, 말기에는 폐 섬유화가 생기면서 사망사례가 발생되어 문제되고 있다.
구체적으로, 류마티스 관절염에서 흔히 동반되는 상술한 관절외 증상으로 류마티스 관절염 환자의 사망률을 높이는 중요 원인이다. 류마티스 관절염에서 간질성 폐질환은 단순 흉부 방사선 소견상 1.6-5%의 비교적 낮은 빈도로 발견되지만 고해상도 흉부 단층 촬영에서는 19-56%에서 발견될 정도로 흔한 것으로 알려져 있다. 류마티스 환자에서 동반되는 간질성 폐질환은 조직학적 분류로 크게 나누어서 통상성 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴, 염증성 기도 질환, 기질화 폐렴으로 분류할 수 있으며 통상성 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴 두 군이 대부분을 차지한다. 그러나, 이에 대한 연구를 위한 동물 모델은 전무한 실정이다.
한편, 기존에는 관절염의 치료제 개발을 위한 동물모델로서 콜라겐 유도성 관절염 모델(Collagen-in-duced arthritis, CIA), 유전자 변형 자연발생 관절염 모델, 항체 유도성 관절염 모델 및 인간화 모델인 severe combined immunodeficiency(SCID)-HuRAg 마우스 등을 일반적으로 사용하여 왔다. 이 중, CIA 동물 모델은, 류마티스 관절염 환자의 혈청에서 콜라겐에 대한 항체가 발견되고, 관절에 존재하는 제2형 콜라겐이 자가항원으로 작용할 수 있다는 점에서 착안되어 고안된 모델로서, 이 동물 모델은 현재 가장 많이 사용되는 대표적인 류마티스 관절염 동물 모델이며, 임상적으로나 조직학적으로 사람의 류마티스 관절염과 유사한 것으로 알려져 있다(Stuart et al, Nature and specificity of the immune response to collagen in type II collagen-induced arthritis in mice J Clin Invest. 1982 March; 69(3): 673-683). 그러나 제2형 콜라겐을 이용하여 류마티스 관절염을 유도하는 방법은 사이토카인 유전자 변형 마우스, 예를 들어 많이 사용되는 C57BL6 종에 대해서는 관절염 유도 시 관절염 평가 지수는 3점을 넘지 못하고 발병율도 평균적으로 50% 정도로 미미하다.
또한, 류마티스 환자의 일부는 폐 섬유화를 동반하는 바, 류마티스 동물모델에서도 일부 폐 섬유화가 발생하지만 발생율을 임의로 조절할 수 없었다. 따라서, 폐 섬유화 발생이 동반한 류마티스 동물모델이 구축되지 않아, 폐 섬유화와 밀접한 관련이 있는 또한, 류마티스 관절염을 포함한 전신홍반루푸스, 쇼그렌증후군, 전신경화증, 염증성 근육염, 혈관염 등에 대한 연구를 위한 동물 모델 구축이 절실한 실정이다.
본 발명의 목적은 류마티스 관절염 발생 동물에 베타 글루칸 또는 살균제가 투여되어 폐 섬유화가 발생된, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 류마티스 관절염 발생 마우스에 베타 글루칸 또는 살균제를 투여하여 폐 섬유화를 유도하는 단계;를 포함하는, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델의 제조 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 상기 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물에 후보 물질을 처리하는 단계;를 포함하는, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 류마티스 관절염 발생 동물에 베타 글루칸 또는 살균제가 투여되어 폐 섬유화가 발생된, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델을 제공한다.
또한 본 발명은 류마티스 관절염 발생 마우스에 베타 글루칸 또는 살균제를 투여하여 폐 섬유화를 유도하는 단계;를 포함하는, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물에 후보 물질을 처리하는 단계;를 포함하는, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델은 종래 류마티스 동물모델에서도 일부 폐 섬유화가 발생하지만 발생율을 임의로 조절할 수 없었던 한계를 극복하고, 명확한 폐 섬유화를 동반한 류마티스 동물모델을 구축하였다. 따라서, 폐 섬유화로 인하여 발생되는 폐 질환을 동반한 류마티스 관절염의 치료제의 스크리닝 뿐만 아니라, 류마티스 관절염 환자 개인의 약물 평가 뿐만 아니라 병리기전을 이해하고 맞춤형 질병 진단 및 조절 시스템 개발에 활용될 수 있어, 관련 분야에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델 및 대조군에 대한 관절염 지수(arthritis score)를 비교한 도이다.
도 2는 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델 및 대조군에 대한 체중 변화를 비교한 도이다.
도 3은 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델 및 대조군에 대한 각 장기와 조직의 생화학적 변화를 Pet-CT 촬영하여 확인한 도이다.
도 4는 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델 및 대조군의 GDF(Growth 심장, 폐, 간, 근육, 관절 및 척추의 SUV(Standardized Uptake Value, 표준섭취계수) 값에 따른 GDF(Growth differentiation factor) 흡수(uptake) 정도에 따른 염증 증가 정도를 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델 및 대조군의 폐 섬유화에 의한 폐의 손상을 확인한 도이다.
도 6은 PHMG 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스와 대조군에서, 관절염 지수를 확인하고(A), 폐포의 세 기관지화(alveolar bronchiolization)(B), 폐 조직 및 무게 변화(C)를 확인한 도이다.
도 7은 PHMG 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스와 대조군에서, 면역대식세포인 대식세포, 호중구 및 림프구의 증가 정도를 확인한 도이다.
도 8은 PHMG 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스와 대조군에서, Th1, Th2, Treg, Th17 세포의 수치에 따른 면역 세포 조절을 확인한 도이다.
도 2는 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델 및 대조군에 대한 체중 변화를 비교한 도이다.
도 3은 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델 및 대조군에 대한 각 장기와 조직의 생화학적 변화를 Pet-CT 촬영하여 확인한 도이다.
도 4는 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델 및 대조군의 GDF(Growth 심장, 폐, 간, 근육, 관절 및 척추의 SUV(Standardized Uptake Value, 표준섭취계수) 값에 따른 GDF(Growth differentiation factor) 흡수(uptake) 정도에 따른 염증 증가 정도를 평가한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델 및 대조군의 폐 섬유화에 의한 폐의 손상을 확인한 도이다.
도 6은 PHMG 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스와 대조군에서, 관절염 지수를 확인하고(A), 폐포의 세 기관지화(alveolar bronchiolization)(B), 폐 조직 및 무게 변화(C)를 확인한 도이다.
도 7은 PHMG 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스와 대조군에서, 면역대식세포인 대식세포, 호중구 및 림프구의 증가 정도를 확인한 도이다.
도 8은 PHMG 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스와 대조군에서, Th1, Th2, Treg, Th17 세포의 수치에 따른 면역 세포 조절을 확인한 도이다.
본 발명은 류마티스 관절염 발생 동물에 베타 글루칸 또는 살균제가 투여되어 폐 섬유화가 발생된, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델을 제공한다.
본 발명에서 용어 "류마티스 관절염 발생 동물"은 T세포 면역 체계의 유전적 결함이 있어 T세포 유발 만성 자가면역질환이 유발되어 류마티스 관절염의 동물 모델로 이용되는 SKG 마우스를 이용할 수 있다. 또한, 콜라겐 유도성 관절염 모델(Collagen-in-duced arthritis, CIA), 유전자 변형 자연발생 관절염 모델, 항체 유도성 관절염 모델 및 인간화 모델인 severe combined immunodeficiency(SCID)-HuRAg 마우스 등을 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 동물 모델의 제조를 위해 사용될 수 있는 실험용 쥐의 종류로는, 이에 제한되는 것은 아니나, 계통별 분류상 폐쇄군(Closed Colony)에 속하는 ICR 또는 DDY; 근교계(Inbred)에 속하는 BALB/cA, C57BL/6N, C3H/HeN, DBA/2N 또는 CBA/N; 교잡군(hybrid)에 속하는 BDF1(C57BL/6 x DBA/2), CDF1(CBA/N x DBA/2) 또는 B6C3F1(C57BL6 x C3H/HeN); 돌연변이계(mutant)에 속하는 BALB/c-nu 또는 C,B-17SCID 등 실험용 쥐로 사용되는 것이면 모두 이용할 수 있다.
본 발명의 목적 상, 상기 류마티스 관절염 동물 모델은 폐 섬유화가 일부 발생할 뿐, 발생율을 임의 조절할 수 없는 한계점이 존재하는 바, 이를 개선하기 위하여, 본 발명의 명확한 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델을 구축하게 되었다.
상기 베타 클루칸은 커들란(Curdlan)이고, 베타 클루칸은 1~500mg/kg의 농도로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 살균제는 폴리헥사메틸렌 구아디닌(Polyhexamethylene guanidine, PHMG), 염산폴리헥사메틸렌비구아니드(PHMB), 메칠이소치아졸리논(MIT), 염화에톡시에틸구아디닌(Chloride Ethoxyethyl Guanidine, PGH), 나프탈렌(naphthalene), 프탈레이트(phthalate), 디데실메틸염화암모늄(Didecyl methyl ammonium chloride, DDAC), 벤즈아이소사이아졸리논(BIT), 클로록실레놀(chloroxylenol), 티타늄 다이옥사이드, 징크 옥사이트 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고, 바람직하게는 구아디닌 계열의 성분인 폴리헥사메틸렌 구아디닌(Polyhexamethylene guanidine, PHMG), 염산폴리헥사메틸렌비구아니드(PHMB), 염화에톡시에틸구아디닌(Chloride Ethoxyethyl Guanidine, PGH)이며, 더욱 바람직하게는 폴리헥사메틸렌 구아디닌(Polyhexamethylene guanidine, PHMG)이나, 이에 제한되지 않는다. 상기 살균제는 1~500mg/kg의 농도로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "폴리헥사메틸렌 구아디닌(Polyhexamethylene guanidine, PHMG)"는 가습기 살균제의 주요 성분으로서 사용되어 왔고, 고농도로 폐에 노출되면 감기나 폐렴 증상이 발생하고 간질성 폐렴으로 진전돼 폐가 딱딱해져 호흡곤란이 발생하기도 한다. 폐 손상은 회복되지 못하고 고착성 폐 기능 저하로 폐를 이식하지 않으면 사망에 이르게 된다.
상기 투여는 경구, 정맥, 근육, 피하 및 복강내 주사로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 상기 커들란의 투여 시, 경구 투여 및 복강 내 주사로 투여할 수 있으며, 상기 각 투여 방법에 의한 커들란은 1:2의 중량 비율로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 투여는 1-5주 동안 1-5회 투여될 수 있고, 바람직하게는 1-3주 동안 1-3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 동물은 마우스, 래트 및 햄스터, 토끼, 말, 소, 개, 고양이, 원숭이 및 기니 피그로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 바람직하게는 마우스이나 이에 제한되지 않는다.
상기 폐 섬유화는 류마티스 관절염에서 동반되는 폐 섬유증, 통상성 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴, 염증성 기도 질환 및 기질화 폐렴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폐 질환을 일으킬 수 있다.
상기 구축된 폐 섬유화를 동반한 류마티스 관절염 동물 모델은 관절염 지수가 대조군 보다 높고, 마우스의 체중이 감소되는 변화를 확인하였다. 또한, 마우스의 심장, 폐, 간, 근육, 관절 및 척추에서 염증이 증가되고, 폐 섬유화에 의한 폐의 손상이 나타남을 확인하였다. 또한, 폐포의 세 기관지화(alveolar bronchiolization)가 대조군과 비교하여 유의적으로 발생하고, 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 림프구(lymphocyte)가 증가되어 면역 반응이 증대되고, 염증성 세포인 Th17 세포가 증가되고, 면역 반응을 제어하는 Treg 세포는 감소되는 특징이 나타남을 확인하였다.
또한 본 발명은 류마티스 관절염 발생 마우스에 베타 글루칸 또는 살균제를 투여하여 폐 섬유화를 유도하는 단계;를 포함하는, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물에 후보 물질을 처리하는 단계;를 포함하는, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 커들란(Curdlan) 주입을 통한 폐 섬유화를 동반한 류마티스 관절염 모델 제작
1-1. 커들란(Curdlan) 주입을 통한 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물모델 제작(IL-1Ra KO 모델)
폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델을 제작하기 위하여, SKG 마우스를 이용하였다. 구체적으로, 상기 SKG 마우스는 T세포 면역 체계의 유전적 결함이 있어 T세포 유발 만성 자가면역질환이 유발하는 것으로 알려져 있다. SKG 수컷 마우스(8주령 이내)에 다음과 같은 대조군 및 실험군을 구성하였다. 대조군은 PBS를 처리하였고, 실험군은 커들란을 6mg/kg로 복강내 주입(Intraperitoneal Injection) 및 3mg/kg 구강 주입을 실험 시작 1주일 전에 한번 주입하는 것으로, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델을 구축하였다.
<실시예 2> 커들란(Curdlan) 주입을 통한 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델의 효과
2-1. 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스의 관절염 지수 확인
상기 실시예 1에서 구축한 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델 및 대조군에 대한 관절염 지수(arthritis score)를 확인하였다. 관절염 평가에 따른 점수와 기준은 다음과 같다.
-평가 기준-
0점: 부종이나 종창이 없다.
1점: 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적
2점: 발목관절에서 족근골(metatarsal)에 걸친 경한 부종과 발적
3점: 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적
4점: 발목에서 다리 전체에 걸쳐 부종과 발적이 있는 경우
마리당 최고의 관절염 지수는 4점이므로 마우스 1 마리당 최고의 질병 지수는 16 이다.
그 결과, 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델에서는 3.75의 값이 나타났고, 대조군에서는 2.0의 값이 나타남에 따라, 본 발명에서 구축된 동물 모델에서 관절염 지수가 높음을 확인하여, 류머티스 관절염이 제대로 발현된 동물 모델을 구축함을 확인하였다(도 1).
2-2. 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스의 체중 변화 확인
상기 실시예 1에서 구축한 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델(24주령, 커들란 주입 후 17주)과 대조군 SKG 마우스(24주령)에 대한 마우스 체중 변화를 비교하였다.
그 결과, 대조군 SKG 마우스는 27.7g이고, 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델은 15.8g인 것으로 확인되는 바, 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델의 체중이 감소함을 확인하였다(도 2).
2-3. 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스의 염증반응 확인
상기 실시예 1에서 구축한 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델(24주령, 커들란 주입 후 17주)과 대조군 SKG 마우스(24주령)에 대한 마우스의 장기들에서 염증반응을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험군 및 대조군 마우스를 Pet-CT 촬영하여, 생체 내부의 각 장기와 조직의 생화학적 및 기능적 변화를 영상으로 관찰하였으며, 장기별 특정 관심 영역에 따른 ROI(region of interest) 값을 구하였다. 각 마우스의 심장, 폐, 간, 근육, 관절(articulation) 및 척추(vertebra)의 염증에 대하여 SUV(Standardized Uptake Value, 표준섭취계수) 값을 얻었으며, GDF(Growth differentiation factor) 흡수(uptake) 정도에 따른 염증 증가 정도를 평가하였다.
그 결과, 대조군 SKG 마우스과 비교하여 심장, 폐, 간, 근육, 관절 및 척추에서 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델의 염증이 증가됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 동물 모델이 염증 반응이 나타나 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염이 제대로 나타남을 확인하였다(도 3 및 도 4).
2-4. 커들란 주입된 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스의 폐 섬유화에 의한 손상 확인
상기 실시예 1에서 구축한 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델(24주령, 커들란 주입 후 17주)과 대조군 SKG 마우스(24주령)에 대한 마우스의 폐 섬유화에 의한 손상을 확인하였다.
그 결과, 대조군 SKG 마우스과 비교하여 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 SKG 동물 모델에서, 폐 섬유화에 의한 폐의 손상이 확인됨에 따라, 본 발명의 동물 모델은 폐 섬유화를 명확하게 발현시킴으로서, 폐 섬유화를 동반한 류마티스 관절염 동물 모델을 구축함을 시사한다(도 5).
<실시예 3> 폴리헥사메틸렌 구아디닌(Polyhexamethylene guanidine, PHMG) 주입을 통한 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델 제작
콜라겐에 의한 류마티스 관절염 동물 모델(CIA)에 폴리헥사메틸렌 구아디닌(PHMG)를 주입하였다. 구체적으로, 감응성을 높이기 위하여 0주차에 면역 처리(Immunization)한 후, 6주차에 1%의 100ul 폴리헥사메틸렌 구아디닌(PHMG)를 기관 내 점적 주입(intratracheal instillation)하였으며, 6주차에 한번만 투여하였고, 이후 마우스를 희생시키고 분석을 수행하였다.
<실시예 4> 폴리헥사메틸렌 구아디닌(PHMG) 주입을 통한 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델의 효과
4-1. PHMG 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스의 관절염 지수 확인
상기 실시예 3에서 구축한 PHMG 주입 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델과 대조군 마우스에 대한 관절염 지수를 확인하였다. 구체적으로, 관절염 지수는 상기 2-1에 기재된 방법으로 측정하였으며, 류머티스 관절염이 발생한 0주-7주차까지의 관절염 지수를 확인하였다.
그 결과, 본 발명에서 구축한 PHMG 주입 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델은, 관절염의 붓기는 감소되지만, 류마티스 관절염 동물 모델과 비교하여 관절염 지수가 유지되면서 염증반응이 유발됨에 따라 폐 섬유화가 유발됨을 확인하였다(도 6A).
4-2. PHMG 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스의 폐 조직 및 무게 변화 확인
상기 실시예 3에서 구축한 PHMG 주입 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델과 대조군 마우스에 대한 폐 조직에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 폐포의 세 기관지화(alveolar bronchiolization)를 통하여, 정상 또는 두꺼워진 폐포 벽을 덮는 기관지 상피와 유사한 세포를 특징으로 하는 이형성 병변으로서, 염증, 화학성 자극 등에 노출된 조건엣의 병리학적 조건에서 발생하는 것이 특징이다.
본 발명에서 구축한 PHMG 주입 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델의 폐포의 세 기관지화가 매우 유의적으로 대조군과 비교하여 발생함을 확인하였다(도 6B). 또한, 폐의 무게 및 몸무게 대비 폐의 질량을 측정한 결과, 대조군과 비교하여 폐의 무게가 증가하고, 몸무게 대비 폐의 질량 역시 증가됨을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 구축한 PHMG 주입 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델은 폐 섬유화가 진행되어 폐 조직에 영향을 미쳤음을 확인하였다(도 6C).
4-3. PHMG 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스의 폐 조직에서 면역 세포 확인
상기 실시예 3에서 구축한 PHMG 주입 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델과 대조군 마우스의 폐 조직에 대하여, 면역세포인 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 림프구(lymphocyte)의 증가 정도를 확인하였다.
그 결과, 본 발명에서 구축한 PHMG 주입 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델의 폐 조직에서는 대식세포, 호중구 및 림프구가 모두 유의적으로 증가함을 확인하였다(도 7A). 또한, 폐 조직에서의 면역세포의 침강율(infiltration score)을 확인한 결과, 본 발명에서 구축한 동물 모델에서 유의적으로 증가함에 따라, 면역 반응이 유도됨을 확인하였다(도 7B).
4-4. PHMG 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 마우스의 면역 세포 조절 확인
분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분되며, Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여한다. Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있고, Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시킨다.
상기 실시예 1-2에서 구축한 PHMG 주입 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델과 대조군 마우스에 대하여, Th17 세포는 IL-17+in CD4+를, Treg 세포는 CD25+Foxp+inCD4+를, Th1 세포는 IFN- γ +in CD4+를, Th2 세포는 IL-4+in CD4+ 세포를 확인하였다.
그 결과, PHMG 주입 폐 섬유화 동반 류마티스 관절염 동물 모델염증형 세포인 Th17가 증가되고, 면역 반응을 제어하는 Treg 세포의 수치는 감소됨을 확인함을 확인하였다(도 8).
상기 구축된 폐 섬유화를 동반한 류마티스 관절염 동물 모델은 관절염 지수가 대조군 보다 높고, 마우스의 체중이 감소되는 변화를 확인하였다. 또한, 마우스의 심장, 폐, 간, 근육, 관절 및 척추에서 염증이 증가되고, 폐 섬유화에 의한 폐의 손상이 나타남을 확인하였다. 또한, 폐포의 세 기관지화(alveolar bronchiolization)가 대조군과 비교하여 유의적으로 발생하고, 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 림프구(lymphocyte)가 증가되어 면역 반응이 증대되고, 염증성 세포인 Th17 세포가 증가되고, 면역 반응을 제어하는 Treg 세포는 감소되는 특징이 나타남을 확인하였다.
Claims (14)
- 류마티스 관절염 발생 동물에 베타 글루칸 또는 살균제가 투여되어 폐 섬유화가 발생된, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 베타 클루칸은 커들란(Curdlan)인 것인, 동물 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 베타 클루칸은 1~500mg/kg의 농도로 투여되는 것인, 동물 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 살균제는 폴리헥사메틸렌 구아디닌(Polyhexamethylene guanidine, PHMG), 염산폴리헥사메틸렌비구아니드(PHMB), 메칠이소치아졸리논(MIT), 염화에톡시에틸구아디닌(Chloride Ethoxyethyl Guanidine, PGH), 나프탈렌(naphthalene), 프탈레이트(phthalate), 디데실메틸염화암모늄(Didecyl methyl ammonium chloride, DDAC), 벤즈아이소사이아졸리논(BIT), 클로록실레놀(chloroxylenol), 티타늄 다이옥사이드, 징크 옥사이트 및 아세톤으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 동물 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 살균제는 1~500mg/kg의 농도로 투여되는 것인, 동물 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 투여는 경구, 정맥, 근육, 피하 및 복강내 주사로 이루어진 군에서 선택된 것인, 동물 모델.
- 제6항에 있어서, 상기 경구 투여 및 복강 내 주사는 베타 글루칸 투여 시1:2의 중량 비율로 투여되는 것인, 동물 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 투여는 1-5주 동안 1-5회 투여되는 것인, 동물 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 동물 모델은 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 림프구(lymphocyte)가 증가되어 면역 반응이 증대된 것인, 동물 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 동물 모델은 염증성 세포인 Th17 세포가 증가되고, 면역 반응을 제어하는 Treg 세포는 감소된 것인, 동물 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 동물은 마우스, 래트 및 햄스터, 토끼, 말, 소, 개, 고양이, 원숭이 및 기니피그로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 동물 모델.
- 제1항에 있어서, 상기 폐 섬유화는 류마티스 관절염에서 동반되는 폐 섬유증, 통상성 간질성 폐렴, 비특이성 간질성 폐렴, 염증성 기도 질환 및 기질화 폐렴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폐 질환인 것인, 동물 모델.
- 류마티스 관절염 발생 마우스에 베타 글루칸 또는 살균제를 투여하여 폐 섬유화를 유도하는 단계;를 포함하는, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물 모델의 제조 방법.
- 제1항의 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 동물에 후보 물질을 처리하는 단계;를 포함하는, 폐 섬유화가 동반된 류마티스 관절염 치료 물질을 스크리닝하는 방법.
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