CN116064923A - 检测hiv-1的组合物、试剂盒、方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域;具体地,涉及HIV‑1的检测。与此同时,还提供了包括本发明组合物的试剂盒,所述组合物的用途,以及用于检测HIV‑1的方法。使用本发明的组合物,能够以22IU/ml的灵敏度检测HIV‑1。与此同时,本发明组合物组合两个不同区域的两套引物探针和一条额外的上游引物配制反应体系对HIV‑1RNA进行联合检测以鉴别阳性反应的存在,有效降低了漏检的几率,特别是O组型别病毒的漏检几率。无需全封闭式诊断系统,有效的降低了成本。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域;具体地,涉及HIV-1的检测。
背景技术
艾滋病,即获得性免疫缺陷综合征(AIDS),其病原体为人类免疫缺陷病毒(HIV),亦称艾滋病病毒。艾滋病是影响公众健康的重要公共卫生问题之一。HIV是一种变异性很强的病毒,各基因的变异程度不同,env基因变异率最高。HIV发生变异的主要原因包括反转录酶无校正功能导致的随机变异;病毒在体内高频率复制;宿主的免疫选择压力;病毒DNA与宿主DNA之间的基因重组;以及药物选择压力,其中,不规范的ART以及患者依从性差是导致耐药变异的重要原因。
HIV/AIDS患者的实验室检测主要包括HIV抗体检测、HIV核酸定性和定量检测、CD4+T淋巴细胞计数、HIV耐药检测等。HIV-1/2抗体检测是HIV感染诊断的金标准,HIV核酸检测(定性和定量)也用于HIV感染诊断。HIV抗体检测包括筛查试验和补充试验,HIV补充试验包括抗体补充试验(抗体确证试验)和核酸补充试验(核酸定性和定量检测)。HIV核酸定量和CD4+T淋巴细胞计数是判断疾病进展、临床用药、疗效和预后的两项重要指标;HIV耐药检测可为ART方案的选择和更换提供指导。
普通的荧光定量PCR检测技术,仅采用一套引物探针较难扩增出所有的基因亚型,它仅能检测几种主要的型别,比如A、B、C、BC、AE等。其后果是产生漏检或各亚型间的定量不准确,特别是O组型别病毒更容易出现漏检。目前已有的HIV-1RNA荧光定量PCR试剂,其灵敏度均大于或等于50IU/ml。对于低浓度的病毒载量无法准确检测和定量。国外性能优异的同类试剂是Roche(罗氏)公司的"Roche Cobas6800/8800 TaqMan HIV-l Test"全封闭式诊断系统,应用磁珠法原理采用全自动化的仪器进行RNA提取,然后自动加样进行RNA的荧光PCR扩增,实现临床样本中HIV-RNA的定量检测。该诊断系统具有自动化程度高、操作简便、检测灵敏度高(大于22IU/ml)等优点,但由于封闭系统和昂贵的试剂耗材成本,对我国医疗卫生体系的建设带来很大财政压力。
本领域需要一种灵敏度高,防漏检,成本低的HIV-1的检测试剂,能够更准确地检测HIV-1。
发明内容
有鉴于此,第一方面,本发明提供了一种能够检测HIV-1的组合物,所述组合物同时包括:
上游引物HIV-ZF1:5’-CCTGGGAGCTCTCTGGCTA-3’(SEQ ID NO:1);
下游引物HIV-ZR1:5’-AAGCACTCAAGGCAAGCTTTAT-3’(SEQ ID NO:2);
检测探针HIV-ZP1:5’-AGGCTTAAGCAGTGGGTTCC-3’(SEQ ID NO:3);
上游引物Z-POL-F1:5’-AAATCACTCTTTGGCARCGAC-3’(SEQ ID NO:4);
下游引物Z-POL-R1:5’-CCCCCTATCATTTTTGGTTTC-3’(SEQ ID NO:5);
上游引物Z-POL-FO:5’-ATCCCTCTTTGGGACAGACC-3’(SEQ ID NO:6);以及,
检测探针Z-POL-P1:5’-ACTGTATCATCTGCYCCTGT-3’(SEQ ID NO:7)。
使用本发明的组合物,能够以22IU/ml的灵敏度检测HIV-1。与此同时,本发明组合物组合两个不同区域的两套引物探针和一条额外的上游引物配制反应体系对HIV-1RNA进行联合检测以鉴别阳性反应的存在,有效降低了漏检的几率,特别是O组型别病毒的漏检几率。无需全封闭式诊断系统,有效的降低了成本。
进一步地,上述检测探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
进一步地,上述检测探针的荧光基团可以相同。
在本文中,“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的,并且不会影响彼此的检测,即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5,这些基团吸光值不接近,能选择不同的通道,因而不会互相干扰。
进一步地,所述组合物包括:用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
进一步地,所述内标包括外源性非人基因组内标。
在一个具体的实施方案中,所述内标序列(来自多空病毒科的乳头瘤病毒部分序列)为:
5’-TTGTAAGTGTGAAGCCAGAATTGAGCTAGTAGTAGAAAGCTCAGCAGACGACCTTCGAGCATTCCAGCAGCTGTTTCTGAACACCCTGTCCTTTGTGTGTCCGTGGTGAAGAGTTTATTAATGAAGATATTGTAAATTTGCCCGAGAATGTCGATTGGAGAAAAAAAGGAGCTGTCACTCCCGTAAAACATCAGGGTTCATGCGGTAGTTGTTGGGCATTCTCGGCCGTTGCAACTGTAGAGGGAATAAATAAGATTAGAACTGGAAAATTAGTAGAATTATCAGAGCAAGAACTTGTTGACTGTGAAAGACGTAGCCATGGGGCAAAGACCGTTGTGTCCAGAAGAAAAACAAAGACATTTGGATAAAAAGAAACGATTCCACAACATAGGAGGAAGGTGGACAGGACGTTGCATAGCATGTTGGAGAAGACCTCGTACTGAAACCCAAGTGTAAACATGCGATATTTTATACT-3(SEQ ID NO:11)。
在一个具体的实施方案中,所述组合物还包括:如HPGT31-F:5’-CAAAGACCGTTGTGTCCAGAAG-3’(SEQ ID NO:8)所示的外源性非人基因组内标上游引物、如HPGT31-R:5’-CGCATGTTTACACTTGGGTTTC-3’(SEQ ID NO:9)所示的外源性非人基因组内标下游引物,和如HPGT31-P:5’-CAACGTCCTGTCCACCTTCCTCCTATG-3’(SEQ ID NO:10)所示的外源性非人基因组内标探针。
进一步地,内标探针与检测探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本发明中,荧光报告基团可以选自FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、5-TAMRA、TET、CY3和JOE,但不限于此。
在一个具体的实施方案中,检测探针的荧光基团是FAM。
在一个具体的实施方案中,检测探针的荧光基团分别是FAM和CY5。
在一个具体的实施方案中,内标探针的荧光基团是HEX。
进一步地,探针的3’末端还具有猝灭基团,例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中,探针的3’末端为BHQ1。
进一步地,所述组合物中引物的用量为0.1~0.3μM;所述组合物中探针的用量为0.05~0.20μM。
在一个具体的实施方案中,本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中,本发明的组合物各成分以混合的形式存在。
第二方面,本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测HIV-1的试剂盒中的用途。
第三方面,本发明提供了一种检测HIV-1的试剂盒,所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地,所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中,阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、TE缓冲液、灭活的人类免疫缺陷病毒阴性血浆中的至少一种。阳性对照是含有内标基因序列的假病毒,采用稀释液0.01%TE-SDS进行梯度稀释。
进一步地,所述试剂盒还包括:核酸释放体系和核酸扩增体系。
进一步地,所述核酸释放体系包括含磁珠的RNA提取溶液。
进一步地,RNA提取溶液中的洗涤液2含有硅油成分。
在一个具体的实施方案中,硅油起到保护PCR反应液的作用。可以在高温加热扩增过程中有效降低试剂蒸发和气溶胶的污染问题。
进一步地,所述试剂盒还包括:4份不同数量水平的标准品(即定量参考品)。标准品是包含已知基因片段RNA的假病毒。
将未知样品和标准品在同一荧光PCR实验中进行反应,将标准品得到的Ct值构建标准曲线,通过标准曲线可以推算出未知样品的量。阴性、阳性对照品用于质控试剂盒的操作及定量计算。
进一步地,所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液、Mn2+以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地,所述试剂盒还包括:核酸释放剂、核酸提取试剂、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地,所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、逆转录酶、尿嘧啶糖基化酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地,所述Mn2+为10~1000mM的醋酸锰。
进一步地,所述逆转录酶的浓度为5U/反应~15U/反应,例如逆转录酶可以是鼠白血病逆转录酶(MMLV)或者Tth酶;所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应~15U/反应,例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中,本发明试剂盒包括:反/逆转录酶、Taq酶、尿嘧啶糖基化酶、Mg2+、Mn2+、Rnasin、dNTP、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20~100μl。
在一个具体的实施方案中,本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系,即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面,提供了一种用于检测HIV-1的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提取或释放待测样本的核酸;
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析;
3)获得并分析结果。
在本发明中,用于检测的样本可以是精液、阴道分泌物、组织液、血液等,但不限于此。
进一步地,所述荧光定量PCR的反应条件为:
逆转录,温度为50℃~60℃,时间5~30分钟,1次循环;cDNA预变性,温度为95℃,时间1~10分钟,1次循环;变性,温度为95℃,时间为5~20秒,退火,温度为55~60℃,时间为20~60秒,40~50次循环,采集荧光。
在一个具体的实施方案中,所述荧光定量PCR的反应条件为:逆转录,温度为60℃,时间30分钟,1次循环;cDNA预变性,温度为95℃,时间1分钟,1次循环;变性,温度为95℃,时间为15秒,退火,温度为58℃,时间为10秒,45次循环,采集荧光。
在一个具体的实施方案中,提供了一种用于以非诊断目的检测HIV-1的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提取或释放待测样本的核酸;
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析;
3)获得并分析结果。
进一步地,所述荧光定量PCR的反应条件为:
逆转录,温度为50℃~60℃,时间5~30分钟,1次循环;cDNA预变性,温度为95℃,时间1~10分钟,1次循环;变性,温度为95℃,时间为5~20秒,退火,温度为55~60℃,时间为20~60秒,40~50次循环,采集荧光。
在一个具体的实施方案中,所述荧光定量PCR的反应条件为:逆转录,温度为60℃,时间30分钟,1次循环;cDNA预变性,温度为95℃,时间1分钟,1次循环;变性,温度为95℃,时间为15秒,退火,温度为58℃,时间为10秒,45次循环,采集荧光。
在本文中,术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体是否感染HIV-1的信息。例如,该方法可以在以科研为目的的实验中的检测培养物中检测是否有HIV-1。
附图说明
图1~2为本发明组合物的灵敏度检测;
图3为HIV-ZF/R/P单对引物探针检测临床样本;
图4为Z-POL-F/R/P单对引物探针检测临床样本;
图5为HIV-ZF/R/P和Z-POL-F/R/P两对引物探针检测临床样本;
图6为单个临床样本不同引物探针组合的检测;
图7为带O组引物双重引物探针检测参考样本;
图8为不带O组双重引物探针检测参考样本。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例,具体阐述本发明,本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明,而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
上游引物HIV-ZF1:5’-CCTGGGAGCTCTCTGGCTA-3’(SEQ ID NO:1);
下游引物HIV-ZR1:5’-AAGCACTCAAGGCAAGCTTTAT-3’(SEQ ID NO:2);
检测探针HIV-ZP1:5’-AGGCTTAAGCAGTGGGTTCC-3’(SEQ ID NO:3);
上游引物Z-POL-F1:5’-AAATCACTCTTTGGCARCGAC-3’(SEQ ID NO:4);
下游引物Z-POL-R1:5’-CCCCCTATCATTTTTGGTTTC-3’(SEQ ID NO:5);
上游引物Z-POL-FO:5’-ATCCCTCTTTGGGACAGACC-3’(SEQ ID NO:6);
检测探针Z-POL-P1:5’-ACTGTATCATCTGCYCCTGT-3’(SEQ ID NO:7);以及
内标上游引物:HPGT31-F:5’-CAAAGACCGTTGTGTCCAGAAG-3’(SEQ ID NO:8)
内标下游引物:HPGT31-R:5’-CGCATGTTTACACTTGGGTTTC-3’(SEQ ID NO:9)
内标探针:HPGT31-P:5’-CAACGTCCTGTCCACCTTCCTCCTATG-3’(SEQ ID NO:10)。
其中,检测探针的荧光基团是FAM,内标探针的荧光基团是HEX。
实施例2、检测HIV-1的方法
HIV-1RNA核酸的提取..:圣湘生物核酸提取或纯化试剂
2.1取适量1.5mL离心管,分别加入20μL蛋白酶K、500μL裂解液;
2.2将待测样本(血浆)6000rpm离心5分钟后,取800μL加入上述离心管中,盖上管盖,震荡混匀10秒钟;
2.3震荡混匀10秒后室温静置30分钟;
2.4瞬时离心后将离心管置于磁性分离器上,5分钟后缓慢将溶液吸出(注意不要碰到吸附于管壁的棕色物);
2.5加入500μL核酸洗涤液1和200μL核酸洗涤液2,震荡混匀5秒钟,瞬时离心后将离心管再次置于分离器上;
2.6约3分钟后,上清液分为两层,将吸头插入离心管底部,从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃,静置1分钟后将管底残余液体完全吸出丢弃;
2.7加入35μL洗脱液,将离心管壁上磁珠洗脱到管底,吸打混匀3~4次,室温静置10分钟后将离心管再次置于分离器上3分钟,然后将洗脱下来的核酸放于新的1.5mL灭菌离心管中。
经洗脱下来的核酸吸取30μL加入到PCR反应液中进行PCR扩增检测。
核酸PCR扩增:
3.1将PCR反应管放入扩增仪样品槽,按对应顺序设置阴性对照、阳性对照、定量参考品A~D以及未知样本,并设置样本名称及定量参考品浓度。
3.2荧光检测通道选择:
3.2.1ABI系列、宏石SLAN仪器:
1)选择FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:none)检测HIV-RNA;2)选择HEX或VIC通道(Reporter:HEX/VIC,Quencher;none)检测HIV内标;3)参比荧光(Reference Dye):选择ROX。
3.2.2Roche荧光PCR仪:
选择New Experiment,在setup设置面板Detection format下拉菜单中选择DualColor Hydrolysis Probe/UPL Probe,在Customize下拉菜单中:1)选择FAM通道检测HIV-RNA;2)选择VIC/HEX/Yellow通道检测HIV内标。设置Reaction Volume为60。
3.3循环参数设定:
步骤温度时间循环数
1预变性和酶激活95℃1分钟1
2逆转录60℃30分钟1
3cDNA预变性95℃1分钟1
4变性95℃15秒45
退火,延伸及荧光采集58℃30秒*
5仪器冷却25℃10秒1。
4.结果分析
反应结束后自动保存结果,对人类免疫缺陷病毒的曲线和相应人类免疫缺陷病毒内标的曲线分别进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(Start值可以在3~15、End值可设在5~20,调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线),点击Analyze进行分析,然后到Plate窗口下记录定量结果。
实施例3、本发明组合物检测临床样本
本次对比实验采用临床样本,共检测血浆500例,其中男性415例,女性85例,年龄分布为10~80岁。通过对样本测序获得各型别信息,其中B亚型(包含B型及B'型)69例、BC亚型(包含CRF07_BC型及CRF08_BC型)176例和AE亚型(包含CRF01_AE型)140例。使用实施例1所示的组合物和对照试剂按照实施例2所述方法进行检测,其结果如表1所示。
表1、本试剂临床样本检测结果分布
从表1的结果可以看出,本发明的组合物能够准确检测临床样本。由于对照试剂最低检出限的限制,对低于25IU/mL的样本检出效率偏低,导致病毒载量低于25IU/mL的样本比本试剂多一个,即少检测出一个阳性样本。而本发明的组合物能够检测低于25IU的样本,因此,并未存在漏检。
实施例4、本发明组合物灵敏度检测
本次检测通过将已知浓度的参考品分别稀释至25IU/mL和22IU/mL,使用实施例1所示的组合物按照实施例2所述方法进行检测,其结果如图1~2所示。实验结果证明,本发明组合物能够检测22IU/mL的样本。
对比例1、对比例组合物检测HIV-1
本次对比实验采用临床样本,分别检测血浆24例。使用实施例1所示的组合物和对照试剂按照实施例2所述方法进行检测,其结果如图3~6所示。
从对比结果发现,单靶点引物探针的扩增和双靶点引物探针的组合扩增,检出率均一致,24个临床样本均能检测出。但是单靶点引物探针扩增曲线的荧光信号强度相比双重靶点扩增的低,且检测的曲线CT值比双靶点检测拖后。
对比例2、对比O组引物检测HIV-1
本方案是将确定浓度的HIV-1O组参考样品进行等比稀释,然后用含有SEQ ID NO:6引物的双重检测体系和不含有SEQ ID NO:6引物的双重检测体系进行检测,检测结果如图7~8所示。
本方案结果表明,加入O组引物后检测的参考品CT值在21.5到26.5之间,且检出率为(12/12)100%,而不含O组引物检测的同浓度参考品CT值在26.5到36.5之间,检出率为(11/12)91.7%,检出率降低,且加入O组引物后平均提前了5个CT值且曲线更优,对低浓度样本的检测率更高,表明O组引物的加入提高了整个组合物的灵敏度。
序列表
<110> 圣湘生物科技股份有限公司
<120> 检测HIV-1的组合物、试剂盒、方法及其用途
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cctgggagct ctctggcta 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagcactcaa ggcaagcttt at 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagcactcaa ggcaagcttt at 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaatcactct ttggcarcga c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccccctatca tttttggttt c 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atccctcttt gggacagacc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
actgtatcat ctgcycctgt 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caaagaccgt tgtgtccaga ag 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgcatgttta cacttgggtt tc 22
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caacgtcctg tccaccttcc tcctatg 27
<210> 11
<211> 475
<212> DNA
<213> 乳头瘤病毒
<400> 11
ttgtaagtgt gaagccagaa ttgagctagt agtagaaagc tcagcagacg accttcgagc 60
attccagcag ctgtttctga acaccctgtc ctttgtgtgt ccgtggtgaa gagtttatta 120
atgaagatat tgtaaatttg cccgagaatg tcgattggag aaaaaaagga gctgtcactc 180
ccgtaaaaca tcagggttca tgcggtagtt gttgggcatt ctcggccgtt gcaactgtag 240
agggaataaa taagattaga actggaaaat tagtagaatt atcagagcaa gaacttgttg 300
actgtgaaag acgtagccat ggggcaaaga ccgttgtgtc cagaagaaaa acaaagacat 360
ttggataaaa agaaacgatt ccacaacata ggaggaaggt ggacaggacg ttgcatagca 420
tgttggagaa gacctcgtac tgaaacccaa gtgtaaacat gcgatatttt atact 475
Claims (10)
1.一种能够检测HIV-1的组合物,所述组合物同时包括:
上游引物HIV-ZF1:5’-CCTGGGAGCTCTCTGGCTA-3’(SEQ ID NO:1);
下游引物HIV-ZR1:5’-AAGCACTCAAGGCAAGCTTTAT-3’(SEQ ID NO:2);
检测探针HIV-ZP1:5’-AGGCTTAAGCAGTGGGTTCC-3’(SEQ ID NO:3);
上游引物Z-POL-F1:5’-AAATCACTCTTTGGCARCGAC-3’(SEQ ID NO:4);
下游引物Z-POL-R1:5’-CCCCCTATCATTTTTGGTTTC-3’(SEQ ID NO:5);
上游引物Z-POL-FO:5’-ATCCCTCTTTGGGACAGACC-3’(SEQ ID NO:6);以及,
检测探针Z-POL-P1:5’-ACTGTATCATCTGCYCCTGT-3’(SEQ ID NO:7)。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中,所述组合物进一步包括监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。
3.根据权利要求2所述的组合物,其中,所述组合物进一步包括如SEQ ID NO:8所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:9所示的内标下游引物,和如SEQ ID NO:10所示的内标探针。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中,所述组合物的检测探针的荧光基团为FAM,所述组合物的内标探针的荧光基团为HEX。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的组合物,其中,所述组合物的各核酸组合物分别存在于单独包装中。
6.权利要求1~5中任一项所述的组合物在制备检测HIV-1的试剂盒中的用途。
7.一种检测HIV-1的试剂盒,所述试剂盒包括如权利要求1~5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包括核酸释放体系和核酸扩增体系。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其中,所述试剂盒进一步包括标准品。
10.一种用于以非诊断目的检测HIV-1的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提取或释放待测样本的核酸;
2)使用如权利要求1~5中任一项所述的组合物对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR分析;
3)获得并分析结果。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2107732A1 (en) * | 1992-10-06 | 1994-04-07 | Lutz G. Gurtler | Retrovirus from the hiv group and its use |
CN109576397A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-05 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒 |
CN111534640A (zh) * | 2020-05-12 | 2020-08-14 | 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心 | 用于定性检测艾滋病病毒的试剂和方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016137975A1 (en) * | 2015-02-23 | 2016-09-01 | University Of Washington | Primers, probes and methods for sensitive, specific detection and monitoring of hiv-1 and hcv |
CN107090521A (zh) * | 2017-05-09 | 2017-08-25 | 广州海力特生物科技有限公司 | 一种人类免疫缺陷病毒ⅰ型总核酸hiv‑1 tna的试剂盒及其应用 |
-
2022
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- 2022-11-30 EP EP22839992.9A patent/EP4326909A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2107732A1 (en) * | 1992-10-06 | 1994-04-07 | Lutz G. Gurtler | Retrovirus from the hiv group and its use |
CN109576397A (zh) * | 2018-12-28 | 2019-04-05 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒 |
CN111534640A (zh) * | 2020-05-12 | 2020-08-14 | 中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心 | 用于定性检测艾滋病病毒的试剂和方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NING TANG等: "A RealTime HIV-1 viral load assay for automated quantitation of HIV-1 RNA in genetically diverse group M subtypes A-H, group O and group N samples", J VIROL METHODS, vol. 146, no. 1, 17 August 2007 (2007-08-17), pages 236 - 245 * |
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