CN116064776A - 恒温快速检测人y染色体微缺失的引物-探针组合物及试剂盒 - Google Patents

恒温快速检测人y染色体微缺失的引物-探针组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种恒温快速检测人Y染色体微缺失的引物‑探针组合物及试剂盒。提供了满足染色体微缺失不同STS位点(SY84、SY86、SY127、SY134、SY25、SY255)及SRY、ZFX/Y特异性引物及探针的碱基序列。还提供检测试剂盒，包括通过设计筛选而获得的特异性引物‑探针组合，满足微体积反应的酶冻干粉、溶解液及激活剂。只需要微量样本DNA即可在恒温扩增荧光检测仪器中可实现15分钟以内检测出Y染色体微缺失的类型，特异性好，准确性高。

Description

恒温快速检测人Y染色体微缺失的引物-探针组合物及试剂盒
技术领域
本发明属于体外核酸分子检测技术领域，涉及一种恒温快速检测人Y染色体微缺失的引物-探针组合物及试剂盒。
背景技术
Y染色体微缺失是导致男性不育的最重要的遗传因素之一。Y染色体微缺失是指Y染色体上无精子症因子(Azoospermia Factor，AZF)区域的缺失，可分为AZFa、AZFb、AZFc三个区域，每个区域均有明确的序列标签位点(Sequence tagged site，STS)可供识别；根据欧洲男科协会(European Academy of Androlog，EAA)和欧洲分子遗传质控网(EuropeanMolecular Genetics Quality Network，EMQN)联合发布的1999版、2004版和2013版《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》均推荐使用多重PCR-琼脂糖凝胶检测STS的方法来检测Y染色体的微缺失。同时，指南推荐每个区域检测2个STS位点，分别为AZFa区域的sY84和sY86位点，AZFb区域的sY127和sY134位点，AZFc区域的sY254和sY255位点，若每个区域的2个STS同时缺失，则代表该区域发生缺失；并指出通过以上6个STS可以检测出几乎所有临床相关的微缺失或95％文献报道的AZF微缺失，足以满足常规诊断。
目前，现有技术中人Y染色体微缺失检测方法主要有PCR衍生的检测技术以及测序检测。1)多重PCR-琼脂糖凝胶电泳法，虽然受到《Y染色体微缺失分子诊断实践指南》的推荐，但操作复杂，检测时间长速度慢，不能实现自动化。2)实时荧光定量PCR技术，虽然灵敏度高于多重PCR-琼脂糖凝胶电泳法，自动化程度高，无需要电泳检测；但是周转时间较长，至少需要一个小时，专业的检测仪器设备和专业人员的操作，限制了检测场景的应用。有利用多重荧光定量PCR检测Y染色体微缺失，比如在申请号为2018109907722的快速检测人类Y染色体微缺失的多重PCR引物组、试剂盒和应用中，提供一种快速检测人类Y染色体微缺失的多重PCR引物组，可同时扩增Y染色体上6个STS基因位点和内参基因SRY；每个STS位点都含有特异性扩增的PCR引物和特异性扩增的RCR巢式引物，可以减小各个基因扩增效率的差异，促使扩增均衡、高效和稳定，但对其要求的样本提取基因组DNA的浓度和纯度要求高，DNA浓度在5ng/μL以上，纯度A260/A280在1.8～2.0之间。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测时间短、结果准确、灵敏度高、操作简单的Y染色体微缺失检测引物-探针组合，还提供相关检测的试剂盒。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种恒温快速检测人Y染色体微缺失的引物-探针组合物，所述引物-探针组合物中的引物和探针序列如下：
1)特异性扩增AZFa区SY84的上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ IDNO:2
所示，及荧光探针如SEQ ID NO:25所示；
2)特异性扩增AZFa区SY86的上游引物如SEQ ID NO:4所示，下游引物如SEQ IDNO:5
所示，及荧光探针如SEQ ID NO:26所示；
3)特异性扩增AZFb区SY127的上游引物如SEQ ID NO:7所示，下游引物如SEQ IDNO:8所示，及荧光探针如SEQ ID NO:27所示；
4)特异性扩增AZFc区SY134的上游引物如SEQ ID NO:10所示，下游引物如SEQ IDNO:11所示，及荧光探针如SEQ ID NO:28所示；
5)特异性扩增AZFc区SY254的上游引物如SEQ ID NO:13所示，下游引物如SEQ IDNO:14所示，及荧光探针如SEQ ID NO:29所示；
6)特异性扩增SY255的上游引物如SEQ ID NO:16所示，下游引物如SEQ ID NO:17所示，及荧光探针如SEQ ID NO:30所示；
7)特异性扩增SRY的上游引物如SEQ ID NO:19所示，下游引物如SEQ ID NO:20所示，及荧光探针如SEQ ID NO:31所示；
8)特异性扩增ZFX/Y的上游引物如SEQ ID NO:22所示，下游引物如SEQ ID NO:23所示，及荧光探针如SEQ ID NO:32所示。
进一步，所述荧光探针在距离5’端约30nt处的胸腺嘧啶修饰荧光基团，距离3’端约15nt处的胸腺嘧啶修饰淬灭基团，在荧光基团和淬灭基团之间的2-4nt范围内任一处的碱基替换为THF作为外切酶exo的切断位点，探针3’末端标记阻断基团。
进一步，恒温快速检测人Y染色体微缺失的引物-探针组合物中，所述荧光基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL；所述阻断基团选自C3-spacer、胺基、生物素-三甘醇或磷酸基。
优选的，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1，所述3’末端阻断基团为C3-spacer。
优选的，荧光探针序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24所示。
2、还提供一种恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒，包含有上述任一项所述的引物-探针组合物。
进一步，恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒中还包括dNTPs、缓冲液、工程酶组合物。
进一步，恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒中，所述缓冲液为聚乙二醇1.5-5％；Tris 10-50mM；二硫苏糖醇1-10mM；ATP 1.5-3.5mM；磷酸肌酸二钠盐20-75mM；磷酸激酶10-200ng/μL；海藻糖2.5-7.5％；甘露醇40-50ng/μL。
进一步，恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒中，工程酶组合物中包含重组酶100-500ng/μL；单链DNA结合蛋白100-200ng/μL；DNA聚合酶50-250ng/μL；核酸外切酶200-300ng/μL。
进一步，恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒中，还包括激活剂。
优选地，所述激活剂为醋酸镁。所述激活剂为80-160mM的醋酸镁；
优选地，醋酸镁为80-160mM；
更优选地，醋酸镁为140mM；
进一步，恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒中，，所述试剂盒的反应体系为10μL，包括：dNTPs、缓冲液和工程酶组合物的混合物5-6μL，激活剂0.5-1μL，样本DNA2-3μL，或2-3μL阴/阳性对照，上游引物0.2-0.4μL，上游引物0.2-0.4μL，荧光探针0.08-0.12μL，ddH2O补足至10μL。
本发明的有益效果在于：针对现有Y染色体微缺失检测技术存在的问题，我们发明了一种恒温扩增的Y染色体微缺失检测的引物-探针组合物，该引物对和探针组合物具有较强的特异性，其检测灵敏度均较常规PCR高，样本DNA只需要0.2ng/μL即可，对样本DNA纯度要求也不苛刻。且本发明提供的试剂盒具有检测操作方法简便、反应时间短等优点。本发明各引物-探针组合均在独立的反应孔中，在10μl微体积体系下，可在恒温下15分钟内完成多个位点的检测，通过检测荧光信号判断在Y染色体上是否存在缺失情况，实现在15分钟内快速结果判读。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为发明试剂盒正常男性血液样本最低浓度检测限。
图2为正常男性样本扩增结果。
图3为AZF a区域缺失样本扩增结果。
图4为AZF b区域缺失样本扩增结果。
图5为AZF c区域缺失样本扩增结果。
图6为AZF b+c区域缺失样本扩增结果。
图7为AZF a+b+c区域缺失样本扩增结果。
图8为正常女性样本扩增结果。
图9为空白组结果。
图10为不同扩增反应体积的扩增结果。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。
实施例1引物探针设计及检测方案
根据欧盟生殖协会(EAA)和EMQN指南发布的2013版Y染色体微缺失检测指南，推荐经典的6个位点(sY84、sY86、sY127、sY124、sY254、sY255)检测进行，上述的6个位点能够诊断所有临床相关95％以上文献报道的ZAF缺失情况，足够满足常规诊断需求，并设置雄性性别决定基因SRY作为性别异常对照，部分XY男性性反转的患者可能不携带SRY位点。人类锌指蛋白基因ZFX/Y作为对样品采集、核酸提取与扩增的对照。设计各引物-探针组合序列如下表1所示。荧光探针序列如SEQ ID NO:25-SEQ ID NO:32所示，荧光探针在距离5’端约30nt(核苷酸)处的胸腺嘧啶修饰荧光基团，荧光基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；距离3’端约15nt处的胸腺嘧啶修饰淬灭基团，淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL；在荧光基团和淬灭基团之间的2-4nt范围内任一处的碱基替换为THF(四氢呋喃)作为外切酶exo的切断位点，探针3’末端标记阻断基团以防DNA聚合酶催化延伸，3’末端阻断基团包括C3-spacer、胺基、生物素-三甘醇或磷酸基。优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1，所述3’末端阻断基团为Spacer C3。
表1引物-探针序列
Figure BDA0003970025140000041
Figure BDA0003970025140000051
Figure BDA0003970025140000061
检测方案根据表1所列的引物-探针组合进行各反应管设计；表2为本发明对应STS位点反应管设计，通过实验优化参数，最终确定最佳预冻干酶mix混合液，表3为预冻干酶mix混合液中的组分和组分体积量，将dNTPs、能量缓冲液和多种工程酶按表3的体积比混合成预冻干酶mix混合液，其中dNTPs 1-1.8mM，能量缓冲液中各组分的浓度范围如下：聚乙二醇1.5-5％；Tris 10-50mM；二硫苏糖醇1-10mM；ATP 1.5-3.5mM；磷酸肌酸二钠盐20-75mM；磷酸激酶10-200ng/μL；海藻糖2.5-7.5％；甘露醇40-50ng/μL。工程酶组合物中，各组分的浓度范围如下：重组酶100-500ng/μL；单链DNA结合蛋白100-200ng/μL；DNA聚合酶50-250ng/μL；核酸外切酶200-300ng/μL。表4为酶冻干混合物中各反应管组分和组分体积量，分别将表2中各反应管对应STS位点的引物和探针按表4的组分量加入预冻干酶mix混合液混合后再冻干成酶冻干混合物。
表2为各反应管对应STS位点检测设计：
反应管名称 点位 荧光标记
A sY84 FAM
B sY86 FAM
C sY127 FAM
D sY134 FAM
E sY255 FAM
F sY254 FAM
G SRY FAM
H ZFX/Y FAM
表3为预冻干酶mix混合液组分：
Figure BDA0003970025140000062
Figure BDA0003970025140000071
表4为酶冻干混合物各反应管组分：
Figure BDA0003970025140000072
*备注：预冻干酶mix混合液包含上述预冻干中含有dNTPs 1-1.8mM、能量缓冲液以及多种工程酶混合液。
检验原理：本发明采用技术对人Y染色体STS序列进行扩增检测，根据欧盟生殖协会(EAA)和EMQN发布的2013版Y染色体微缺失检测指南，推荐经典的6位点(sY86、sY84、sY134、sY127、sY255、sY254)，以及雄性性别决定基因SRY，人类锌指蛋白基因ZFX/Y双靶标监控样本采集及提取过程，探针均采用FAM标记，在39℃最佳反应温度条件下，重组酶与引物形成蛋白-DNA复合物，在DNA模板上搜索到同源序列后，将DNA双链打开，上下游引物开始特异性识别核酸靶标碱基序列，在单链结合蛋白的协同作用下发生链置换反应，聚合酶利用dNTPs根据Watson-Crick碱基配对原则按5’往3’方向合成DNA，如此反复，实现靶标区域的指数扩增。荧光探针对扩增过程进行实时荧光检测。可以按表5制备人Y染色体微缺失检测试剂盒。
表5人Y染色体微缺失检测试剂盒组成成分
Figure BDA0003970025140000073
Figure BDA0003970025140000081
溶解剂含有Tris 10-60mM；醋酸钾50-150mM；2.5％-7.5％的聚乙二醇，优选的聚乙二醇分子量为20000-35000；激活剂为80-160mM的醋酸镁，优选地，激活剂中醋酸镁为140mM。试剂盒中各引物-探针组合中上游引物和下游引物的反应终浓度为300nM-500nM，探针的反应终浓度为60nM-240nM。
实施例2样本处理、检测方法及结果分析
1)人外周血样本基因组DNA的准备
采用商业化的核酸快速释放剂进行样本处理提取DNA，EDTA抗凝血样本释放核酸步骤如下：
a)EDTA抗凝血样本先用DEPC水进行10倍稀释。
b)取稀释处理过的血液样本50μL，加入150μL的样本释放剂，混合均匀。
c)混合后静止3分钟取上清液。
样本要求为外周全血，样本采集要求为EDTA抗凝管，采集后需将采集管颠倒混匀3-4次，使血液与抗凝剂充分混合。全血标本建议保存在-20℃以下6个月，反复冻融不超过5次。
样本处理选用商品化的全血基因组DNA提取试剂盒，所提取的DNA OD260/OD280在1.6-2.0之间。提取的DNA在48小时内用于检测，4℃存放。如果检测时间推迟至48小时之后，储存至-20℃以下备用，存储有效期不超过半年。
2)试剂使用方法
a)向预装酶冻干混合物的反应管中(A-H)依次均加入溶解剂6μL。
b)取样本释放剂处理后的待测样本3μL，分别依次均加入反应管(A-H)；或3μL阴/阳性对照(G、H)，阳性对照品为正常男性全血提取基因组DNA，阴性对照品为正常女性全血提取基因组DNA。
c)将各反应管的盖子内侧滴加激活剂1μL混匀(优选的上下颠倒并甩动反应管8-10次进行混匀)。
d)混匀后，将反应液甩至管底部(或快速离心)，随后立即将反应管放入荧光检测设备中进行扩增荧光信号采集。
3)扩增程序
荧光检测程序设置为：恒温39℃；每隔30秒采集一次荧光信号，连续采集30次；荧光检测通道为FAM通道。扩增温度范围可以是37℃-42℃，优选39℃。
适用仪器：荧光恒温扩增仪，ABI 7500，ABI Q3。
4)结果分析，可以按照表6进行对照检测结果。
表6检验结果解释
Figure BDA0003970025140000091
由上述表6可见，采用恒温扩增法进行扩增，可判断各种类型AZFa，AZFb，AZFc，AZFb+c，AZFa+b+c缺失及女性标本。
缺失判定：无荧光信号曲线产生的反应单元指示相应的AZF区域缺失。
实施例3产品性能指标
1、灵敏度分析
选用正常男性样本进行灵敏度分析，本发明检出试剂可稳定检出人基因组DNA最低浓度为0.2ng/μL。图1为发明试剂盒正常男性血液样本最低浓度检测限扩增试验结果(0.2ng/μL)。
2、特异性
将不同的样本用本发明检出试剂进行检测：
1)、正常男性样本扩增
图2为正常男性样本扩增实验结果，扩增结果如下。
A B C D E F G H
检出 检出 检出 检出 检出 检出 检出 检出
2)、AZFa区域缺失样本扩增
图3为AZF a区域缺失样本扩增实验结果，扩增结果如下。
A B C D E F G H
未检出 未检出 检出 检出 检出 检出 检出 检出
3)、AZFb区域缺失样本扩增
图4为AZF b区域缺失样本扩增实验结果，扩增结果如下。
A B C D E F G H
检出 检出 未检出 未检出 检出 检出 检出 检出
4)、AZFc区域缺失样本扩增
图5为AZFc区域缺失样本扩增实验结果，扩增结果如下。
A B C D E F G H
检出 检出 检出 检出 未检出 未检出 检出 检出
5)、AZFb+c缺失样本扩增
图6为AZF b+c区域缺失样本扩增实验结果，扩增结果如下。
A B C D E F G H
检出 检出 未检出 未检出 未检出 未检出 检出 检出
6)、AZFa+b+c缺失样本扩增
图7为AZFa+b+c区域缺失样本扩增实验结果，扩增结果如下。
A B C D E F G H
未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 检出 检出
7)、正常女性样本扩增
图8为正常女性样本扩增实验结果，扩增检测结果如下。
A B C D E F G H
未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 检出
8)、以无菌水作为模板扩增
图9以无菌水作为模板的空白实验结果，扩增检测结果如下。
A B C D E F G H
未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出 未检出
3、重复性
选用正常男性DNA样本选取两个浓度(2ng/μL和0.2ng/μL)进行扩增检测，在不同检测机构，3组样本各进行两次测试，每次测试不同浓度均进行4次重复，结果在不同的试验条件下扩增检测结果完全一致，所有STS位点均可有效检测。
4、稳定性
试剂应-20℃避光保存，有效期为6个月。
拆封后未使用的产品可以在2-8℃条件下保存3天。
复溶后需要在10分钟之内完成样本的加入，并尽快上机检测。
冻干酶反应管反复冻融不超过3次。
实施例4
确定最佳扩增反应体积，在相同核酸模板量的条件下，扩增对比不同体积反应扩增效果。测试结果如图10所示，显示10μl体系下扩增荧光信号强度与出峰时间均优于50μl体系和25μl体系。
Figure BDA0003970025140000111
Figure BDA0003970025140000121
其中，引物探针mix按上游引物2μl下游引物2μl探针0.6μl的比例配置。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种恒温快速检测人Y染色体微缺失的引物-探针组合物，其特征在于，所述引物-探针组合物中的引物和探针序列如下：
1)特异性扩增AZFa区SY84的上游引物如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示，及荧光探针如SEQ ID NO:25所示；
2)特异性扩增AZFa区SY86的上游引物如SEQ ID NO:4所示，下游引物如SEQ ID NO:5所示，及荧光探针如SEQ ID NO:26所示；
3)特异性扩增AZFb区SY127的上游引物如SEQ ID NO:7所示，下游引物如SEQ IDNO:8所示，及荧光探针如SEQ ID NO:27所示；
4)特异性扩增AZFc区SY134的上游引物如SEQ ID NO:10所示，下游引物如SEQ IDNO:11所示，及荧光探针如SEQ ID NO:28所示；
5)特异性扩增AZFc区SY254的上游引物如SEQ ID NO:13所示，下游引物如SEQ IDNO:14所示，及荧光探针如SEQ ID NO:29所示；
6)特异性扩增SY255的上游引物如SEQ ID NO:16所示，下游引物如SEQ ID NO:17所示，及荧光探针如SEQ ID NO:30所示；
7)特异性扩增SRY的上游引物如SEQ ID NO:19所示，下游引物如SEQ ID NO:20所示，
及荧光探针如SEQ ID NO:31所示；
8)特异性扩增ZFX/Y的上游引物如SEQ ID NO:22所示，下游引物如SEQ ID NO:23所示，及荧光探针如SEQ ID NO:32所示。
2.根据权利要求1所述的恒温快速检测人Y染色体微缺失的引物-探针组合物，其特征在于，所述荧光探针在距离5’端约30nt处的胸腺嘧啶修饰荧光基团，距离3’端约15nt处的胸腺嘧啶修饰淬灭基团，在荧光基团和淬灭基团之间的2-4nt范围内任一处的碱基替换为THF作为外切酶exo的切断位点，探针3’末端标记阻断基团。
3.根据权利要求1所述的恒温快速检测人Y染色体微缺失的引物-探针组合物，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL；所述阻断基团选自C3-spacer、胺基、生物素-三甘醇或磷酸基。
4.一种恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1、2任一项所述的引物-探针组合物。
5.根据权利要求4所述恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、缓冲液、工程酶组合物。
6.根据权利要求5所述恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为聚乙二醇1.5-5％；Tris 10-50mM；二硫苏糖醇1-10mM；ATP 1.5-3.5mM；磷酸肌酸二钠盐20-75mM；磷酸激酶10-200ng/μL；海藻糖2.5-7.5％；甘露醇40-50ng/μL。
7.根据权利要求5所述恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，工程酶组合物中包含重组酶100-500ng/μL；单链DNA结合蛋白100-200ng/μL；DNA聚合酶50-250ng/μL；核酸外切酶200-300ng/μL。
8.根据权利要求5所述恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括激活剂。
9.根据权利要求8所述恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述激活剂为醋酸镁。
10.根据权利要求8所述恒温快速检测人Y染色体微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为10μL，包括：dNTPs、缓冲液和工程酶组合物的混合物5-6μL，激活剂0.5-1μL，样本DNA2-3μL，或2-3μL阴/阳性对照，上游引物0.2-0.4μL，上游引物0.2-0.4μL，荧光探针0.08-0.12μL，ddH2O补足至10μL。
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