CN116064652A - 一种甘蔗棉子糖合成酶SsRS1基因在提高植物抗旱性中的应用 - Google Patents
一种甘蔗棉子糖合成酶SsRS1基因在提高植物抗旱性中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种甘蔗棉子糖合成酶SsRS1基因在提高植物抗旱性中的应用，SsRS1基因发现于具有较强抗旱特性的甘蔗割手密种材料，SsRS1基因序列如SEQIDNO.1所示；SsRS1基因所编码的蛋白序列如SEQIDNO.2所示。本发明发现提升SsRS1基因表达可提高植物抗旱性，显示SsRS1基因可作为增强植物抗旱性的基因资源，对作物抗旱育种应用有重要应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种甘蔗棉子糖合成酶SsRS1基因在提高植物抗旱性中的应用。
背景技术
基因工程育种即通过挖掘目标性状基因，并经基因克隆转化等手段将目标基因(或相应调控元件等)转移至待改良材料，从而快速获得目标性状改良的新种质新品种。目前，结合基因编辑技术，也可针对目标基因进行适当编辑，实现目标基因表达改变从而获得目标性状改良的新品种。由于基因工程育种可以精准、快速实现目标性状改良，因此已成为未来作物育种的重要手段。实现基因工程育种的一个先决条件是定位并挖掘重要性状基因，因此，发掘鉴定重要性状基因有着重要的意义和育种价值。
棉子糖系列寡糖(Raffinosefamilyoligosaccharides，RFOs)是植物中特有的一类功能性低聚糖。在大多数植物中，RFOs总含量仅次于蔗糖。RFOs是由一分子的蔗糖通过α-1，6-糖苷键逐级去连接一个或多个的半乳糖苷基团而成，主要成员包括水苏糖(Stachyose)、棉子糖(Raffinose)和毛蕊花糖(Verbascose)。其中，棉子糖在植物物种中普遍存在，在植物中的代谢通路主要功能包括三方面：(1)参与植物的非生物胁迫抗性；(2)参与韧皮部的同化物转运；(3)参与植物种子的活力建成等多个生理过程。其中前者对于农业生产意义十分重大。除以上植物内源功能外，RFOs还具有保护肝脏、提高机体免疫力、改善肠道群落组成、降血压等多种生理功效，在保健食品生产中被广泛应用。
目前，国内外关于植物棉子糖合成酶(Raffinose synthase，RS)相关研究仅在拟南芥、水稻等少数植物中克隆到编码产物具备有明确棉子糖合成活力的RS基因。在众多物种，包括甘蔗中，关于棉子糖的研究相对较少，在提高植物抗旱性方面的研究应用还未见报道。本申请利用耐旱甘蔗材料割手密，通过分析干旱响应的转录组数据，发现其糖合成酶SsRS1基因具备干旱差异表达特性；克隆该基因并转化拟南芥后发现可提高拟南芥植株的抗旱能力，揭示该基因可用于植物耐旱材料的基因工程育种。
发明内容
本发明的目的是为了挖掘可应用于基因工程育种，创制耐旱作物新品种的耐旱潜力基因，而提出的一种甘蔗棉子糖合成酶SsRS1基因在提高植物抗旱性中的应用，该SsRS1基因可作为抗旱新植物资源或品种创制的重要基因资源，具有重要的作物抗旱育种应用潜力。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种甘蔗棉子糖合成酶SsRS1基因在提高植物抗旱性中的应用。
优选地，所述SsRS1基因为割手密SES208的SsRS1基因。
优选地，所述SsRS1基因序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述SsRS1基因所编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
通过采用上述技术方案：使SsRS1基因在植物中高表达的方法是将含有所述SsRS1基因的重组表达载体导入所述植物中。
其中，所述重组表达载体具体是将SsRS1基因的cDNA序列插入pSUPER:eGFP的克隆位点得到的。
其中，上述植物为割手密，转基因材料为拟南芥。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明只需要过表达单个基因，即甘蔗SsRS1基因，即可提高植物的抗旱性操作简便，便于筛选，可有效降低成本。同时，该基因对不同温度和盐浓度处理均表现出显著差异表达，说明该基因也具有不同非生物胁迫调节应用潜力。
2、本发明利用耐旱甘蔗材料割手密，通过分析干旱响应的转录组数据，发现其糖合成酶SsRS1基因具备干旱差异表达特性；克隆该基因并转化拟南芥后发现可提高拟南芥植株的抗旱能力，揭示该基因可用于植物耐旱材料的基因工程育种。
附图说明
图1为SsRS1受干旱诱导表达图；
按照SES208转录组样品处理的条件重新制备样品并提取总RNA，将SsRS1基因进行qRT-PCR检测。Control：未经干旱处理；Mild Drought：干旱三天；Severe Drought：干旱十天的植株。eEF为内参基因，所有数据点均为平均值±SE(n＝3)，*表示用T检验进行的单因素方差分析存在显著性差异(P<0.05)。
图2为SsRS1基因能够受水分等非生物胁迫诱导表达图；
qRT-PCR检测200mM NaCl、100mM MeJA、4℃、38℃、100μM ABA、30％PEG6000和100mM Mannitol和处理后SES208植株中SsRS1基因的表达情况。
图3为SsRS1基因克隆与基本理化性质分析图；
(A)SsRS1基因片段克隆，M：2000bp；SsRS1为扩增的片段。(B)SsRS1的基因模式图，黑色条状示外显子，黑色线示内含子。(C)SsRS1基因编码蛋白的氨基酸组成比例。(D)SsRS1二级结构检测。红色：延伸直链；蓝色：α-螺旋；紫色：无规则卷曲；绿色：β-转角。(E)SsRS1三级蛋白结构预测分析。
图4为SsRS1的亚细胞定位以及组织表达分析图；
(A)农杆菌侵染本氏烟草叶片48h后GFP和SsRS1-eGFP的亚细胞定位。从左到右依次为GFP绿色荧光、核定位信号、明场图片以及前三者的融合效果。标记的红色箭头和黄色箭头分别表示细胞质和细胞核。(B)使用anti-GFP检测本氏烟草、GFP和SsRS1-eGFP的蛋白表达水平，H3组蛋白为内参蛋白。(C)甘蔗原生质体中GFP和SsRS1-eGFP的亚细胞定位。从左到右依次为GFP荧光信号、细胞核定位标记物、明场以及混合图片。mCherry-ARF191V是一种具有RFP信号的细胞核定位标记物。图片标尺为10μm。(D)SsRS1的组织特异性表达。即SsRS1在叶、根、茎以及叶鞘中的表达，以叶的表达作为参考。eEF为内参基因，所有数据点均为平均值±SE(n＝3)，*表示用T检验进行的单因素方差分析存在显著性差异(P<0.05)。
图5为pSUPER:SsRS1-eGFP过表达T3代纯合材料筛选鉴定图；
(A)pSUPER:SsRS1-eGFP过表达拟南芥T1代植株DNA检测。Marker：2000bp。(B)qRT-PCR检测拟南芥过表达株系中SsRS1基因表达。三株过表达材料(#4，#9，#15)被选择用于这一检测分析。UBC21为内参基因，所有数据点均为平均值±SE(n＝3)，*表示用T检验进行的单因素方差分析存在显著性差异(P<0.05)。(C)使用anti-GFP检测Col-0、pSUPER:eGFP和过表达株系中的SsRS1的蛋白表达水平，红色箭头标示pSUPER:eGFP和过表达株系中的SsRS1蛋白，H3组蛋白为内参蛋白。(D)拟南芥过表达植株荧光信号检测。从左到右依次为野生型拟南芥(Col-0)、空载质粒拟南芥(pSUPER：eGFP)和SsRS1过表达的两个株系(#4，#15)；标尺为10μm。
图6为SsRS1提高拟南芥的抗旱性验证分析图；
(A)pSUPER:eGFP、pSUPER:SsRS1-eGFP#4和pSUPER:SsRS1-eGFP#15的转化植株土壤干旱表型。(B)复水后pSUPER:eGFP、pSUPER:SsRS1-eGFP#4和pSUPER:SsRS1-eGFP#15植株存活率分析。对14天大小幼苗进行干旱处理，当pSUPER:eGFP叶片完全萎蔫时复水，复水三天后统计植物的存活率。数据代表均值±SE(n＝6)。(C)pSUPER:eGFP、pSUPER:SsRS1-eGFP#4和pSUPER:SsRS1-eGFP#15植株的离体叶片失水速率。数据代表均值±SE(n＝5)。*表示用T检验进行的单因素方差分析存在显著性差异(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：SsRS1基因在干旱及非生物胁迫下的诱导表达
一、引物的设计和合成
根据SsRS1基因的CDS序列设计实时定量荧光PCR(qRT-PCR)引物，引物序列为：
正向引物：
5'-CTCGACCGCTCATCCGC-3'
反向引物：
5'-CACAGGTCCACGTAGTCGTC-3'
二、SES208植株非生物胁迫处理
取生长于田间的割手密SES208以及栽培种的四个品种，剪成约6-8cm的带一个节间与芽的茎，将其清洗干净以后置于大的容器中，加多菌灵侵泡过夜，将多菌灵洗净，置于加水的玻璃瓶中，每个玻璃瓶放两到三个茎，置于30℃春化箱中培养十天左右，待其芽长至约15cm。
干旱材料处理。选取长势一致的幼苗移至直径为26cm的花盆中，用相同重量的营养土培养，置于温室中。待幼苗长至十天左右，选取长势一致的幼苗进行干旱处理，一组作为对照正常浇水，另外一组进行干旱处理，十天后取样。
不同程度干旱材料处理。选取长势一致的幼苗移至直径为26cm的花盆中，用相同重量的营养土培养，置于温室中。待幼苗长至十天左右，选取长势一致的幼苗进行干旱处理，一组作为对照正常浇水，另外两组组进行干旱处理，分别三天和十天后取样。
水分胁迫材料。选取三株长势一致的割手密SES208放置于盛有总体积为80mL配比溶液组织培养的玻璃瓶中，进行100μM ABA、4℃、38℃、100mM MeJA、100mM Mannitol、200mMNaCl和30％PEG6000胁迫处理。除冷胁迫和热胁迫置于培养箱以外，其余胁迫置于30℃春化箱中培养，每组制备三个生物学重复的样品，其中Mannitol取样时间为12h、24h、48h，其余胁迫的取样时间为3h、6h、12h，取没经过胁迫处理甘蔗叶片作为对照组。
提取上述材料的总RNA，通过反转录得到cDNA，以上述所示的DNA分子为引物，进行实时定量荧光PCR，结果如图1、图2所示。
图1结果表明不同干旱条件均能诱导SsRS1的表达。且不同程度干旱胁迫下，SsRS1均表现出显著的表达提升，在重度干旱时SsRS1的表达量为对照组的10.2倍(图1)。
图2结果表明SsRS1基因在200mM NaCl、100mM MeJA、4℃、38℃、100μMABA、30％PEG6000和100mM Mannitol胁迫下表现出不同的表达模式。
结果表明，ABA胁迫抑制SsRS1表达；4℃、38℃、100mM MeJA、100mM Mannitol、200mM NaCl和30％PEG6000胁迫均能诱导SsRS1表达。其中在NaCl、MeJA、热胁迫以及PEG6000在受胁迫3h时达到最高值，分别为对照值的4.0、4.8、2.4以及1.49倍；在冷胁迫的6h时达到最高值，为对照组的3.4倍；受Mannitol胁迫48h后表达量大幅增加，达到了对照组的5.0倍(图2)。
实施例2：SsRS1基因的cDNA基因克隆
一、引物的设计和合成
根据SsRS1基因的CDS序列设计带有Gateway接头的引物，引物序列为：
正向引物：
5'-aaatcgactctagaaagcttATGGCTCCCAACCTCAGCAAGA-3'
反向引物：
5'-tgctcaccatggtaccGTAGACGTACTCGACGCGACAC-3'
二、提取割手密SES208的总RNA，通过反转录得到cDNA，以cDNA为模板，以上述所示的DNA分子为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(如SEQ ID No.1所示)，SsRS1基因的cDNA序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第44位至第2400位核苷酸所示，SsRS1氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
三、鉴定阳性克隆后再利用Gateway克隆表达试剂盒(EZ-Flex SeamlessAssembly and Cloning Kit)与双酶切后的pSUPER:eGFP载体大片段连接，得到重组质粒(图3A)，将其命名为pSUPER-SsRS1-eGFP，将pSUPER-SsRS1-eGFP送测序验证，该基因含有两个外显子和一个内含子(图3B)。DNAMAN软件分析结果显示甘蔗SsRS1基因序列全长2358bp，共编码786个氨基酸。在线ProtParam工具分析表明SsRS1基因编码的蛋白分子式为C3807H5871N1053O1101S38，分子量为85.22kDa，理论等电点(pI)为5.91。结果显示，该蛋白中甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)含量相对较高，分别占全部氨基酸的10.4％和10.6％；而谷氨酸(Gln)色氨酸(Trp)相对含量较低，分别占全部氨基酸的2.0％和2.2％。带正电荷氨基酸残基数为92，带负电荷氨基酸残基数为78；不稳定系数为37.39，推测其为稳定蛋白(不稳定系数在40以下为稳定蛋白)。脂肪系数为81.16，该蛋白亲水性平均系数为-0.086，预测其为亲水性蛋白(图3C)。利用SOPMA软件进行二级结构检测，该序列主要含有Alpha helix螺旋(α-螺旋)，Extended strand(延伸链)，Beta turn折叠(β-转角)和Random coil(无规卷曲)。其中α-螺旋有150个氨基酸，占27.08％；延伸链有75个氨基酸，占13.54％；β-转角有24个氨基酸，占4.33％；无规卷曲有305个氨基酸，占55.05％。SsRS1蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成(图3D)，这与SWISS-MODEL三维建模结果吻合(图3E)。
实施例3：SsRS1基因的亚细胞定位及组织特异性表达
一、SsRS1烟草亚细胞定位与蛋白表达
将实施例2得到重组序列转化入GV3101农杆菌中，采用农杆菌侵染的方法将pSUPER-SsRS1-eGFP质粒转入本氏烟草，以转入pSUPER：eGFP空载质粒作为对照，取48h后的过烟草叶片进行DAPI染色，并在激光共聚焦显微镜下观察，结果如图4A所示，SsRS1基因主要在细胞核与细胞质中表达。
用转染有pSUPER:SsRS1-eGFP质粒以及pSUPER:eGFP空载体根癌农杆菌的烟草叶片进行了SsRS1的蛋白表达检测，使用anti-GFP检测本氏烟草、pSUPER:eGFP和pSUPER:SsRS1-eGFP的蛋白表达水平，H3组蛋白为内参蛋白。结果如图4B所示，可检测到SsRS1蛋白表达。
二、SsRS1甘蔗原生质体亚细胞定位与组织特异性表达
分别转化pSUPER:SsRS1-eGFP质粒以及pSUPER:eGFP空载体到SES208割手密幼茎组织的原生质体当中，在激光共聚焦显微镜下观察，结果如图4C所示，可见该基因在甘蔗细胞核与细胞质中表达，这一结果与烟草中一致。
SsRS1的组织特异性表达。取经过干旱的SES208的根、茎、叶以及叶鞘，分别提取总RNA，通过反转录得到cDNA，以实施例2所示的DNA分子为引物，进行qRT-PCR，以叶的表达作为参考，eEF为内参基因，结果如图4D所示，SsRS1主要在甘蔗的叶高表达。
实施例4：SsRS1对植株抗旱性的影响
一、基因过表达植株的获得
采用农杆菌侵染的方法将pSUPER-SsRS1-eGFP质粒转入拟南芥Col-0植株，以转入pSUPER：eGFP空载质粒作为对照，将转染后的植株在含30mg/L潮霉素的1/2MS培养基上筛选，得到具有潮霉素(Hyg)抗性的纯合阳性植株，将得到的转基因植株分别进行DNA检测、qRT-PCR检测、蛋白表达与荧光信号检测。
转基因株系与转入空载拟南芥中的SsRS1基因的表达量如图5所示，其中#4与#15与野生型拟南芥相比表达量最高且蛋白条带最明显(图5B,C)，且在荧光显微镜下都具有GFP荧光信号(图5D)，因此选取#4与#15进行后续抗旱表型分析，UBC21基因作为内参，保证cDNA的起始用量一致。
二、SsRS1过表达植株的抗旱表型分析
转基因株系#4与#15和转入空载质粒的拟南芥在1/2MS固体培养基上培养，一周后移苗至土壤中生长，比较抗旱性，结果如图6A所示。
结果表明，与转入空载拟南芥相比，SsRS1基因过表达使转基因株系#4与#15比转空载拟南芥更抗旱，复水后存活率更高(图6B)，说明SsRS1基因能提高植物抗旱性。
三、SsRS1基因过表达对转基因株系离体叶片失水的影响
转基因拟南芥#4与#15和空载拟南芥在土中生长2周后，剪取同样重量的莲座叶，进行离体叶片失水实验，失水速率结果如图6C所示，说明SsRS1基因能提高植物保水性，具有提高植株抗旱能力。
综上所述，本发明通过分析具有较强抗旱特性的甘蔗野生种割手密，鉴定出可响应干旱胁迫的SsRS1基因；克隆并将过表达SsRS1基因转化拟南芥发现，提升该基因的表达可提高植株抗旱能力，从而证明该基因参与植物抗旱性调节，印证其可用于植物抗旱育种应用。
本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种甘蔗棉子糖合成酶SsRS1基因在提高植物抗旱性中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SsRS1基因为割手密SES208的SsRS1基因。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SsRS1基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述SsRS1基因所编码的蛋白序列如SEQID NO.2所示。
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