CN116064343A - 醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种醛酮还原酶‑葡萄糖脱氢酶共表达重组菌及其应用，所述重组菌是将SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶基因和SEQ ID NO：2所示葡萄糖脱氢酶基因共同转入表达载体，构建共表达重组质粒，再将共表达重组质粒转化宿主菌，获得醛酮还原酶‑葡萄糖脱氢酶共表达体重组菌。本发明方法构建的菌株E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet‑PBAD‑(Codon5)BmGDHM4‑KmAKRM13，最大底物投料量可达300g/L，底物转化率大于99％，产物dep值始终保持在99.5％以上。

Description

醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌及其改造，并使用改造后的共表达重组菌不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯催化合成阿托伐他汀钙双手性侧链6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。
(二)背景技术
心血管疾病是当今对人类最具威胁的疾病之一，其发病率和死亡率均已超过肿瘤性疾病而跃居第一。血液低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平上升是诱发心血管疾病的一个重要因素，3-羟基-3-甲基辅酶A(HMG-CoA)还原酶是胆固醇合成的关键限速酶。阿托伐他汀钙能竞争性抑制胆固醇合成的关键限速酶—HMG-CoA还原酶活性，减少胆固醇的合成，控制体内LDL-C浓度，是临床上广泛使用的降血脂药。阿托伐他汀是全合成他汀类药物，具有毒性低、降脂能力强、起效快、安全性高和作用时间长等特点。“立普妥”(辉瑞阿托伐他汀钙的商品名)是第一种在美国年销售额达到100亿美元的药物，是全球最畅销的制药产品。
阿托伐他汀具有(3R,5R)-二羟基己酸酯侧链，两个手性中心是其重要的药效基团，导致合成高纯度的该侧链中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯十分具有挑战性。各国药监部门对手性药物的光学纯度设置了严苛的限制(ee值>99.5％，de值>99％)。以6-氰基-(5R)-3-羟基-5-羰基己酸叔丁酯为底物合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯可分为化学法和生物酶法。传统化学法合成常采用以硼烷等为催化剂、深冷条件下反应，不仅合成条件苛刻、反应能耗大且产物手性纯度低。生物酶法合成有反应条件温和、产物光学纯度高、环境污染低等优点，符合绿色合成的发展要求，具有重大的研究意义。
本实验室前期通过半理性设计、定向进化等手段，筛选获得一株具有良好催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的菌株(已专利申请CN201710282633.X，CN201910072740.9，CN201910932502.0，CN202110136118.7，CN202110900178.1)。利用醛酮还原酶不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯往往需要偶联葡萄糖脱氢酶催化辅酶再生体系。
(三)发明内容
本发明目的是针对醛酮还原酶参与催化反应时需要额外添加葡萄糖脱氢酶构建辅酶再生系统，这无疑增加了生产成本的问题，提供一种活性高、立体选择性好的醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌及其在不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用，通过改变醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因相关的启动子、RBS、基因序列等在表达载体上的基因元件，并通过诱导调控表达系统来调节醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶的表达水平，克服催化剂制备与用量成本问题，实现胞内辅酶高效再生，提高反应效率，应用于生物催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基-己酸叔丁酯。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌，所述重组菌是将SEQID NO：1所示醛酮还原酶基因和SEQ ID NO：2所示葡萄糖脱氢酶基因共同转入表达载体，构建共表达重组质粒，再将共表达重组质粒转化宿主菌，获得醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌。所述醛酮还原酶来自乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis,Genbank:MN206979.1)，葡萄糖脱氢酶来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium,Genbank:LK055286.1)。
优选的，所述共表达重组质粒的构建是将醛酮还原酶基因插入载体NdeI与XhoI酶切位点之间；葡萄糖脱氢酶基因插入载体NcoI与NotI酶切位点之间。
优选的，醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因分别采用T7启动子和阿拉伯糖PBAD启动子表达；所述T7启动子核酸序列为SEQ ID NO：6所示；所述PBAD启动子核酸序列为SEQID NO：7所示。
SEQ ID NO：6
taatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataagaaggagatatacat.
SEQ ID NO：7
ttatgacaacttgacggctacatcatTcactttttcttcacaaccggcacggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcgagaaatagagttgatcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccgggtggtgctcaaaagcagcttcgcctggctgatacgttggtcctcgcgccagcttaagacgctaatccctaactgctggcggaaaagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaaacatgctgtgcgacgctggcgatatcaaaattgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtacccgattatccatcggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgcgccgcagtaacaattgctcaagcagatttatcgccagcagctccgaatagcgcccttccccttgcccggcgttaatgatttgcccaaacaggtcgctgaaatgcggctggtgcgcttcatccgggcgaaagaaccccgtattggcaaatattgacggccagttaagccattcatgccagtaggcgcgcggacgaaagtaaacccactggtgataccattcgcgagcctccggatgacgaccgtagtgatgaatctctcctggcgggaacagcaaaatatcacccggtcggcaaacaaattctcgtccctgatttttcaccaccccctgaccgcgaatggtgagattgagaatataacctttcattcccagcggtcggtcgataaaaaaatcgagataaccgttggcctcaatcggcgttaaacccgccaccagatgggcattaaacgagtatcccggcagcaggggatcattttgcgcttcagccatacttttcatactcccgccattcagagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccatacccgtttttttgggctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacat.
优选的，所述醛酮还原酶基因为SEQ ID NO：5所示醛酮还原酶突变体编码基因，且醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因分别采用T7启动子和阿拉伯糖PBAD启动子表达。
本发明所述的重组质粒可以通过本领域常规方法将本发明的醛酮还原酶基因与葡萄糖脱氢酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可以为本领域常规的各种载体，如pACYCDuet、pCDFDuet、pETDuet、pRSFDuet、pCOLADuet、pGEX、pMAL、pET-28a、pET-28b等，优选pCDFDuet、pETDuet或pRSFDuet，更优选将pCDFDuet中T7启动子替换为PBAD启动子改造后的载体。
优选，所述共表达重组质粒按如下方法构建：将SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶基因KmAKR(记为KmAKRM8)插入质粒pET-28a(+)的多克隆位点NdeI与XhoI酶切位点之间，获得质粒pET-28a(+)-KmAKRM8；以pET-28a(+)-KmAKRM8为模板扩增SEQ ID NO:1所示KmAKR基因插入片段；将SEQ ID NO：2所示葡萄糖脱氢酶基因(记为BmGDHM0)插入质粒pCDFDuet的多克隆位点(MSC1)中NcoI与NotI酶切位点之间，构建重组质粒pCDFDuet-BmGDHM0；以pCDFDuet-BmGDHM0为模板扩增带有同源臂和葡萄糖脱氢酶基因的线性化载体片段；将KmAKR基因插入片段与线性化载体片段通过一步克隆试剂盒进行连接，进而获得含有醛酮还原酶基因与葡萄糖脱氢酶基因的共表达重组质粒。
本发明一方面通过基因突变来增加全细胞催化活性，具体为下列方法中的一种：(1)通过优化葡萄糖脱氢酶基因的核酸序列(不改变氨基酸序列)来调节葡萄糖脱氢酶的表达水平，将SEQ ID NO：2所示葡萄糖脱氢酶基因突变为SEQ ID NO：3所示；(2)在SEQ ID NO：3所示核苷酸序列前端起始密码后的6个氨基酸密码子(Met-Tyr-Lys-Asp-Leu-Glu-Gly)进行优化，优化后葡萄糖脱氢酶基因序列SEQ ID NO：4所示；(3)对SEQ ID NO：1所示的醛酮还原酶基因(记为KmAKRM8)进行定点突变得到SEQ ID NO：5所示的醛酮还原酶基因KmAKRM8-N109K/S196C/S232A/S182H/Q266D(记为KmAKRM13)。
本发明另一方面通过优化葡萄糖脱氢酶和醛酮还原酶的启动子，以及诱导调控表达系统来调节酶的表达水平。所述的启动子可以为本领域常规的各种启动子，如T7启动子、tac启动子、trc启动子、阿拉伯糖启动子和鼠李糖启动子。优选用T7启动子启动醛酮还原酶的基因表达，用阿拉伯糖启动子PBAD启动葡萄糖脱氢酶的基因表达。
优选的，本发明醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因分别采用T7启动子和阿拉伯糖PBAD启动子表达的共表达重组质粒，以SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶基因和SEQ ID NO：4所示葡萄糖脱氢酶突变基因为例，具体按如下方法构建：所述重组质粒pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8为单质粒，所述重组质粒按如下步骤构建：(1)以含SEQ ID NO：4所示葡萄糖脱氢酶基因的pGLO-(codon5)BmGDHM4为模板，通过上游引物：5’-TTATGACAACTTGACGGCTACATCATT-3’，下游引物5’-GAGTTTGTAGAAACGCAAAAAGGC-3’，进行PCR扩增获得具有SEQ ID NO：4所示葡萄糖脱氢酶基因和SEQ ID NO：7所示的PBAD启动子的插入片段PBAD-BmGDHM4；(2)以重组共表达载体pCDFDuet-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8为模板，通过上游引物：5’-TTTTGCGTTTCTACAAACTCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACA-3’，下游引物5’-TAGCCGTCAAGTTGTCATAAATTTCCTAATGCAGGAGTCGC-3’，进行PCR扩增获得含SEQ ID NO：6所示T7启动子且具有同源臂的线性化质粒；(3)将步骤(1)获得的含葡萄糖脱氢酶基因和PBAD启动子的插入片段与步骤(2)获得的含T7启动子且具有同源臂的线性化质粒，通过一步克隆试剂盒进行连接，进而获得含有本发明的醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶分别由T7启动子和PBAD启动子分开诱导表达的重组共表达载体pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8。
本发明所述的宿主菌可为本领域常规的各种宿主微生物，优选E.coli BL21(DE3)。将本发明前述的重组载体通过常规转化方法转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，即可得本发明所述的重组菌。
本发明还提供一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原中的应用，具体所述的应用为：以所述共表达重组菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物，和/或添加NADP+(和/或是指NADP+可以添加，也可以不添加)，以pH6.0-8.5缓冲溶液为反应介质构成转化体系，在25-45℃、400-800rpm进行转化反应，用6M碳酸钾水溶液中和转化反应产生的葡萄糖酸维持pH值，反应结束后，获得含有6-氰基-(3R,5R)-二羟基-己酸叔丁酯的转化液，转化液分离纯化后，获得6-氰基-(3R,5R)-二羟基-己酸叔丁酯。
进一步，所述底物加入终浓度以缓冲液体积计为200g/L-600g/L(优选300g/L)；辅底物葡萄糖初始加入浓度以缓冲液体积计为200g/L-600g/L(优选300g/L)，催化剂用量以湿菌体干重(DCW)计为1g DCW/L-10g DCW/L(优选4.5g DCW/L)；NADP+添加量为0-0.1mM(0代表不添加)，优选0.1mM。
进一步，优选反应介质为100mM、pH 7.0磷酸钾缓冲液；优选在35℃、600-800rpm条件下进行转化反应。
进一步，所述催化剂按如下方法制备：将共表达重组菌接种到含有终浓度50μg/mL链霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度0.5％-3.0％(优选2.0％)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL链霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养2h(OD600＝0.6-0.8)，培养液中加入终浓度为0.05mM-0.30mM(优选0.15mM)异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和终浓度为0.2mM-1mM(优选0.8mM)阿拉伯糖，20℃-30℃(优选28℃)培养8h-16h(优选14h)后，4℃、8000rpm离心10min，获得所述的湿菌体。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明通过构建醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌克服现有方法偶联葡萄糖脱氢酶催化辅酶再生体系的缺陷。本发明通过突变醛酮还原酶和/或葡萄糖脱氢酶的编辑基因、替换葡萄糖脱氢酶的启动子为启动子PBAD的方法，结合调整诱导剂浓度便捷地调节胞内双酶活性，最大程度地提高底物投加浓度和底物转化率，同时提高产物dep值。本发明方法构建的菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM13，最大底物投料量可达300g/L，底物转化率大于99％，产物dep值始终保持在99.5％以上。本发明方法构建的共表达重组菌株能克服催化剂制备与用量成本问题，同时双酶共表达体系有利于全细胞固定化，更具工业化应用前景。
(四)附图说明
图1为醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基-己酸叔丁酯的反应示意图。
图2为醛酮还原酶基因(KmAKRM8)与葡萄糖脱氢酶基因(BmGDHM0)的6种共表达质粒示意图。
图3为6种共表达菌株的蛋白胶图，图中泳道M：蛋白Marker；泳道1：菌株E.coliBL21(DE3)/pET28-(a)-KmAKRM8蛋白；泳道2：菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-(a)-BmGDH M0蛋白；泳道3：菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8蛋白；泳道4：菌株E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-KmAKR M8-BmGDH M0蛋白；泳道5：菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-BmGDHM0-KmAKRM8蛋白；泳道6：菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-KmAKR M8-BmGDHM0蛋白；泳道7：菌株E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8蛋白；泳道8：菌株E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-KmAKRM8-BmGDHM0蛋白；S：可溶性蛋白；P：不可溶性蛋白。
图4为6种共表达菌株全细胞活性分析，图中CGA：菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8；CAG：菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-KmAKRM8-BmGDH M0；EGA：菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-BmGDHM0-KmAKRM8；EAG：菌株E.coli BL21(DE3)/pETDuet-KmAKR M8-BmGDHM0；RGA：菌株E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8；RAG：菌株E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-KmAKRM8-BmGDHM0。
图5为实施例3菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8全细胞催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯反应进程。
图6为葡萄糖脱氢酶基因前端密码子优化的蛋白胶图，泳道M：蛋白Marker；泳道1：菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM4-KmAKRM8蛋白；泳道2-7：菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon1-6)BmGDHM4-KmAKRM8蛋白。
图7为葡萄糖脱氢酶基因前端密码子优化的全细胞活性分析图，CGA-c(1-6)：菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon1-6)BmGDHM4-KmAKRM8，重组菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8全细胞活力最高，可达1123.5U/g DCW。
图8为重组质粒pCDFDuet-PBAD-(codon 5)BmGDHM4-KmAKRM8的构建流程示意图。
图9为重组质粒pCDFDuet-PBAD-(codon 5)BmGDHM4-KmAKRM8的L-阿拉伯糖浓度优化蛋白胶图，泳道M：蛋白Marker；泳道1：0mM L-阿拉伯糖；泳道2：0.05mM L-阿拉伯糖；泳道3：0.1mM L-阿拉伯糖；泳道4：0.2mM L-阿拉伯糖；泳道5：0.4mM L-阿拉伯糖；泳道6：0.8mM L-阿拉伯糖；S：可溶性蛋白；P：不可溶性蛋白。
图10为重组质粒pCDFDuet-PBAD-(codon 5)BmGDHM4-KmAKRM8的L-阿拉伯糖浓度优化全细胞活性分析。
图11为菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM13培养条件对表观比酶活及菌体量的影响；a、接种量；b、IPTG浓度；c、L-阿拉伯糖浓度；d、诱导温度；e、诱导时间。
图12为菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM13全细胞催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯反应进程：35℃，pH 7.0，800rpm，300g/L 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，300g/L葡萄糖。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
LB固体培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水。
实施例1：醛酮还原酶基因(KmAKRM8)与葡萄糖脱氢酶基因(BmGDHM0)克隆及共表达质粒的构建
1、含单一BmGDH基因的重组质粒的构建
(1)pET-28a(+)-BmGDHM0：将SEQ ID NO：2所示葡萄糖脱氢酶基因(GenBank:LK055286.1，记为BmGDHM0)插入质粒pET-28a(+)的多克隆位点/NcoI与XhoI酶切位点之间，构建重组质粒pET-28a(+)-BmGDHM0。
SEQ ID NO：2
atgtacaaggaccttgagggaaaggtcgtcgtcattactggatcttctactggactgggaaagtctatggctattcgattcgctactgagaaggctaaggtcgtcgtgaactaccgatctaaggaggacgaggctaactctgtccttgaggagattaagaaggtcggaggagaggctattgctgtcaagggtgacgtcactgtcgagtctgacgtcattaacctggtccagtctgctattaaggagttcggaaagctggacgtcatgattaacaacgctggacttgagaaccctgtgtcctctcacgagatgtctctgtctgactggaacaaggtcattgacactaacctgactggtgctttcctgggatctcgagaggctattaagtacttcgtcgagaacgacattaagggaactgtcattaacatgtcctctgtccacgagaagattccttggcctctgttcgtccactacgctgcttctaagggtggaatgaagctgatgactaagactctggctcttgagtacgctcctaagggtattcgagtcaacaacattggacctggtgctattaacactcctattaacgctgagaagttcgctgaccctgagcagcgagctgacgtcgagtctatgattcctatgggttacattggagagcctgaggagattgctgctgtcgctgcttggctggcttcttctgaggcttcttacgtcactggaattactctgttcgctgacggtggaatgactctttacccttcgttccaggctggacgagga.
(2)BmGDH基因的重组质粒：
利用表1引物BmGDH-F和BmGDH-R，通过PCR以pET-28a(+)-BmGDHM0为模板扩增SEQID NO：2所示的BmGDH基因插入片段。
利用表1的引物，分别以pCDFDuet-1、pETDuet-1与pRSFDuet-1为模板扩增带有同源臂的6种不同线性化载体片段，PCR反应体系如表2所示。
表1单基因重组所需引物
Figure BDA0003756635550000051
Figure BDA0003756635550000061
表2 PCR扩增反应体系
Figure BDA0003756635550000062
PCR反应程序：95℃预热5min；95℃变性解链30s，54～62℃退火30s，72℃延伸(插入片段BmGDH延伸时间1min，pCDFDuet-1、pRSFDuet-1延伸时间4min，pETDuet-1延伸时间为5min)，共30次循环；72℃终延伸10min，16℃降温终止反应。PCR产物经验证、消化和纯化后，测定浓度。
根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit C115说明书，将上述扩增的BmGDH基因插入片段和不同线性化载体片段连接，构建含单一BmGDH基因的6种重组质粒，分别命名为pCDFDuet-BmGDH(MCS1)、pCDFDuet-BmGDH(MCS2)、pETDuet-BmGDH(MCS1)、pETDuet-BmGDH(MCS2)、pRSFDuet-BmGDH(MCS1)、pRSFDuet-BmGDH(MCS2)，其中MCS1、MCS2是指不同插入位点处打开的线性化质粒，重组质粒通过化学转化E.coli BL21(DE3)，在含有50μg/mL对应抗生素(含pCDFDuet质粒为链霉素抗性、含pETDuet质粒为氨苄抗性、含pRSFDuet质粒为卡那抗性)的LB固体培养基平板上涂布进行过夜培养，抽提质粒，测序比对，成功获得返样质粒pCDFDuet-BmGDH(MCS1)、pCDFDuet-BmGDH(MCS2)、pETDuet-BmGDH(MCS1)、pETDuet-BmGDH(MCS2)、pRSFDuet-BmGDH(MCS1)、pRSFDuet-BmGDH(MCS2)。
2、KmAKR与BmGDH基因共表达质粒的构建
pET-28a(+)-KmAKRM8：将SEQ ID NO:1所示醛酮还原酶基因KmAKR(记为KmAKRM8)插入质粒pET-28a(+)的多克隆位点/NcoI与XhoI酶切位点之间，获得质粒pET-28a(+)-KmAKRM8。
SEQ ID NO：1
atgacaaaccaaaagttctttactttatccaatgggaacaagattccagctgttgctgttgttggtacaggtaccaagtgggcccaccccgaagaaaccgatgctactttctctcaagaattgactgatatcgtaaagctatctttagacactgttccaggaattgttcacattgatgcagccgagatgtacaagacttatccagagttgggtgctgctttgaaggaaacaaagaagcccagggaagagattttcattacagacaagttttcttccttgcacaagatttcggaagatcctaagtctgctttagaaaccgctttgaacaagctaggagttgattatgttgacttatacttgattcattctccatttttcgacaaggacttgaatattgatctagagaccgcttggaagcaattggaagaactatataaatccggaaaggcaaagaacattggtgtctcaaactttactgttgaggatttggagaaagttttggccattgctgaaattaaacctcaagtgaatcaaatcgagttttctccattcttgcaaaaccagaccccaggtatcgtggagtttagccaaaagaacgatattttactagaagcctattctccattaggtcctctccaaaagaagccagctgatgctgaccaacaaccattctatcaatatctgaaggaactttctgaaaagtataacaaaactgaagctcaagttttgttgttgtgggtgtacaagcgcggtatcttgccagttaccacttctgccaagatcgagagaatcaagcaagcccaagacatcttcagctttgatcttactgaagaagaggtaaagaaaattaccgatttgggtttacaacatgaacctgttagattgtggcatgttgatttctacagtaagtacaactccgaagcccaaaaactcgag.
利用表3中引物KmAKR-F和KmAKR-R，通过PCR以pET-28a(+)-KmAKRM8为模板扩增SEQID NO:1所示KmAKR基因插入片段。
采用表3引物，分别以测序比对成功的pCDFDuet-BmGDH(MCS1)、pCDFDuet-BmGDH(MCS2)、pETDuet-BmGDH(MCS1)、pETDuet-BmGDH(MCS2)、pRSFDuet-BmGDH(MCS1)、pRSFDuet-BmGDH(MCS2)返样质粒为模板扩增带有同源臂和BmGDH的6种不同线性化载体片段，PCR反应体系如表2所示。
表3共表达质粒构建所需引物
Figure BDA0003756635550000071
PCR产物经核酸电泳验证、消化、纯化并测定浓度后，根据ClonExpress Ultra OneStep Cloning Kit C115说明书计算线性化载体和插入片段的使用量，进行共表达质粒的重组与转化。经菌落PCR验证与测序分析，构建得到6种不同结构的共表达质粒，分别记为pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8、pCDFDuet-KmAKRM8-BmGDHM0、pETDuet-BmGDHM0-KmAKRM8、pETDuet-KmAKRM8-BmGDHM0、pRSFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8、pRSFDuet-KmAKRM8-BmGDHM0，如图2，即生成含有本发明的醛酮还原酶基因片段与葡萄糖脱氢酶基因片段的重组共表达载体。
3、醛酮还原酶基因与葡萄糖脱氢酶基因的重组共表达菌株
将步骤2构建的重组共表达载体分别转入E.coli BL21(DE3)，分别获得共表达E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8(记为CGA)、E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-KmAKRM8-BmGDH M0(记为CAG)、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-BmGDHM0-KmAKRM8(记为EGA)、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-KmAKR M8-BmGDHM0(记为EAG)、E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8(记为RGA)、E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-KmAKRM8-BmGDHM0(记为RAG)。
同样方法，构建菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-(a)-KmAKRM8、E.coli BL21(DE3)/pET28-(a)-BmGDH M0。
将SEQ ID NO:2所示BmGDHM0替换为SEQ ID NO:3所示BmGDHM4，构建共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM4-KmAKRM8。
将SEQ ID NO:2所示BmGDHM0替换为SEQ ID NO:4所示PBAD-(Codon5)BmGDHM4，构建共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8。
SEQ ID NO：3
atgtacaaggaccttgagggaaaggtcgtcgtcattactggatcttctactggactgggaaagtctatggctattcgattcgctactgagaaggctaaggtcgtcgtgaactaccgatctaaggaggacgaggctaactctgtccttgaggagattaagaaggtcggaggagaggctattgctgtcaagggtgacgtcactgtcgagtctgacattattaacctggtccagtctgctattaaggagttcggaaagctggacgtcatgattaacaacgctggacttgagaaccctgtgccgtctcacgagatgtctctgtctgactggaacaaggtcattgacactaacctgactggtgctttcctgggatctcgagaggctattaagtacttcgtcgagaacgacattcgcggaactgtcattaacatgtcctctgtccacgagaagattccttggcctctgttcgtccactacgctgcttctaagggtggaatgcgcctgatgactaagactctggctcttgagtacgctcctaagggtattcgagtcaacaacattggacctggtgctattaacactcctattaacgctgagaagttcgctgaccctgagcagcgagctgacgtcgagtctatgattcctatgggttacattggagagcctgaggagattgctgctgtcgctgcttggctggcttcttctgaggcttcttacgtcactggaattactctgttcgctgacggtggaatgactctttacccttcgttccaggctggacgagga.
SEQ ID NO：4
atgtataaagatctggaaggcaaggtcgtcgtcattactggatcttctactggactgggaaagtctatggctattcgattcgctactgagaaggctaaggtcgtcgtgaactaccgatctaaggaggacgaggctaactctgtccttgaggagattaagaaggtcggaggagaggctattgctgtcaagggtgacgtcactgtcgagtctgacattattaacctggtccagtctgctattaaggagttcggaaagctggacgtcatgattaacaacgctggacttgagaaccctgtgccgtctcacgagatgtctctgtctgactggaacaaggtcattgacactaacctgactggtgctttcctgggatctcgagaggctattaagtacttcgtcgagaacgacattcgcggaactgtcattaacatgtcctctgtccacgagaagattccttggcctctgttcgtccactacgctgcttctaagggtggaatgcgcctgatgactaagactctggctcttgagtacgctcctaagggtattcgagtcaacaacattggacctggtgctattaacactcctattaacgctgagaagttcgctgaccctgagcagcgagctgacgtcgagtctatgattcctatgggttacattggagagcctgaggagattgctgctgtcgctgcttggctggcttcttctgaggcttcttacgtcactggaattactctgttcgctgacggtggaatgactctttacccttcgttccaggctggacgagga.
实施例2：不同重组共表达菌株中醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的表达
分别将上述实施例1构建的菌株(E.coli BL21(DE3)/pET28-(a)-KmAKRM8、E.coliBL21(DE3)/pET28-(a)-BmGDH M0、E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8、E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-KmAKR M8-BmGDH M0、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-BmGDHM0-KmAKRM8、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-KmAKR M8-BmGDHM0、E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8、E.coli BL21(DE3)/pRSFDuet-KmAKRM8-BmGDHM0)接种至含有50μg/mL相应抗生素(含pCDFDuet质粒为链霉素抗性、含pETDuet质粒为氨苄抗性、含pRSFDuet质粒为卡那抗性)的LB液体培养基试管中，37℃、180rpm培养10h，获得种子液。将种子液以体积浓度1％(v/v)接种量转接至新鲜含50μg/mL相应抗生素的LB液体培养基中，在37℃、180rpm条件下培养至OD600达到0.6-0.8，加入IPTG终浓度为0.1mM，诱导温度为28℃、180rpm诱导培养12h。诱导培养液在4℃、8000rpm离心10min倒去上清液，沉淀用生理盐水洗涤2次，收集湿菌体。
称取0.5g湿菌体，加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM、pH 7.0)，混匀后在200W条件超声破碎20-30min，期间破碎1s间歇2s，破碎混合液即为粗酶液，作为蛋白电泳的初始样品。不同的共表达体系蛋白表达情况示于图3，所构建的6种重组共表达菌株均能表达KmAKR(36kDa)蛋白与BmGDH(28.9kDa)蛋白，都呈现KmAKR蛋白表达量高于BmGDH。
实施例3：不同共表达菌株不对称还原活性分析
(1)酶活定义及检测方法
酶活定义：在标准条件下，每分钟生成1μmol的6-氰基-(3R,5R)-二羟基-己酸叔丁酯所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
全细胞催化酶活定义：每克干细胞所具有的酶活单位数，记为U/g DCW。
酶活：在标准条件下，每分钟生成1μmol的6-氰基-(3R,5R)-二羟基-己酸叔丁酯所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。
相对酶活：对照酶活设为100％，样品相对酶活等于样品酶活/对照酶活×100％。
HPLC检测条件：色谱柱J&K Scientific C18柱(4.6×250mm；中国)，流动相由乙腈与超纯水以体积比25：75(v/v)配制，流速为1.0mL/min，紫外检测波长为210nm，进样量为10μL，柱温为40℃。
(2)全细胞活性分析
称取实施例2方法制备共表达菌株CGA、CAG、EGA、EAG、RGA、RAG的0.15g共表达湿菌体，分别加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM、pH 7.0)重悬细胞，再加入底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、辅底物葡萄糖各0.5g。在35℃恒温水浴、600rpm磁力搅拌条件下反应5分钟后，取100μL反应液加入900μL无水乙醇中稀释、终止反应。反应液12000rpm高速离心4min，取上清用0.22μm有机滤膜过滤，滤液采用高效液相色谱法(HPLC)检测6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、6-氰基-(3R,5R)-二羟基-己酸叔丁酯和6-氰基-(3S,5R)-二羟基-己酸叔丁酯浓度，计算酶活和dep。
如图4所示，共表达菌株CGA(即E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8)活性最高，可达611.00U/g DCW，可作为后续共表达催化体系强化的出发菌株，用于后续研究。
(3)全细胞催化反应进程
采用共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8湿菌体作为催化剂，加入量为6g DCW/L，以50mL磷酸钾缓冲液(100mM、pH 7.0)为反应介质，加入300g/L的葡萄糖，300g/L底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和0.1mM NADP+。35℃水浴保温，800rpm磁力搅拌，反应过程中滴加6M的K2CO3水溶液调控pH值维持在7.0，每隔1h取样，用无水乙醇稀释并终止反应。反应液12000rpm高速离心4min，取上清用0.22μm有机滤膜过滤，滤液使用HPLC检测底物含量。同样条件下，将湿菌体用量改为8g DCW/L，同时不添加NADP+作为对照。
结果如图5，当不额外添加辅酶，E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8菌体浓度为8g DCW/L时，反应可在35℃持续催化14h，完全转化300g/L底物。14h的反应时间，一方面说明了全细胞催化活力较低，另一方面也说明BmGDH和KmAKR具有一定的稳定性。相较于全细胞活性，酶稳定性并不是造成全细胞催化缓慢的主要原因。当额外添加0.1mMNADP+时，只需6g DCW/L的菌体浓度即可在35℃持续催化8h，完全转化300g/L底物，添加辅酶后不仅降低了菌体量的需求，还缩短了反应所需时间。
实施例4：葡萄糖脱氢酶基因前端序列优化
进一步将重组共表达载体pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8中葡萄糖脱氢酶BmGDHM0以核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示的葡萄糖脱氢酶突变体BmGDHM4基因替换，获得重组共表达载体pCDFDuet-BmGDHM4-KmAKRM8。
根据大肠杆菌内相应氨基酸密码子的偏好性，对SEQ ID NO:3所示BmGDHM4基因前端起始密码后的6个氨基酸密码子(Met-Tyr-Lys-Asp-Leu-Glu-Gly-)进行累积优化。以转录速率为优化指标，设计了密码子库(共800个序列)，从中筛选6个优化的氨基酸，具体序列见表4。
表4葡萄糖脱氢酶基因前端密码子序列优化
Figure BDA0003756635550000091
Figure BDA0003756635550000101
以pCDFDuet-BmGDHM4-KmAKRM8质粒为模板，设计引物如表5，进行全质粒PCR、消化原模板、转化E.coli BL21(DE3)、挑菌送测，获得菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon1)BmGDHM4-KmAKRM8(记为CG4A-c1)、
E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon2)BmGDHM4-KmAKRM8(记为CG4A-c2)、
E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon3)BmGDHM4-KmAKRM8(记为CG4A-c3)、
E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon4)BmGDHM4-KmAKRM8(记为CG4A-c4)、
E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8(记为CG4A-c5)、
E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon6)BmGDHM4-KmAKRM8(记为CG4A-c6)。
表5密码子优化所需引物
Figure BDA0003756635550000102
按实施例2方法制备粗酶液，蛋白表达如图6，从起始密码子后第1个氨基酸密码子开始优化至第5个氨基酸，BmGDH的表达量随着氨基酸密码子优化的累积叠加而增加；当累积叠加至第6个氨基酸，BmGDH的表达量出现下降，说明氨基酸序列本身由于密码子偏好性等情况也会对蛋白表达造成影响。
采用实施例3全细胞催化反应体系，其中湿菌体加入量为6g DCW/L，0.1mM NADP+。采用实施例3方法计算相对酶活，全细胞活性分析情况如图7，BmGDH蛋白表达量的变化与全细胞活性变化基本一致，BmGDH前端累积优化5个氨基酸密码子(密码子序列详情可见表4)时，重组菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon5)BmGDHM4-KmAKR M8全细胞活力最好，可达1123.5U/gDCW，其余密码子优化后的菌种均比之小。因此，选择重组菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon5)BmGDHM4-KmAKR M8进行后续的实验，其中(Codon5)BmGDHM4的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例5：双诱导表达系统共表达菌株的构建
设计引物如表6，通过PCR以pGLO-codon 5BmGDHM4质粒为模板，添加pGLO-F/R为引物扩增具有如SEQ ID NO：7所示的PBAD启动子和如SEQ ID NO：4所示的BmGDHM4表达单元作为插入片段PBAD-(codon 5)BmGDHM4。同时以pCDFDuet-codon5BmGDHM4-KmAKRM8质粒为模板，添加CGAcodon 5-F/R为引物扩增含SEQ ID NO：6所示T7启动子和如SEQ ID NO：1所示醛酮还原酶基因的表达单元且具有同源臂的线性化质粒片段。将上述插入片段与线性化质粒片段，通过一步克隆试剂盒进行连接，进而获得含有由T7启动子和PBAD启动子分开诱导表达醛酮还原酶与葡萄糖脱氢酶的重组共表达载体pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8。PCR体系参见表2，PCR产物经验证、消化和纯化后，测定浓度。
表6启动子优化所需引物
Figure BDA0003756635550000111
根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit C115说明书，如图8构建重组质粒pCDFDuet-PBAD-(codon 5)BmGDHM4-KmAKRM8，并转化E.coli BL21(DE3)，获得重组菌E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(codon 5)BmGDHM4-KmAKRM8。
经测序分析验证后的重组共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(codon5)BmGDHM4-KmAKRM8接种至LB液体培养基试管中，37℃培养10h，获得种子液；再将种子液以体积浓度1％的量转接至含50μg/mL硫酸链霉素的LB液体培养基中，37℃扩大培养2h，添加终浓度为0.1mM的IPTG以及不同浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.4和0.8mM)的L-阿拉伯糖，28℃诱导培养12h，8000rpm离心10min，收集菌体。
采用实施例2方法进行蛋白SDS-PAGE电泳分析，蛋白表达情况如图9，随着培养基中L-阿拉伯糖浓度增加，重组菌株中BmGDH的蛋白表达量呈现上升趋势。
采用实施例3方法进行全细胞活性分析，如图10，当L-阿拉伯糖浓度为0.2mM时，重组菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8的活性最高为1192.1U/gDCW。
在pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8质粒上，两种酶BmGDHM4与KmAKRM8分别由PBAD启动子和T7启动子分开诱导表达。该重组菌株的构建，可实现仅需在诱导培养过程中调整两种诱导剂(IPTG、L-阿拉伯糖)的添加量来实现双酶活性比例的调节。这种调节方式相较于不断构建重组质粒进行优化而言更加方便，有助于对双酶活性比例调节的研究。
实施例6：共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM13培养条件优化
1、构建E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM0-KmAKRM13
为了进一步提高醛酮还原酶KmAKR M8比活力，对SEQ ID NO：1所示的醛酮还原酶KmAKRM8基因进行定点突变得到SEQ ID NO：5所示的醛酮还原酶突变体基因KmAKRM8-N109K/S196C/S232A/S182H/Q266D(记为KmAKRM13)，参照实施例1构建E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM0-KmAKRM13(记为CpG4A13-c5)。
SEQ ID NO：5
atgacaaaccaaaagttctttactttatccaatgggaacaagattccagctgttgctgttgttggtacaggtaccaagtgggcccaccccgaagaaaccgatgctactttctctcaagaattgactgatatcgtaaagctatctttagacactgttccaggaattgttcacattgatgcagccgagatgtacaagacttatccagagttgggtgctgctttgaaggaaacaaagaagcccagggaagagattttcattacagacaagttttcttccttgcacaagatttcggaagatcctaagtctgctttagaaaccgctttgaaaaagctaggagttgattatgttgacttatacttgattcattctccatttttcgacaaggacttgaatattgatctagagaccgcttggaagcaattggaagaactatataaatccggaaaggcaaagaacattggtgtctcaaactttactgttgaggatttggagaaagttttggccattgctgaaattaaacctcaagtgaatcaaatcgagtttcacccattcttgcaaaaccagaccccaggtatcgtggagttttgtcaaaagaacgatattttactagaagcctattctccattaggtcctctccaaaagaagccagctgatgctgaccaacaaccattctatcaatatctgaaggaacttgcggaaaagtataacaaaactgaagctcaagttttgttgttgtgggtgtacaagcgcggtatcttgccagttaccacttctgccaagatcgagagaatcaaggacgcccaagacatcttcagctttgatcttactgaagaagaggtaaagaaaattaccgatttgggtttacaacatgaacctgttagattgtggcatgttgatttctacagtaagtacaactccgaagcccaaaaactcgag.
2、测定动力学参数
参照实施例2制备粗酶液，将粗酶液经4℃、8000rpm条件下离心10min，去沉淀，上清液经0.22μm的滤膜过滤后进行纯化，使用镍柱(40×12.6mm，Bio-Rad,USA)纯化酶蛋白，得到纯酶液。
将纯酶液进行动力学参数测定，反应体系为：以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，浓度为0.05-20mM，添加NAPDH的浓度为4.0mM，加入一定量的KmAKR以及突变体纯酶(终浓度0.025mg/mL)，剩余用100mM、pH 7.0磷酸钾缓冲液补齐至500μL，在35℃，pH为7.0的条件下反应3min，加入3μL 6M盐酸终止反应。反应结束后在12000rmp条件下离心3min，经过0.22μm滤膜过滤，最后取滤液进行HPLC分析；以NADPH为底物时，NADPH浓度范围为则为0.1～1mM，6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯浓度为20mM。动力学参数使用软件Origin拟合，得到米氏方程曲线，从而计算得到亲和常数Km，催化常数kcat和催化效率kcat/Km。结果如表7所示。
表7醛酮还原酶的动力学参数
Figure BDA0003756635550000121
3、优化产酶条件
优化E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM13产酶条件，选择表观比酶活和菌体量为考察指标，其中表观比酶活作为首要考察因素，如图11。
1、接种量
将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM13接种至LB液体培养基，37℃培养10h，获得种子液。
将种子液按照不同体积浓度(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％(v/v))转接至100mL含有50μg/mL硫酸链霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养2h，分别加入终浓度0.1mM的IPTG和终浓度0.6mM的L-阿拉伯糖，在28℃，200rpm条件下诱导培养12h，8000rpm离心10min，收集菌体，测定细胞干重和全细胞催化活性。结果见图11中a，其中最适接种量为2％(v/v)。
2、IPTG浓度
将步骤1的接种量定为2％(v/v)，加入IPTG的终浓度分别为0.05mM、0.10mM、0.15mM，0.20mM、0.25mM、0.30mM，其他操作相同，结果见图11中b，其中最适IPTG浓度为0.15mM。
3、L-阿拉伯糖浓度
将步骤1的接种量定为2％(v/v)，IPTG终浓度为0.15mM，加入L-阿拉伯糖使其终浓度分别为0.2mM、0.4mM、0.6mM，0.8mM、1mM，其他操作相同，结果见图11中c，其中最适L-阿拉伯糖浓度为0.8mM。
4、诱导温度
将步骤1的接种量定为2％(v/v)，IPTG终浓度为0.15mM，L-阿拉伯糖终浓度0.8mM，分别于20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃下，200rpm诱导培养12h，其他操作相同，结果见图11中d，其中最适诱导温度为28℃。
5、诱导时间
将步骤1的接种量定为2％(v/v)，IPTG终浓度为0.15mM，L-阿拉伯糖终浓度0.8mM，在28℃，200rpm条件下分别诱导培养8h、10h、12h、14h、16h，其他操作相同，结果见图11中e，其中最适诱导时间为14h。
实施例7：共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM13全细胞催化反应进程
1、湿菌体催化剂
将E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM13接种至LB液体培养基，37℃培养10h，获得种子液。
将种子液按照体积浓度2.0％(v/v)的量转接至100mL含有50μg/mL硫酸链霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养2h，分别加入终浓度0.15mM的IPTG和终浓度0.8mM的L-阿拉伯糖，在28℃，200rpm条件下诱导培养14h，8000rpm离心10min，收集湿菌体。
2、催化反应
反应体系为：50mL磷酸钾缓冲液(100mM、pH 7.0)，葡萄糖加入浓度为300g/L，湿菌体加入量为4.5g DCW/L，6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯加入浓度300g/L，在35℃水浴保温，800rpm磁力搅拌，反应过程中滴加6M的K2CO3水溶液调控pH值维持在7.0，每隔1h取样，无水乙醇稀释并终止反应。反应液12000rpm高速离心4min，取上清用0.22μm有机滤膜过滤，滤液采用实施例2方法进行HPLC检测。同样条件下，将湿菌体加入量改为3g DCW/L，同时添加0.1mM的NADP+。
结果如图12所示。300g/L底物，以4.5g DCW/L菌体浓度可在10h内完全转化。当额外添加0.1mM NADP+时，菌体浓度可减少至3g DCW/L，底物上样量/催化剂用量(S/C)相比共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8提高了1倍。
实施例8：不同优化结构的共表达菌株催化活性分析
分别测定共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8、E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM4-KmAKRM8、E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8、E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM8和E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM13的全细胞活性和胞内葡萄糖脱氢酶、醛酮还原酶活性，如表8所示。
按实施例7方法分别制备湿菌体，取湿菌体分别以8g DCW/L的量加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM、pH 7.0)中重悬细胞，再加入300g/L底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和300g/L辅底物葡萄糖。在35℃恒温水浴、600rpm磁力搅拌条件下反应5分钟后，取100μL反应液加入900μL无水乙醇中，稀释、终止反应。反应液12000rpm高速离心4min，取上清用0.22μm有机滤膜过滤，滤液使用实施例3所述HPLC进行检测。同样条件下，将湿菌体用量改为3gDCW/L，并添加0.1mM NADP+。
初始共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-BmGDHM0-KmAKRM8的全细胞催化为611.00U/g DCW，胞内葡萄糖脱氢酶活性为1619.7U/g DCW，胞内醛酮还原酶活性为686.3U/g DCW。当菌体浓度为8g DCW/L时，完全转化300g/L底物需要14h(反应温度35℃)；当额外添加0.1mM NADP+时，3g DCW/L的菌体作为催化剂，完全转化300g/L底物需要26h。经改造后，最终共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-PBAD-(Codon5)BmGDHM4-KmAKRM13催化300g/L的(5R)-1底物，菌体浓度可减少至4.5g DCW/L，10h(反应温度35℃)内完全转化；当额外添加0.1mM NADP+时，菌体浓度可减少至3g DCW/L，底物上样量/催化剂用量(S/C)提高了1倍。
表8共表达菌株酶活性分析
Figure BDA0003756635550000141

Claims (10)

1.一种醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌，其特征在于，所述重组菌是将SEQ IDNO：1所示醛酮还原酶基因和SEQ ID NO：2所示葡萄糖脱氢酶基因共同转入表达载体，构建共表达重组质粒，再将共表达重组质粒转化宿主菌，获得醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌。
2.如权利要求1所述共表达重组菌，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶基因为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的葡萄糖脱氢酶突变体基因。
3.如权利要求1所述共表达重组菌，其特征在于，醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因分别采用T7启动子和阿拉伯糖PBAD启动子表达；所述T7启动子核酸序列为SEQ ID NO：6所示；所述PBAD启动子核酸序列为SEQ ID NO：7所示。
4.如权利要求3所述共表达重组菌，其特征在于，所述醛酮还原酶基因为SEQ ID NO：5所示的醛酮还原酶突变体编码基因。
5.如权利要求1所述共表达重组菌，其特征在于，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)。
6.一种权利要求1醛酮还原酶-葡萄糖脱氢酶共表达重组菌在催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以所述共表达重组菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以葡萄糖为辅底物，和/或添加NADP+，以pH6.0-8.5缓冲溶液为反应介质构成转化体系，在25-45℃、400-800rpm进行转化反应，用6M碳酸钾水溶液维持pH值，反应结束后，获得含有6-氰基-(3R,5R)-二羟基-己酸叔丁酯的转化液，转化液分离纯化后，获得6-氰基-(3R,5R)-二羟基-己酸叔丁酯。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述底物加入终浓度以缓冲液体积计为200g/L-600g/L；辅底物葡萄糖初始加入浓度以缓冲液体积计为200g/L-600g/L，催化剂用量以湿菌体干重计为1g DCW/L-10g DCW/L；NADP+添加量为0-0.1mM。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化剂按如下方法制备：将共表达重组菌接种到含有终浓度50μg/mL链霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养10h，获得种子液；将种子液以体积浓度0.5％-3.0％的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL链霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm培养至OD600＝0.6-0.8，培养液中加入终浓度为0.05mM-0.30mM异丙基硫代半乳糖苷和终浓度为0.2mM-1mM阿拉伯糖，20℃-30℃培养8h-16h后，4℃、8000rpm离心10min，获得所述的湿菌体。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，异丙基硫代半乳糖苷终浓度0.15mM，阿拉伯糖终浓度0.8mM。
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