CN116042600A - 核酸提取试剂、试剂盒及其应用，以及核酸提取方法 - Google Patents

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CN116042600A CN202211012812.9A CN202211012812A CN116042600A CN 116042600 A CN116042600 A CN 116042600A CN 202211012812 A CN202211012812 A CN 202211012812A CN 116042600 A CN116042600 A CN 116042600A
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杨启文
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宋翠丹
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及核酸提取试剂、试剂盒及其应用，以及核酸提取方法。本发明提供了核酸提取试剂，包括：抗凝剂、CSB、LMP、红细胞裂解液、白细胞裂解液、溶菌酶、蛋白酶K、RNase、溶胶酶和透析缓冲液。本发明提供了一种针对血流感染病原菌的长短片段共提取试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒的效果可以达到：短至100bp左右的cfDNA，直到长至大于2Mb的病原菌gDNA在同一提取管中共同提取，实现了长度跨度极大的长短片段共同提取，比现有只能分相提取的方案节省一半的时间及样本量，且因操作简便而可减少污染的可能。

Description

核酸提取试剂、试剂盒及其应用，以及核酸提取方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及核酸提取试剂、试剂盒及其应用，以及核酸提取方法。
背景技术
感染是威胁人类健康的重要因素之一，可产生产生不同的临床症状甚至危及生命。病原微生物鉴定是感染类疾病的诊断治疗中不可缺少的重要环节。由于传统金标准-病原微生物培养的耗时长，鉴定困难等弊端，宏基因组高通量测序技术自2014年首例用于诊断中枢神经系统钩体病患者以来逐步用于临床。血液标本是该技术的重要应用领域，为解决临床疑难感染患者的诊断难题提供了有效的解决方案。目前血液样本的NGS检测与组织、痰液等不同，其主要是检测血浆中，长度约为200bp的游离核酸，即cfDNA。然而白细胞的吞噬并不能破坏掉结核杆菌、伤寒杆菌、产单核李斯特菌等细胞壁比较坚韧的细菌，因而这些菌会在白细胞内生长繁殖形成胞内菌，并随之扩散到其他部位。因此必须充分全面地提取血浆和血细胞中全部病原菌的DNA才有助于全面的诊断疾病。
与此同时，生物微环境的改变、全球抗生素滥用等原因，导致了在临床环境中，耐药菌的出现愈发频繁，每年仅美国就有200万人感染耐药细菌，与敏感细菌引起的感染相比，耐药细菌感染缺乏可用的治疗方案，并极大地增加了发病率和死亡率。对人类、动物和环境样本的大规模比较研究、从而了解抗微生物药物耐药性基因的全球分布和耐多药细菌的传播显得尤为重要。测序技术的兴盛极大地补充了原有传统的基于培养的临床和监测方法，并为可培养或不可培养细菌的快速、灵敏的耐药测定提供了机会。但是目前主流的二代平台的短读长测序技术使得组装耐药基因这项工作需要消耗大量的计算资源，而且很难跨越重复区域或者复杂区域，容易造成基因片段组装的错误，误判基因坐在位置。新的测序技术，例如长读长测序技术就可以使长达几千bp甚至几万bp的序列直接读取，在研究纯培养细菌和宏基因组学样本中的抗菌素耐药性方面有很多优势。长度长测序可大大降低纯培养细菌和宏基因组学样本序列组装的复杂性，甚至可提供完整的细菌基因组。而这往往需要短、长测序片段的结合，方可有更加深入的解释。
综上所述，血流感染诊断，需要综合血浆及血细胞，集鉴定和耐药等多重维度进行综合诊疗。而从复杂多样的生物样本中迅速有效地分离和提取所需要的基因组核酸，作为遗传信息的携带者，无论是进行核酸结构还是功能研究都显得尤为重要。目前三代测序平台的兴旺发展使的部分平台(例如ONT)已经可以同时测序20bp～2Mbp长度的reads，同时满足对病原游离核酸的鉴定及耐药基因全长认知，甚至可以更完整获得新病原基因组的、达到人类遗传病与宏基因组的共检测目的。那么一种针对全血的，新型的提取方案，将短至200bp的cfDNA，乃至长达2M级别的核酸一网打尽的提取方案，就显得尤为重要。
然而现在已知的技术方法中，针对血流感染样本没有一套综合的解决方案可以一网打尽跨度高达4个数量级的核酸。针对该类样本一般方法使用机械破壁法破坏细菌细胞壁，随后用酚氯仿等方法进行提取核酸提取，核酸片段在几百bp～40kbp不等。并最终使用磁珠纯化或者过吸附柱的方案进行杂质去除。由于经历的机械剪切过程较多，该类方法提取的核酸的完整度在23kb～40kb左右。提取流程中酚氯仿的引入也非常容易导致纯度不达标，无论是长度还是纯度均无法更好地满足上述基于长片段测序平台的血流感染的诊断需求。
因此，寻找一种纯度高、核酸片段长度跨度较高的核酸提取方法至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了核酸提取试剂、试剂盒及其应用，以及核酸提取方法。本发明提供了一种针对血流感染病原菌的长短片段共提取试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒的效果可以达到：短至100bp左右的cfDNA，直到长至高于2Mb的病原菌gDNA在同一提取管中共同提取，实现了长度跨度极大的长短片段共同提取，比现有只能分相提取的方案节省一半的时间及样本量，且因操作简便而可减少污染的可能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了核酸提取试剂，包括：抗凝剂、CSB、LMP、红细胞裂解液、白细胞裂解液、溶菌酶、蛋白酶K、RNase、溶胶酶和透析缓冲液。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶以溶菌酶溶液的形式添加，所述溶菌酶溶液包括：溶菌酶、溶葡球菌酶和Tris-HCl缓冲液。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶的酶活≥400000U/mL，所述溶葡球菌酶的酶活≥500U/mg。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.2。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶溶液中所述溶剂酶的体积为100～200μL；所述溶葡球菌酶的体积为50～150μL；所述Tris-HCl缓冲液的体积为10mL。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶溶液中所述溶剂酶的体积为100μL；所述溶葡球菌酶的体积为50μL；所述Tris-HCl缓冲液的体积为10mL。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶溶液中所述溶剂酶的体积为150μL；所述溶葡球菌酶的体积为100μL；所述Tris-HCl缓冲液的体积为10mL。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶菌酶溶液中所述溶剂酶的体积为200μL；所述溶葡球菌酶的体积为150μL；所述Tris-HCl缓冲液的体积为10mL。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述透析缓冲液包括：KCl、EDTA、Tris-HCl、CaCl2、MgCl2、四盐酸精胺和三盐酸精胺。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述透析缓冲液中所述KCl的终浓度为10mM；所述EDTA的终浓度为5mM；所述Tris-HCl的终浓度为10mM；所述CaCl2的终浓度为1mM；所述MgCl2的终浓度位0.5mM。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述四盐酸精胺或所述三盐酸精胺的的终浓度为1～4mM。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述四盐酸精胺的终浓度为1mM；所述三盐酸精胺的终浓度为1mM。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述四盐酸精胺的终浓度为2mM；所述三盐酸精胺的终浓度为2mM。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述四盐酸精胺的终浓度为4mM；所述三盐酸精胺的终浓度为4mM。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述抗凝剂包括EDTA，所述EDTA的终浓度为0.1M，体积为10μL。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述CSB体积为0.3mL；所述CSB包括：100mMTris-HCl和100mMEDTA。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述LMP的质量为10mg。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中，所述白细胞裂解液的体积为800μL。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述蛋白酶K以蛋白酶K溶液的形式添加，所述蛋白酶K溶液包括：蛋白酶K和pH为8.0的TE缓冲液；所述TE缓冲液包括：10mMTris-HCl和1mMEDTA。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述RNase以RNase溶液的形式添加，所述RNase溶液包括：RNA酶和pH为8.0的TE缓冲液；所述TE缓冲液包括：10mMTris-HCl和1mMEDTA。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中所述溶胶酶的体积为4μL。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中还包括pH为8.0的TE缓冲液。
在本发明的一些实施方案中，上述核酸提取试剂中还包括PBS缓冲液或pH为8.0的WashBuffer；所述WashBuffer包括：10mMTris-HCl和15mM EDTA。
本发明还提供了核酸提取试剂盒，包括上述的核酸提取试剂以及其他可接受的助剂或载体。
本发明还提供了核酸的提取方法，以上述核酸提取试剂或上述核酸提取试剂盒与待测样本混合。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法中所述混合包括:
S1：取所述待测样本与所述抗凝剂混合，第一离心，获得血浆和血细胞；
S2：取所述血细胞与所述红细胞裂解液混合，第二离心，收集沉淀，与所述白细胞裂解液混合，第三离心，收集沉淀，获得所述细胞液；
S3：取所述血浆、所述CSB、所述细胞液和所述LMP混合，凝固后，与所述溶菌酶溶液混合后，再与所述蛋白酶K混合，获得凝胶块；
S4：取所述凝胶块与TE缓冲液混合后，与所述RNase混合，再与所述溶胶酶混合，第四离心后，获得DNA混合液；
S5：取所述DNA混合液与所述透析缓冲液混合，透析后，获得核酸分子。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S1中所述第一离心的转速为1000g，时间为5min。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S2中所述血细胞与所述红细胞裂解液的体积比为1:4。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S2中所述第二离心的转速为3000rpm，时间为5min。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S2中所述第三离心的转速为12000rpm，时间为5min。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S3中所述血浆、所述CSB、所述细胞液和所述LMP混合的温度为43℃。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S3中所述与所述溶菌酶缓冲液混合的温度为37℃，时间为1h。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S3中所述再与所述蛋白酶K混合的温度为50℃，时间为2h。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S3中所述再与所述蛋白酶K混合后，所述获得凝胶块前还包括清洗的步骤；所述清洗采用pH为8.0的WashBuffer；所述WashBuffer包括：10mMTris-HCl和15mMEDTA。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S4中所述取所述凝胶块与TE缓冲液混合的时间为15min，温度为20～25℃。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S4中所述与所述RNase混合的时间为10min，温度为20～25℃。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S4中所述再与所述溶胶酶混合的时间为45min，温度为43℃。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S4中所述第四离心的时间为1s，转速为5000rpm。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S5中所述透析的时间为10～50min。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S5中所述透析的时间为10min。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S5中所述透析的时间为35min。
在本发明的一些实施方案中，上述提取方法S5中所述透析的时间为50min。
本发明还提供了上述核酸提取试剂或上述核酸提取试剂盒在核酸提取中的应用。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述核酸的片段长度跨度至少4个数量级。
在本发明的一些实施方案中，上述应用中所述核酸包括长片段和短片段；所述长片段不小于1Mb；所述短片段包括游离核酸。
本发明提供了核酸提取试剂，包括：抗凝剂、CSB、LMP、红细胞裂解液、白细胞裂解液、溶菌酶、蛋白酶K、RNase、溶胶酶和透析缓冲液。
本发明的有益效果包括：
(1)本发明提供了一种针对血流感染病原菌的长短片段共提取试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒的效果可以达到：短至100bp左右的cfDNA，直到长度高于2Mb的病原菌gDNA在同一提取管中共同提取，实现了长度跨度极大的长短片段共同提取，比现有只能分相提取的方案节省一半的时间及样本量，且因操作简便而可减少污染的可能
(2)本发明提供了一种提取试剂或试剂盒，可解决低至200μL全血中，各种长度的DNA的提取，用菌体包埋法进行提取，同时用溶菌酶混合液浸泡法及透析法代替了了传统的机械破壁及磁珠纯化过程，最大程度可同时获得革兰氏阳性菌/阴性菌，且极大提升了提取核酸长度，并做到长(Mb级别核酸)、短(游离核酸)同管共提，且获得了高纯净度核酸，以适应随后的建库测序方案，更好地服务于血流感染中的病原鉴定、耐药基因全长获得、新病原识别等功能。
(3)本发明提供了一种提取试剂或试剂盒，针对血流感染的血液样本，进行长度跨度4个数量级的片段，同管共提，且长片段完整度达到1M以上，覆盖菌类型齐全且纯度达标，可以满足基于上片段测序平台的血流感染的诊断需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1大片段电泳图；其中左图示marker条带，从上到下依次为：1.6M及2.2M混合带；1.1M带；1.0M及0.9M混合带；右图示电泳图，从左至右依次为marker、第一次重复；
图2示实施例1大片段电泳图；其中左图示电泳图，从左至右依次为第二次重复、第三次重复、marker；右图示marker条带，从上到下依次为：1.6M及2.2M混合带；1.1M带；1.0M及0.9M混合带；
图3示实施例2及重复的大片段电泳图；其中左图示marker条带，从上到下依次为：1.6M及2.2M混合带；1.1M带；1.0M及0.9M混合带；右图示电泳图，从左至右依次为marker、第一次重复、第二次重复、第三次重复、marker；
图4示实施例3大片段电泳图；其中左图示marker条带，从上到下依次为：1.6M及2.2M混合带；1.1M带；1.0M及0.9M混合带；右图示电泳图，从左至右依次为marker、第一次重复、marker、第二次重复；
图5示实施例3大片段段电泳图；其中左图示电泳图，从左至右依次为第三次重复、marker；右图示marker条带，从上到下依次为：1.6M及2.2M混合带；1.1M带；1.0M及0.9M混合带；
图6示对比例1及重复大片段电泳图；其中左图示marker条带，从上到下依次为：1.6M及2.2M混合带；1.1M带；1.0M及0.9M混合带；右图示电泳图，从左至右依次为marker的条带及第一次重复、第二次重复、第三次重复；
图7示对比例2及重复大片段电泳图；其中A图示marker条带，从上到下依次为：1.6M及2.2M混合带；1.1M带；1.0M及0.9M混合带；B图示电泳图，从左至右依次为marker、第一次重复、marker、第二次重复；C图示电泳图，从左至右依次为第三次重复、marker；
图8示对比例3及重复大片段电泳图；其中左图示marker条带，从上到下依次为：23K、9.4K、6.5K、4.3K；左图示电泳图，从左至右依次为marker、第一次重复、第二次重复、marker、第三次重复；
图9示实施例1及重复cfDNA小片段；
图10示实施例1及重复cfDNA小片段；
图11示实施例1及重复cfDNA小片段；
图12示实施例2及重复cfDNA小片段；
图13示实施例2及重复cfDNA小片段；
图14示实施例2及重复cfDNA小片段；
图15示实施例3及重复cfDNA小片段；
图16示实施例3及重复cfDNA小片段；
图17示实施例3及重复cfDNA小片段；
图18示对比例1及重复cfDNA小片段；
图19示对比例1及重复cfDNA小片段；
图20示对比例1及重复cfDNA小片段；
图21示对比例2及重复cfDNA小片段；
图22示对比例2及重复cfDNA小片段；
图23示对比例2及重复cfDNA小片段；
图24示对比例3及重复cfDNA小片段；
图25示对比例3及重复cfDNA小片段；
图26示对比例3及重复cfDNA小片段。
具体实施方式
本发明公开了核酸提取试剂、试剂盒及其应用，以及核酸提取方法。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明提供的技术方案包括如下步骤：
(1)血液样本的收集(200μL)，加入10μL浓度为0.1M的EDTA作为抗凝剂；1000g5min离心将血浆和血细胞分开；
(2)吸出上层血浆于100μLEP管中，放置在43℃中待用备用；
(3)0.3mLCSB(100mMTris-HCl150μL+100mMEDTA150μL,pH8.0)+10mgLMP(Gibco15517-022)，放入有开水的水浴锅，完全溶解后放置在43℃中待用；
(4)在下层血细胞沉淀先中加入红细胞裂解液(solarbio,R1010)，比例为血细胞：裂解液＝1:4，混匀至红细胞完全裂解后，3000rpm离心5min,，取白色沉淀；
(5)在上述白色沉淀中加入800μL白细胞裂解液(泽叶生物，ZY130989)，轻柔吹吸20次后，12000rpm离心5min；
(6)用1mLPBS重悬，3000rpm离心1min，弃上清，重复一次，用枪头吸干所有培养基；
(7)用50μL2℃至4℃的CBS重悬细菌沉淀，放置在43℃金属浴中；
(8)用步骤(2)吸出的血浆加入到步骤(3)的凝胶块中，43℃缓慢搅拌直到完全融合；
(9)将步骤(8)获得的凝胶块与步骤(7)获得的细菌沉淀在43℃缓慢搅拌，直到完全融合，注意混匀的时候不能有气泡；
(10)将EP管放入4℃冰箱30min直到胶块彻底凝固；
(11)在15mL离心管中制备溶菌酶缓冲液：Lysozyme(Sigma-Aldrich,L3790),100～200μL(优选为150μL)+lysostaphin(Sigma-Aldrich,L7386),50～150μL(优选为100μL),+10mLTRIS-HCL,PH7.2)；
(12)将步骤(10)获得的胶块用钝边的勺子或者铲子捞出，放入步骤(11)制备的溶菌酶缓冲液中，放入37℃水浴1h，每12秒震荡一次，450rpm；
(13)将步骤(11)获得的溶菌酶混合液倒出，将步骤(10)所制胶块放置在管底；
(14)加入分子生物级纯度的水，并且立刻倒出；
(15)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(16)制备蛋白酶K混合液：400μL蛋白酶K(Invitrogen；AM2548；20mg/mL)投入到1200μLTE缓冲液(终浓度为10mMTris-HCl；1mMEDTA；PH＝8.0)中；确保胶块浸没在蛋白酶K混合液中，放入50℃水浴2h，十分钟震荡一次，450rpm；
(17)准备30mLWashBuffer(终浓度为10mMTris-HCl；15mMEDTA；PH＝8.0)20℃～25℃放置；
(18)倒掉步骤(16)中的蛋白酶k混合液，保证胶块仍然在底部；
(19)加入10mLWashBuffer，20℃～25℃下在水平摇床上350rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(20)倒掉最后一遍步骤(19)的WashBuffer溶液，并且保证胶块在管底；
(21)每个胶块准备30mLTE缓冲液(PH＝8)，加入10mLTE缓冲液，20℃～25℃下在水平摇床上200rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(22)倒掉步骤(21)的TE溶液，并且保证胶块在管底；
(23)每块胶块准备7.8mLRNase溶液，包含200μL的RNA酶(Ther moScientific；2mg/mL；EN0531；)+7.6mLTE缓冲液中(10mMTris-HCl；1mM EDTA；PH＝8.0)；
(24)加入2.6mLRNase溶液，20℃～25℃下在水平摇床上180rpm转速轻柔转动10分钟，重复此步骤两遍；
(25)倒掉步骤(24)最后一遍的RNase溶液，并且保证胶块在管底；
(26)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(27)用钝边的勺子或者铲子捞出胶块，用洁净的kimwipe吸干水分至胶块半干将胶块放入到1.7mL离心管中；
(28)将离心管放到70℃的金属浴中2min，使胶块完全溶解；
(29)将离心管放入43℃金属浴(或者水浴锅)中5min；
(30)每个管中加入4μL溶胶酶(GELaseTMAgaroseGel-DigestingPrep200U；0.2U/μL)，用枪头混匀10s；
(31)将混合液放入43℃金属浴(或者水浴锅)中45min；
(32)5000rpm离心1s，立即将混合液放入到4℃冰箱；
(33)准备培养皿，加入15mL透析缓冲液(终浓度为10mMKCl；5mM EDTA；10mMTris-HCl；1mMCaCl2；0.5mMMgCl2；1mM～4mMSpermine-4HCl优选为2mM；1mM～4mMSpermidine-3HCl优选为2mM)；
(34)用镊子将0.47μm的透析膜(Advantec；342001)飘在培养皿上，盖上盖子使膜彻底浸湿10min；
(35)用宽口的枪头吸取步骤(32)制备的DNA混合液混匀，滴在膜的中心；
(36)盖上培养皿的盖子，20℃～25℃放置10～50min(优选为35min)，用宽口枪头将样品吸到新的离心管中。
本发明的样本来源：两份综合血流感染感染血液混合共约5mL，临床培养结果为：
本发明中，实施例、对比例1、对比例2及其重复涉及的超长片段电泳marker使用伯乐bio-radchefdna(#170-3605)及脉冲场电泳进行检测，其首条带长度为2.2MB；电泳条件是90V,100mA；180度垂直电泳每30s反转18～24h电泳时间；对比例3的基因组电泳使用marker为Thrmoλ/HindIIIDNAMarker(#SM0101)其首条带长度为23K；而cfDNA由于片段过小，使用QSEP/4200而非电泳进行检测。
本发明中，QPCR验证所用引物及探针如下表所示：
本发明图1～图8中由于提取条带过长，电泳时间过长，部分脉冲场marker逸出胶体属于正常现象。
本发明实施例及对比例中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本实施例技术重复3次。
(1)样本的收集(200μL)，加入10μL浓度为0.1M的EDTA作为抗凝剂；1000g5min离心将血浆和血细胞分开；
(2)吸出步骤(1)获得的上层血浆于100μLEP管中，放置在43℃中待用；
(3)0.3mLCSB(100mMTris-HCl150μL、100mMEDTA150μL,pH8.0)和10mgLMP(Gibco15517-022)，放入有开水的水浴锅，完全溶解后放置在43℃中待用，获得胶块；
(4)在步骤(1)获得的下层血细胞中加入红细胞裂解液(solarbio,R1010)，比例为血细胞：裂解液＝1:4，混匀至血细胞完全裂解后，3000rpm离心5min，取白色沉淀；
(5)在步骤(4)获得的白色沉淀中加入800μL白细胞裂解液(泽叶生物，ZY130989)，轻柔吹吸20次后，12000rpm离心5min；
(6)用1mLPBS重悬，3000rpm离心1min，弃上清，重复一次，用枪头吸干所有培养基；
(7)用50μL2℃至4℃的CBS重悬细菌沉淀，放置在43℃金属浴中，获得细胞液；
(8)用步骤(2)吸出的血浆加入到步骤(3)获得的胶块中，43℃缓慢搅拌直到完全融合；
(9)将步骤(8)获得的胶块与步骤(7)获得的细胞液在43℃缓慢搅拌，直到完全融合，注意混匀的时候不能有气泡；
(10)将EP管放入4℃冰箱30min直到胶块彻底凝固；
(11)在15mL离心管中制备溶菌酶溶液：100μLLysozyme(Sigma-Al drich,L3790)、50μLlysostaphin(Sigma-Aldrich,L7386)和10mLTris-HCl(PH7.2)；
(12)将步骤(10)获得的胶块用钝边的勺子或者铲子捞出，放入步骤(11)制备的溶菌酶溶液中，放入37℃水浴1h，每12秒震荡一次，450rpm；
(13)将步骤(12)中的溶菌酶溶液倒出，将胶块放置在管底；
(14)加入分子生物级纯度的水，并且立刻倒出；
(15)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(16)制备蛋白酶K混合液：400μL蛋白酶K(Invitrogen,AM2548,20mg/mL)投入到1200μLTE缓冲液(终浓度为10mMTris-HCl,1mMEDTA,PH＝8.0)中；确保胶块浸没在蛋白酶K混合液中，放入50℃水浴2h，十分钟震荡一次，450rpm；
(17)准备30mLWashBuffer(终浓度为10mMTris-HCl；15mMEDTA；PH＝8.0)20℃～25℃放置；
(18)将步骤(16)中蛋白酶K混合液倒掉，保证胶块仍然在底部；
(19)加入10mL步骤(17)获得的WashBuffer，20℃～25℃下在水平摇床上350rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(20)倒掉最后一遍步骤(19)的WashBuffer溶液，并且保证胶块在管底，获得凝胶块；
(21)每个凝胶块准备30mLTE缓冲液(PH＝8)，加入10mLTE缓冲液，20℃～25℃下在水平摇床上200rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(22)倒掉步骤(21)的TE缓冲液，并且保证凝胶块在管底；
(23)每块凝胶块准备7.8mLRNase溶液，包含200μL的RNA酶(Thermo Scientific；2mg/mL；EN0531)和7.6mLTE缓冲液中(10mMTris-HCl；1mM EDTA；PH＝8.0)；
(24)加入2.6mLRNase溶液，20℃～25℃下在水平摇床上180rpm转速轻柔转动10分钟，重复此步骤两遍；
(25)倒掉步骤(24)中最后一遍的RNase溶液，并且保证凝胶块在管底；
(26)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(27)用钝边的勺子或者铲子捞出凝胶块，用洁净的kimwipe吸干水分至胶块半干将凝胶块放入到1.7mL离心管中；
(28)将离心管放到70℃的金属浴(天根，OSE-DB-01/OSE-DB-02)中2min，使凝胶块完全溶解；
(29)将离心管放入43℃金属浴中5min；
(30)每个管中加入4μL溶胶酶(GELaseTMAgaroseGel-DigestingPrep200U；0.2U/μL)，用枪头混匀10s；
(31)将步骤(30)获得的混合液放入43℃金属浴中45min；
(32)5000rpm离心1s，立即将混合液放入到4℃冰箱，获得DNA混合液；
(33)准备培养皿，加入15mL透析缓冲液(终浓度为10mMKCl；5mM EDTA；10mMTris-HCl；1mMCaCl2；0.5mMMgCl2；1mMSpermine-4HCl；1mMSpermidine-3HCl)；
(34)用镊子将0.47μm的透析膜(Advantec；342001)飘在培养皿上，盖上盖子使膜彻底浸湿10min；
(35)用宽口的枪头吸取步骤(32)制备的DNA混合液混匀，滴在膜的中心；
(36)盖上培养皿的盖子，20℃～25℃放置10min，用宽口枪头将样品吸到新的离心管中。
实施例2
本实施例技术重复3次。
(1)样本的收集(200μL)，加入10μL浓度为0.1M的EDTA作为抗凝剂；1000g5min离心将血浆和血细胞分开；
(2)吸出步骤(1)获得的上层血浆于100μLEP管中，放置在43℃中待用；
(3)0.3mLCSB(100mMTris-HCl150μL和100mMEDTA150μL,pH8.0)和10mgLMP(Gibco15517-022)，放入有开水的水浴锅，完全溶解后放置在43℃中待用，获得胶块；
(4)在步骤(1)获得的下层血细胞中加入红细胞裂解液(solarbio,R1010)，比例为血细胞：裂解液＝1:4，混匀至血细胞完全裂解后，3000rpm离心5min，取白色沉淀；
(5)在步骤(4)获得的白色沉淀中加入800μL白细胞裂解液(泽叶生物，ZY130989)，轻柔吹吸20次后，12000rpm离心5min；
(6)用1mLPBS重悬，3000rpm离心1min，弃上清，重复一次，用枪头吸干所有培养基；
(7)用50μL2℃至4℃的CBS重悬细菌沉淀，放置在43℃金属浴中，获得细胞液；
(8)用步骤(2)吸出的血浆加入到步骤(3)获得的胶块中，43℃缓慢搅拌直到完全融合；
(9)将步骤(8)获得的胶块与步骤(7)获得的细胞液在43℃缓慢搅拌，直到完全融合，注意混匀的时候不能有气泡；
(10)将EP管放入4℃冰箱30min直到胶块彻底凝固；
(11)在15mL离心管中制备溶菌酶溶液：150μLLysozyme(Sigma-Al drich,L3790)、100μLlysostaphin(Sigma-Aldrich,L7386)和10mLTris-HCl(PH7.2)；
(12)将步骤(10)获得的胶块用钝边的勺子或者铲子捞出，放入步骤(11)制备的溶菌酶溶液中，放入37℃水浴1h，每12秒震荡一次，450rpm；
(13)将步骤(12)中的溶菌酶溶液倒出，将胶块放置在管底；
(14)加入分子生物级纯度的水，并且立刻倒出；
(15)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(16)制备蛋白酶K混合液：400μL蛋白酶K(Invitrogen,AM2548,20mg/mL)投入到1200μLTE缓冲液(终浓度为10mMTris-HCl,1mMEDTA,PH＝8.0)中；确保胶块浸没在蛋白酶K混合液中，放入50℃水浴2h，十分钟震荡一次，450rpm；
(17)准备30mLWashBuffer(终浓度为10mMTris-HCl；15mMEDTA；PH＝8.0)20℃～25℃放置；
(18)将步骤(16)中蛋白酶K混合液倒掉，保证胶块仍然在底部；
(19)加入10mL步骤(17)获得的WashBuffer，20℃～25℃下在水平摇床上350rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(20)倒掉最后一遍步骤(19)的WashBuffer溶液，并且保证胶块在管底，获得凝胶块；
(21)每个凝胶块准备30mLTE缓冲液(PH＝8)，加入10mLTE缓冲液，20℃～25℃下在水平摇床上200rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(22)倒掉步骤(21)的TE缓冲液，并且保证凝胶块在管底；
(23)每块凝胶块准备7.8mLRNase溶液，包含200μL的RNA酶(Thermo Scientific；2mg/mL；EN0531)和7.6mLTE缓冲液中(10mMTris-HCl；1mM EDTA；PH＝8.0)；
(24)加入2.6mLRNase溶液，20℃～25℃下在水平摇床上180rpm转速轻柔转动10分钟，重复此步骤两遍；
(25)倒掉步骤(24)中最后一遍的RNase溶液，并且保证凝胶块在管底；
(26)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(27)用钝边的勺子或者铲子捞出凝胶块，用洁净的kimwipe吸干水分至胶块半干将凝胶块放入到1.7mL离心管中；
(28)将离心管放到70℃的金属浴(天根，OSE-DB-01/OSE-DB-02)中2min，使凝胶块完全溶解；
(29)将离心管放入43℃金属浴中5min；
(30)每个管中加入4μL溶胶酶(GELaseTMAgaroseGel-DigestingPrep200U；0.2U/μL)，用枪头混匀10s；
(31)将步骤(30)获得的混合液放入43℃金属浴中45min；
(32)5000rpm离心1s，立即将混合液放入到4℃冰箱，获得DNA混合液；
(33)准备培养皿，加入15mL透析缓冲液(终浓度为10mMKCl；5mM EDTA；10mMTris-HCl；1mMCaCl2；0.5mMMgCl2；2mMSpermine-4HCl；2mMSpermidine-3HCl)；
(34)用镊子将0.47μm的透析膜(Advantec；342001)飘在培养皿上，盖上盖子使膜彻底浸湿10min；
(35)用宽口的枪头吸取步骤(32)制备的DNA混合液混匀，滴在膜的中心；
(36)盖上培养皿的盖子，20℃～25℃放置35min，用宽口枪头将样品吸到新的离心管中。
实施例3
本实施例技术重复3次。
(1)样本的收集(200μL)，加入10μL浓度为0.1M的EDTA作为抗凝剂；1000g5min离心将血浆和血细胞分开；
(2)吸出步骤(1)获得的上层血浆于100μLEP管中，放置在43℃中待用；
(3)0.3mLCSB(100mMTris-HCl150μL和100mMEDTA150μL,pH8.0)和10mgLMP(Gibco15517-022)，放入有开水的水浴锅，完全溶解后放置在43℃中待用，获得胶块；
(4)在步骤(1)获得的下层血细胞中加入红细胞裂解液(solarbio,R1010)，比例为血细胞：裂解液＝1:4，混匀至血细胞完全裂解后，3000rpm离心5min,，取白色沉淀；
(5)在步骤(4)获得的白色沉淀中加入800μL白细胞裂解液(泽叶生物，ZY130989)，轻柔吹吸20次后，12000rpm离心5min；
(6)用1mLPBS重悬，3000rpm离心1min，弃上清，重复一次，用枪头吸干所有培养基；
(7)用50μL2℃至4℃的CBS重悬细菌沉淀，放置在43℃金属浴中，获得细胞液；
(8)用步骤(2)吸出的血浆加入到步骤(3)获得的胶块中，43℃缓慢搅拌直到完全融合；
(9)将步骤(8)获得的胶块与步骤(7)获得的细胞液在43℃缓慢搅拌，直到完全融合，注意混匀的时候不能有气泡；
(10)将EP管放入4℃冰箱30min直到胶块彻底凝固；
(11)在15mL离心管中制备溶菌酶溶液：200μLLysozyme(Sigma-Al drich,L3790)、150μLlysostaphin(Sigma-Aldrich,L7386)和10mLTris-HCl(PH7.2)；
(12)将步骤(10)获得的胶块用钝边的勺子或者铲子捞出，放入步骤(11)制备的溶菌酶溶液中，放入37℃水浴1h，每12秒震荡一次，450rpm；
(13)将步骤(12)中的溶菌酶溶液倒出，将胶块放置在管底；
(14)加入分子生物级纯度的水，并且立刻倒出；
(15)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(16)制备蛋白酶K混合液：400μL蛋白酶K(Invitrogen,AM2548,20mg/mL)投入到1200μLTE缓冲液(终浓度为10mMTris-HCl,1mMEDTA,PH＝8.0)中；确保胶块浸没在蛋白酶K混合液中，放入50℃水浴2h，十分钟震荡一次，450rpm；
(17)准备30mLWashBuffer(终浓度为10mMTris-HCl；15mMEDTA；PH＝8.0)20℃～25℃放置；
(18)将步骤(16)中蛋白酶K混合液倒掉，保证胶块仍然在底部；
(19)加入10mL步骤(17)获得的WashBuffer，20℃～25℃下在水平摇床上350rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(20)倒掉最后一遍步骤(19)的WashBuffer溶液，并且保证胶块在管底，获得凝胶块；
(21)每个凝胶块准备30mLTE缓冲液(PH＝8)，加入10mLTE缓冲液，20℃～25℃下在水平摇床上200rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(22)倒掉步骤(21)的TE缓冲液，并且保证凝胶块在管底；
(23)每块凝胶块准备7.8mLRNase溶液，包含200μL的RNA酶(Thermo Scientific；2mg/mL；EN0531)和7.6mLTE缓冲液中(10mMTris-HCl；1mM EDTA；PH＝8.0)；
(24)加入2.6mLRNase溶液，20℃～25℃下在水平摇床上180rpm转速轻柔转动10分钟，重复此步骤两遍；
(25)倒掉步骤(24)中最后一遍的RNase溶液，并且保证凝胶块在管底；
(26)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(27)用钝边的勺子或者铲子捞出凝胶块，用洁净的kimwipe吸干水分至胶块半干将凝胶块放入到1.7mL离心管中；
(28)将离心管放到70℃的金属浴(天根，OSE-DB-01/OSE-DB-02)中2min，使凝胶块完全溶解；
(29)将离心管放入43℃金属浴中5min；
(30)每个管中加入4μL溶胶酶(GELaseTMAgaroseGel-DigestingPrep200U；0.2U/μL)，用枪头混匀10s；
(31)将步骤(30)获得的混合液放入43℃金属浴中45min；
(32)5000rpm离心1s，立即将混合液放入到4℃冰箱，获得DNA混合液；
(33)准备培养皿，加入15mL透析缓冲液(终浓度为10mMKCl；5mM EDTA；10mMTris-HCl；1mMCaCl2；0.5mMMgCl2；4mMSpermine-4HCl；4mMSpermidine-3HCl)；
(34)用镊子将0.47μm的透析膜(Advantec；342001)飘在培养皿上，盖上盖子使膜彻底浸湿10min；
(35)用宽口的枪头吸取步骤(32)制备的DNA混合液混匀，滴在膜的中心；
(36)盖上培养皿的盖子，20℃～25℃放置50min，用宽口枪头将样品吸到新的离心管中。
对比例1
本对比例技术重复3次。
(1)样本的收集(200μL)，加入10μL浓度为0.1M的EDTA作为抗凝剂；1000g5min离心将血浆和血细胞分开；
(2)吸出步骤(1)获得的上层血浆于100μLEP管中，放置在43℃中待用；
(3)0.3mLCSB(100mMTris-HCl150μL和100mMEDTA150μL,pH8.0)和10mgLMP(Gibco15517-022)，放入有开水的水浴锅，完全溶解后放置在43℃中待用，获得胶块；
(4)在步骤(1)获得的下层血细胞中加入红细胞裂解液(solarbio,R1010)，比例为血细胞：裂解液＝1:4，混匀至血细胞完全裂解后，3000rpm离心5min,，取白色沉淀；
(5)在步骤(4)获得的白色沉淀中加入800μL白细胞裂解液(泽叶生物，ZY130989)，轻柔吹吸20次后，12000rpm离心5min；
(6)用1mLPBS重悬，3000rpm离心1min，弃上清，重复一次，用枪头吸干所有培养基；
(7)用50μL2℃至4℃的CBS重悬细菌沉淀，放置在43℃金属浴中，获得细胞液；
(8)用步骤(2)吸出的血浆加入到步骤(3)获得的胶块中，43℃缓慢搅拌直到完全融合；
(9)将步骤(8)获得的胶块与步骤(7)获得的细胞液在43℃缓慢搅拌，直到完全融合，注意混匀的时候不能有气泡；
(10)将EP管放入4℃冰箱30min直到胶块彻底凝固；
(11)在15mL离心管中制备溶菌酶溶液：50μLLysozyme(Sigma-Aldr ich,L3790)、20μLlysostaphin(Sigma-Aldrich,L7386)和10mLTris-HCl(PH7.2)；
(12)将步骤(10)获得的胶块用钝边的勺子或者铲子捞出，放入步骤(11)制备的溶菌酶溶液中，放入37℃水浴1h，每12秒震荡一次，450rpm；
(13)将步骤(12)中的溶菌酶溶液倒出，将胶块放置在管底；
(14)加入分子生物级纯度的水，并且立刻倒出；
(15)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(16)制备蛋白酶K混合液：400μL蛋白酶K(Invitrogen,AM2548,20mg/mL)投入到1200μLTE缓冲液(终浓度为10mMTris-HCl,1mMEDTA,PH＝8.0)中；确保胶块浸没在蛋白酶K混合液中，放入50℃水浴2h，十分钟震荡一次，450rpm；
(17)准备30mLWashBuffer(终浓度为10mMTris-HCl；15mMEDTA；PH＝8.0)20℃～25℃放置；
(18)将步骤(16)中蛋白酶K混合液倒掉，保证胶块仍然在底部；
(19)加入10mL步骤(17)获得的WashBuffer，20℃～25℃下在水平摇床上350rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(20)倒掉最后一遍步骤(19)的WashBuffer溶液，并且保证胶块在管底，获得凝胶块；
(21)每个凝胶块准备30mLTE缓冲液(PH＝8)，加入10mLTE缓冲液，20℃～25℃下在水平摇床上200rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(22)倒掉步骤(21)的TE缓冲液，并且保证凝胶块在管底；
(23)每块凝胶块准备7.8mLRNase溶液，包含200μL的RNA酶(Thermo Scientific；2mg/mL；EN0531)和7.6mLTE缓冲液中(10mMTris-HCl；1mM EDTA；PH＝8.0)；
(24)加入2.6mLRNase溶液，20℃～25℃下在水平摇床上180rpm转速轻柔转动10分钟，重复此步骤两遍；
(25)倒掉步骤(24)中最后一遍的RNase溶液，并且保证凝胶块在管底；
(26)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(27)用钝边的勺子或者铲子捞出凝胶块，用洁净的kimwipe吸干水分至胶块半干将凝胶块放入到1.7mL离心管中；
(28)将离心管放到70℃的金属浴(天根，OSE-DB-01/OSE-DB-02)中2min，使凝胶块完全溶解；
(29)将离心管放入43℃金属浴中5min；
(30)每个管中加入4μL溶胶酶(GELaseTMAgaroseGel-DigestingPrep200U；0.2U/μL)，用枪头混匀10s；
(31)将步骤(30)获得的混合液放入43℃金属浴中45min；
(32)5000rpm离心1s，立即将混合液放入到4℃冰箱，获得DNA混合液；
(33)准备培养皿，加入15mL透析缓冲液(终浓度为10mMKCl；5mM EDTA；10mMTris-HCl；1mMCaCl2；0.5mMMgCl2；0.5mMSpermine-4HCl；0.5mMSpermidine-3HCl)；
(34)用镊子将0.47μm的透析膜(Advantec；342001)飘在培养皿上，盖上盖子使膜彻底浸湿10min；
(35)用宽口的枪头吸取步骤(32)制备的DNA混合液混匀，滴在膜的中心；
(36)盖上培养皿的盖子，20℃～25℃放置5min，用宽口枪头将样品吸到新的离心管中。
对比例2
本对比例技术重复3次。
(1)样本的收集(200μL)，加入10μL浓度为0.1M的EDTA作为抗凝剂；1000g5min离心将血浆和血细胞分开；
(2)吸出步骤(1)获得的上层血浆于100μLEP管中，放置在43℃中待用；
(3)0.3mLCSB(100mMTris-HCl150μL和100mMEDTA150μL,pH8.0)和10mgLMP(Gibco15517-022)，放入有开水的水浴锅，完全溶解后放置在43℃中待用，获得胶块；
(4)在步骤(1)获得的下层血细胞中加入红细胞裂解液(solarbio,R1010)，比例为血细胞：裂解液＝1:4，混匀至血细胞完全裂解后，3000rpm离心5min,，取白色沉淀；
(5)在步骤(4)获得的白色沉淀中加入800μL白细胞裂解液(泽叶生物，ZY130989)，轻柔吹吸20次后，12000rpm离心5min；
(6)用1mLPBS重悬，3000rpm离心1min，弃上清，重复一次，用枪头吸干所有培养基；
(7)用50μL2℃至4℃的CBS重悬细菌沉淀，放置在43℃金属浴中，获得细胞液；
(8)用步骤(2)吸出的血浆加入到步骤(3)获得的胶块中，缓慢搅拌直到完全融合；
(9)将步骤(8)获得的胶块与步骤(7)获得的细胞液在43℃缓慢搅拌，直到完全融合，注意混匀的时候不能有气泡；
(10)将EP管放入4℃冰箱30min直到胶块彻底凝固；
(11)在15mL离心管中制备溶菌酶溶液：250μLLysozyme(Sigma-Al drich,L3790)、200μLlysostaphin(Sigma-Aldrich,L7386)和10mLTris-HCl(PH7.2)；
(12)将步骤(10)获得的胶块用钝边的勺子或者铲子捞出，放入步骤(11)制备的溶菌酶溶液中，放入37℃水浴1h，每12秒震荡一次，450rpm；
(13)将步骤(12)中的溶菌酶溶液倒出，将胶块放置在管底；
(14)加入分子生物级纯度的水，并且立刻倒出；
(15)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(16)制备蛋白酶K混合液：400μL蛋白酶K(Invitrogen,AM2548,20mg/mL)投入到1200μLTE缓冲液(终浓度为10mMTris-HCl,1mMEDTA,PH＝8.0)中；确保胶块浸没在蛋白酶K混合液中，放入50℃水浴2h，十分钟震荡一次，450rpm；
(17)准备30mLWashBuffer(终浓度为10mMTris-HCl；15mMEDTA；PH＝8.0)20℃～25℃放置；
(18)将步骤(16)中蛋白酶K混合液倒掉，保证胶块仍然在底部；
(19)加入10mL步骤(17)获得的WashBuffer，20℃～25℃下在水平摇床上350rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(20)倒掉最后一遍步骤(19)的WashBuffer溶液，并且保证胶块在管底，获得凝胶块；
(21)每个凝胶块准备30mLTE缓冲液(PH＝8)，加入10mLTE缓冲液，20℃～25℃下在水平摇床上200rpm转速轻柔转动15分钟，重复此步骤两遍；
(22)倒掉步骤(21)的TE缓冲液，并且保证凝胶块在管底；
(23)每块凝胶块准备7.8mLRNase溶液，包含200μL的RNA酶(Thermo Scientific；2mg/mL；EN0531)和7.6mLTE缓冲液中(10mMTris-HCl；1mM EDTA；PH＝8.0)；
(24)加入2.6mLRNase溶液，20℃～25℃下在水平摇床上180rpm转速轻柔转动10分钟，重复此步骤两遍；
(25)倒掉步骤(24)中最后一遍的RNase溶液，并且保证凝胶块在管底；
(26)再次倒入分子生物级纯度的水，进行最后一次洗涤，洗涤澄干水；
(27)用钝边的勺子或者铲子捞出凝胶块，用洁净的kimwipe吸干水分至胶块半干将凝胶块放入到1.7mL离心管中；
(28)将离心管放到70℃的金属浴(天根，OSE-DB-01/OSE-DB-02)中2min，使凝胶块完全溶解；
(29)将离心管放入43℃金属浴中5min；
(30)每个管中加入4μL溶胶酶(GELaseTMAgaroseGel-DigestingPrep200U；0.2U/μL)，用枪头混匀10s；
(31)将步骤(30)获得的混合液放入43℃金属浴中45min；
(32)5000rpm离心1s，立即将混合液放入到4℃冰箱，获得DNA混合液；
(33)准备培养皿，加入15mL透析缓冲液(终浓度为10mMKCl；5mM EDTA；10mMTris-HCl；1mMCaCl2；0.5mMMgCl2；4mMSpermine-4HCl；4mMSpermidine-3HCl)；
(34)用镊子将0.47μm的透析膜(Advantec；342001)飘在培养皿上，盖上盖子使膜彻底浸湿10min；
(35)用宽口的枪头吸取步骤(32)制备的DNA混合液混匀，滴在膜的中心；
(36)盖上培养皿的盖子，20℃～25℃放置80min，用宽口枪头将样品吸到新的离心管中。
对比例3
本对比例技术重复3次，本对比例中的电泳使用HindIII酶切片段，其第一条marker为23K。电泳条件是65mA，40min。
(1)静脉抽取3名临床诊断血流综合感染患者血液样本200μL，加入10μL浓度为0.1M的EDTA作为抗凝剂；(患者及顺序同实施例)；
(2)1000g5min离心将血浆和血细胞分开，取100μL血浆备用；
(3)在步骤(2)获得的血细胞中加入红细胞裂解液(solarbio，R1010)(血细胞：裂解液＝1:4)，混合均匀，直至血细胞完全裂解，离心分离，取白细胞沉淀；
(4)将白细胞沉淀中加入500μL白细胞裂解液(泽叶生物，ZY130989)及5μLRNaseA(ThermoScientific；2mg/mL；EN0531)，裂解温度为40℃，裂解时间为30min。至白细胞完全裂解，3000g2min离心分离，弃掉上清；
(5)用500μLTE缓冲液重悬步骤(4)获得的沉淀，转入2mL微珠管(管中含有直径0.15cm的玻璃珠0.5g～0.75g)，放置于旋转温育仪上10min并持续1500rpm进行震荡；
(6)结束震荡后，将微珠管于1200g离心5min，取上清；
(7)在步骤(6)获得的上清中加入20μLProteinaseK(Invitrogen；AM2548；20mg/mL)，混合均匀，消化温度为65℃，消化时间为30min。结束后3000g离心分离，取上层清液；
(8)将步骤(2)获得的血浆和步骤(7)得到的上层清液混合，加入等体积蛋白沉淀剂(Wako；311-90151)，混合均匀，使体系中的蛋白质沉淀，12000rpm离心10min分离，取上层清液；
(9)将步骤(8)获得的上层清液加入等体积的无水乙醇及终浓度为0.3％的糖原，震荡充分；
(10)12000rpm离心10min，获得白色沉淀；
(11)将步骤(10)获得的白色沉淀用80％乙醇清洗沉淀三遍，最后晾干；
(12)将步骤(11)晾干的白色沉淀用TE缓冲液溶解后，进行1X磁珠纯化。
效果例
实验结果如图1～图26和表1～表10所示。
(1)如图1～图5及图9～图16所示，该发明所示方法在参数范围内，均可以获得2.2MB以上长度的基因组长度，同时获得长度在200～300左右的cf DNA。从表1中可以看到，核酸整体的纯净度达标，没有盐离子、蛋白等物质的污染，是非常适合下游建库的所有操作。
(2)相对于实施例1～实施例3来说，对比例1及其重复实验缩短了透析时间使得小片段cfDNA正常得以保存(如图18～图20所示)；但是对比例1因为减少了溶菌酶缓冲液中Lysozyme及lysostaphin浓度，所以能够从QPCR验证实验中看到无论是革兰氏阳性菌的Streptococcuspneumoniae及Staphylo coccusaureus还是革兰氏阴性菌Escherichiacoli、Pseudomonasaeruginosa的检出阈值都显著增高*(表6～表8(非常显著，P＜0.005)和表9(显著，P＜0.05)所示)，从而导致产量也显著下降(如表4所示，P＜0.005)；且因为透析时间过短，导致核酸盐离子、蛋白等分子残留过多，导致260/280及260/230不达标；同时透析液中铵盐含量过低，导致超长核酸片段只有1Mb-2M左右(如图6所示)，没有达到实施例1～实施例3(如图1～图5所示)的2M及以上。
(3)相对于实施例1～实施例3来说(如图9～图16所示)，对比例2因为透析时间过长，导致小片段溢出比较严重，损失了部分300bpcfDNA的含量(如图21～图23所示)。且增加溶菌酶缓冲液Lysozyme及lysostaphin浓度并没有增加革菌检出的总量(如表4所示)；而透析液中铵盐含量过高，虽然保证了核酸完整性(如图7所示)的同时，也让盐离子反向透析进入核酸，导致核酸的260/280虽然合格，但是260/230过低(如表2所示)，因此不合格。
(4)相对于实施例1～实施例3来说，对比例3使用的是目前血流感染最常见的提取方法，该方法利用玻璃珠轰击法破碎细胞壁，并用酚氯仿进行抽提，最后用磁珠法进行纯化/富集。该方法使用物理的破壁方式，激烈且无选择地可以破碎多种细菌的细胞壁，因此对比例3及重复在革兰氏阳性菌/阴性菌的检出方面，于实施例并没有明显差别(如表4所示)；但该方法获得的核酸片段大小仅为150bp～23K(如图8所示)，且蛋白及盐离子残留过多，导致核酸OD值不达标(表2)。与此同时，该方法获得的核酸总量非常显著低于实施例1～实施例3(如表10所示)。
表1实施例及其重复
其中，表1中每个实施例重复3次；
表2对比例及其重复
其中，表2中每个对比例重复3次；
表3实施例总量和对比例1总量(P＜0.005)
表4实施例及其重复的菌检出定量分析
其中，表4中每个实施例重复3次；
表5对比例及其重复的菌检出定量分析
其中，表5中每个对比例重复3次；
表6实施例和对比例1StreptococcuspneumoniaeCT值(P＜0.005)
实施例1～实施例3 对比例1
平均 23.2 34.4
方差 0.0775 0.28
观测值 9 3
假设平均差 0
df 2
tStat -35.07811447
P(T<＝t)单尾 0.000405853
t单尾临界 2.91998558  
表7实施例和对比例1StaphylococcusaureusCT值(P＜0.005)
表8实施例和对比例1EscherichiacoliCT值(P＜0.005)
实施例1～实施例3 对比例1
平均 21.11111111 28.46666667
方差 0.306111111 2.103333333
观测值 9 3
假设平均差 0
df 2
tStat -8.578973763
P(T<＝t)单尾 0.006658194
t单尾临界 2.91998558  
表9实施例和对比例1PseudomonasaeruginosaCT值(P＜0.05)
实施例1～实施例3 对比例1
平均 21.14444444 28.3
方差 0.392777778 2.17
观测值 9 3
假设平均差 0
df 2
tStat -8.170575858
P(T<＝t)单尾 0.007325511
t单尾临界 2.91998558  
表10实施例总量和对比例3总量(P＜0.05)
实施例1～实施例3 对比例3
平均 34.05555556 20.26666667
方差 21.04527778 0.463333333
观测值 9 3
假设平均差 0
df 9
tStat 8.733429148
P(T<＝t)单尾 0.000005455742
t单尾临界 1.833112933  
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.核酸提取试剂，其特征在于，包括：抗凝剂、CSB、LMP、红细胞裂解液、白细胞裂解液、溶菌酶、蛋白酶K、RNase、溶胶酶和透析缓冲液。
2.如权利要求1所述的核酸提取试剂，其特征在于，所述溶菌酶以溶菌酶溶液的形式添加，所述溶菌酶溶液包括：溶菌酶、溶葡球菌酶和Tris-HCl缓冲液。
3.如权利要求1或2所述的核酸提取试剂，其特征在于，所述透析缓冲液包括：KCl、EDTA、Tris-HCl、CaCl2、MgCl2、四盐酸精胺和三盐酸精胺。
4.如权利要求3所述的核酸提取试剂，其特征在于，所述四盐酸精胺或所述三盐酸精胺的的终浓度为1～4mM。
5.核酸提取试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述的核酸提取试剂以及其他可接受的助剂或载体。
6.核酸的提取方法，其特征在于，以如权利要求1至4任一项所述的核酸提取试剂或如权利要求5所述的核酸提取试剂盒与待测样本混合。
7.如权利要求6所述的提取方法，其特征在于，所述混合包括:
S1：取所述待测样本与所述抗凝剂混合，第一离心，获得血浆和血细胞；
S2：取所述血细胞与所述红细胞裂解液混合，第二离心，收集沉淀，与所述白细胞裂解液混合，第三离心，收集沉淀，获得所述细胞液；
S3：取所述血浆、所述CSB、所述细胞液和所述LMP混合，凝固后，与所述溶菌酶溶液混合后，再与所述蛋白酶K混合，获得凝胶块；
S4：取所述凝胶块与TE缓冲液混合后，与所述RNase混合，再与所述溶胶酶混合，第四离心后，获得DNA混合液；
S5：取所述DNA混合液与所述透析缓冲液混合，透析后，获得核酸分子。
8.如权利要求6或7所述的提取方法，其特征在于，S4中所述第四离心的时间为1s，转速为5000rpm。
9.如权利要求6至8任一项所述的提取方法，其特征在于，S5中所述透析的时间为10～50min。
10.如权利要求1至4任一项所述的核酸提取试剂或如权利要求5所述的核酸提取试剂盒在核酸提取中的应用。
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