CN116041257A - 金属螯合配体及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金属螯合配体及其制备方法、应用，涉及金属螯合配体的技术领域，本发明以二乙基三胺五乙酸(DTPA)为基础，通过化学手段偶联了螯合能力更强的6‑氨基吡啶‑2‑羧酸(6‑APA)作为抓手基团，从而得到了新型的金属螯合配体，解决了DTPA配体作为金属螯合单元时对镧系金属螯合效果一般，以及难以有效螯合过渡金属的技术问题，达到了提高DTPA配体对镧系金属和过渡金属的螯合能力。
Description
技术领域
本发明涉及金属螯合配体的技术领域，尤其是涉及一种金属螯合配体及其制备方法、应用。
背景技术
Fluidigm公司的商用试剂盒使用的是传统的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)和二乙基三胺五乙酸(DTPA)配体作为金属螯合单元，以上配体虽然结构简单，成本低廉，但是它对镧系金属的螯合效果一般，而且也难以有效螯合过渡元素。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种金属螯合配体，对镧系金属和过渡金属有较强的螯合能力。
本发明的目的之二在于提供一种金属螯合配体的制备方法，工艺简单，易于操作。
本发明的目的之三在于提供一种金属螯合配体的应用，能够有效抓取金属，对镧系、过渡金属的抓取能力较强，具有突出的应用效果。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
第一方面，一种金属螯合配体，具有如下化学结构：
第二方面，一种金属螯合配体的制备方法，包括以下步骤：
二乙基三胺五乙酸与6-氨基吡啶-2-羧酸进行缩合反应，后处理，得到所述金属螯合配体。
进一步的，所述二乙基三胺五乙酸与6-氨基吡啶-2-羧酸的投料摩尔比为1：1。
进一步的，所述缩合反应的缩合试剂包括4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐；
优选地，所述缩合反应的溶剂包括水。
进一步的，所述缩合反应的温度为25～50℃；
优选地，所述缩合反应的条件为碱性条件。
进一步的，所述后处理包括以下步骤：
缩合反应结束后，将反应体系调至弱酸性，析出固体，洗涤，得到所述金属螯合配体。
第三方面，一种金属螯合配体在生物大分子检测中的应用。
进一步的，所述生物大分子包括抗原、受体以及抗体中的至少一种。
进一步的，所述生物大分子检测的仪器包括质谱流式细胞仪和电感耦合等离子体质谱仪。
进一步的，所述金属螯合配体结合的金属包括稀土金属、镧系元素、过渡金属以及贵金属中的至少一种。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：
本发明提供的金属螯合配体，以二乙基三胺五乙酸(DTPA)为基础，通过化学手段偶联了螯合能力更强的6-氨基吡啶-2-羧酸(6-APA)作为抓手基团；一方面，该配体的多羧酸基团具有螯合三价镧系金属的效果；另一方面，该配体的吡啶羧酸基团能够提高抓取二价过渡金属的能力。因此本发明的金属螯合配体具有更广泛的适用范围，能够提高同时检测的标记物数量，拓展检测通道数量。
本发明提供的金属螯合配体的制备方法，工艺简单，易于操作，且产品的优秀率高。
本发明提供的金属螯合配体的应用，能够有效抓取金属，对镧系、过渡金属的抓取能力较强，具有突出的应用效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种实施方式提供的金属螯合配体的合成反应式图；
图2为本发明实施例1提供的金属螯合配体的核磁氢谱图；
图3为本发明试验例1得到的对比例1商用DOTA配体结合金属143Nd的信号强度图；
图4为本发明试验例1得到的实施例1的配体结合金属143Nd的信号强度图；
图5为本发明试验例2得到的对比例1商用DOTA配体结合过渡金属Ir的信号强度图；
图6为本发明试验例2得到的实施例1的配体结合过渡金属Ir的信号强度图；
图7为本发明试验例3得到的质谱流式采集细胞事件图；
图8为本发明试验例3得到的Pt标记细胞死活分群图；
图9为本发明试验例3得到的Cell-ID Intercalator-Ir分群图；
图10为本发明试验例3得到的试剂盒内EQ beads金属信号图；
图11为本发明试验例3得到的金属154Sm(结合CD45：白细胞)和144Nd(结合CD14：单核细胞)标记细胞分群图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的第一个方面，提供了一种金属螯合配体，具有如下化学结构：
本发明提供的金属螯合配体，以二乙基三胺五乙酸(DTPA)为基础，通过化学手段偶联了螯合能力更强的6-氨基吡啶-2-羧酸(6-APA)作为抓手基团；一方面，该配体的多羧酸基团具有螯合三价镧系金属的效果；另一方面，该配体的吡啶羧酸基团能够提高抓取二价过渡金属的能力。因此本发明的金属螯合配体具有更广泛的适用范围，能够提高同时检测的标记物数量，拓展检测通道数量。
根据本发明的第二个方面，提供了一种的金属螯合配体的制备方法，包括以下步骤：
二乙基三胺五乙酸与6-氨基吡啶-2-羧酸进行缩合反应，后处理，得到金属螯合配体。
本发明提供的金属螯合配体的制备方法，工艺简单，易于操作，且产品的优秀率高。
在一种优选的实施方式中，二乙基三胺五乙酸与6-氨基吡啶-2-羧酸的投料摩尔比可以为1：1，但不限于此，更有利于提高金属螯合配体的合成效果。
在一种优选的实施方式中，缩合反应的缩合试剂包括但不限于4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐，更有利于提高缩合反应的收率和产品纯度。
在本发明中，缩合反应所利用的溶剂包括但不限于水，可以进一步优选为去离子水，更有利于提高缩合反应合成金属螯合配体的效果。
在一种优选的实施方式中，本发明缩合反应的温度可以为25～50℃，其典型但非限制性的温度例如可以为25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、32℃、35℃、40℃、45℃、50℃，但不限于此，更有利于提高缩合反应的收率和产品纯度。
在本发明中，缩合反应的条件为碱性条件，更有利于缩合反应的顺利进行，提高缩合反应的收率。
在一种优选的实施方式中，本发明的后处理包括以下步骤：
缩合反应结束后，将反应体系调至弱酸性，析出固体，洗涤，得到金属螯合配体。
一种金属螯合配体的典型的制备方法，见图1，包括以下步骤：
以去离子水为溶剂，按投料摩尔比1：1，将二乙基三胺五乙酸(DTPA)与6-氨基吡啶-2-羧酸(6-APA)，以及缩合试剂4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)投入反应器中，并调节反应体系的pH至碱性，反应体系呈均相，之后在室温下反应24h，反应结束后，再将体系调至弱酸性，使产物析出并洗涤、干燥，得到金属螯合配体。
本发明提供的金属螯合配体的制备方法，工艺简单，易于操作，且产品的优秀率高。
根据本发明的第三个方面，提供了一种金属螯合配体在生物大分子检测中的应用。
本发明提供的金属螯合配体的应用，能够有效抓取金属，对镧系、过渡金属的抓取能力较强，具有突出的应用效果。
在本发明中，生物大分子包括但不限于抗原、受体以及抗体中的至少一种。
在一种优选的实施方式中，生物大分子检测的仪器包括质谱流式细胞仪和电感耦合等离子体质谱仪。
在本发明中，金属螯合配体结合的金属包括稀土金属、镧系元素、过渡金属以及贵金属中的至少一种。
本发明的基于DTPA和6-氨基吡啶-2-羧酸的新型金属螯合配体，能够有效抓取金属，可用于质谱流式细胞仪和电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)的检测当中；该金属螯合配体能够结合的金属可以选自原子序数为3、4、11-13、19-33、37-52、55-84或87-102之一的元素，包括稀土金属、镧系元素以及贵金属等，其中，金属通过螯合作用或吸附作用结合到该配体上。
下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。
实施例1
一种金属螯合配体的制备方法，包括以下步骤：
以4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)为缩合试剂，在碱性条件将二乙基三胺五乙酸(DTPA)与6-氨基吡啶-2-羧酸(6-APA)在去离子水中反应缩合，其反应机理如图1所示，包括以下步骤：
称取400mg的DTPA与300mg DMTMM投入到50mL的单口圆底烧瓶中，加入10mL去离子水，再加入适量的NaOH调节pH至碱性，反应活化2h；
称取140mg的6-APA加入，反应24h；
反应完成后，调节pH至中性，得到产物(可记为DTPA-6-APA)，洗涤，真空干燥24h，得到金属螯合配体，产率为72.3％，核磁氢谱如图2所示(核磁溶剂为D2O)，其中，化学位移在3.0～4.0ppm之间的峰为DTPA基团中亚甲基的特征峰，化学位移在6.8～7.8ppm之间的峰为吡啶环上三个H的特征峰。
对比例1
Fluidigm公司的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA)，商用DOTA配体。
试验例1
本试验例将实施例1的金属螯合配体与Fluidigm公司的高分子主链连接，再与镧系金属钕Nd进行结合，与对比例1的DOTA配体(即Fluidigm在售试剂盒所用配体)进行比较；
1.实施例1的金属螯合配体连接乙二胺基团：
称取400mg金属螯合配体与120mg的乙二胺溶于10mL去离子水中，调节溶液pH至碱性，室温下反应24h，反应完成后，调节pH至中性，得到乙二胺连接的产物，洗涤，真空干燥；
2.连接高分子主链：
称取133mg的上述的乙二胺连接的产物与Fluidigm商用高分子主链41mg溶于3mLDMF和2mL去离子水的混合溶剂中，再加入1mL的三乙胺，在氮气保护下室温反应24h，过滤，得到高分子连接的产物，洗涤并冷冻干燥；
3.结合镧系金属钕Nd：
①分别向两PCR管中加入95μL去离子水重悬DOTA配体与上述得到的高分子连接的产物，反复吹吸，充分混合；
②分别向两管子中加入5μL 50mM镧系金属143Nd溶液，反复吹吸，充分混合；
③37℃水浴或者金属浴(或者PCR仪)30-40min；
④准备两根3kDa的柱子和收集管，并向其中加入200μL去离子水；
⑤分别往两柱子中加入100μL加热完成的金属配体混合物；
⑥室温离心，弃废液；
⑦再分别加入200μL去离子水，反复离心洗涤5次。
4.金属含量测试：
分别取上述结合完镧系金属的1μL DOTA配体与实施例1的配体的溶液，加入10mL去离子水稀释，再通过ICP-MS分别上样测试，测试结果如图3和图4所示，其中，纵坐标为响应值(106)，横坐标为质量数，图3为商用DOTA配体结合金属143Nd的信号强度图，图4为实施例1的配体结合金属143Nd的信号强度图，可见，实施例1提供的配体的金属信号较对比例1的DOTA配体有明显提升。
试验例2
本试验例将实施例1的金属螯合配体与Fluidigm公司的高分子主链连接，再与过渡金属铱Ir进行结合，与对比例1的DOTA配体(即Fluidigm在售试剂盒所用配体)进行比较；
步骤1和步骤2与试验例1相同；
3.结合过渡金属铱Ir：
①分别向两PCR管中加入95μL去离子水重悬DOTA配体与高分子连接的实施例1的配体产物，反复吹吸，充分混合；
②分别向两管子中加入5μL 50mM过渡金属Ir溶液，反复吹吸，充分混合；
③37℃水浴或者金属浴(或者PCR仪)30-40min；
④准备两根3kDa的柱子和收集管，并向其中加入200μL去离子水；
⑤分别往两柱子中加入100μL加热完成的金属配体混合物；
⑥室温离心，弃废液；
⑦再分别加入200μL去离子水，反复离心洗涤5次。
4.金属含量测试：
分别取上述结合完过渡金属的1μL DOTA配体与实施例1的配体的溶液，加入10mL去离子水稀释，再通过ICP-MS分别上样测试，测试结果如图5和图6所示，其中，纵坐标为响应值，横坐标为质量数，图5为商用DOTA配体结合过渡金属Ir的信号强度图，图6(纵坐标响应值103)为实施例1的配体结合过渡金属Ir的信号强度图，可见，DOTA配体无法与金属Ir有效结合，因此检测不到金属信号，而实施例1提供的配体能够成功结合金属Ir并检测到相应的金属信号。
试验例3
本试验例用实施例1的金属螯合配体取代传统DOTA配体，与Fluidigm公司商用金属标签、抗体试剂盒联用，通过质谱流式细胞仪检测细胞上的抗原和受体，方法如下：
1.实施例1的配体结合镧系金属：
采用试验例1中相同的步骤，将配体与镧系金属154Sm和144Nd结合；
2.抗体清洗和还原：
取出抗体，并加入标记好的50kDa柱子，离心洗涤；加入TBS缓冲液和还原剂，37℃水浴孵育30min，孵育结束后，加入TBS缓冲液，反复离心清洗；
3.抗体连接金属(154Sm结合CD45、144Nd结合CD14)：
将步骤1中的3kDa滤芯中连接了金属的聚合物，到入装有抗体的50kDa的柱子中，37℃水浴孵育90min，孵育结束后，用TBS缓冲液反复离心洗涤；
4.取新样品管，倒扣滤芯，离心收集金属标记抗体；
5.使用质谱流式细胞仪进行测试，结果见图7、图8、图9、图10以及图11所示，其中，图7为质谱流式采集细胞事件图(证明实验稳定性)，图8为Pt标记细胞死活分群图，图9为Cell-ID Intercalator-Ir分群图(识别单细胞、粘连细胞、细胞碎片等)，图10为试剂盒内EQ beads金属信号图(作为金属信号内标参照物)，图11为金属154Sm(结合CD45：白细胞)和144Nd(结合CD14：单核细胞)标记细胞分群图，由图可见，实施例1的配体能够有效结合金属，能够通过质谱流式细胞仪进行细胞抗原和受体的标记检测。
综上所述，以常见的螯合剂DTPA为基础，引入螯合能力更强的6-APA官能团，制成新型金属螯合配体，提高抓取镧系、过渡金属能力。一方面，配体的多羧酸基团具有螯合三价镧系金属的效果；另一方面，该配体的吡啶羧酸基团能够提高抓取二价过渡金属的能力。可以拓展金属螯合配体的适用范围，提高同时检测的标记物数量，即拓展检测通道数量。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种金属螯合配体，其特征在于，具有如下化学结构：
2.一种权利要求1所述的金属螯合配体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
二乙基三胺五乙酸与6-氨基吡啶-2-羧酸进行缩合反应，后处理，得到所述金属螯合配体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述二乙基三胺五乙酸与6-氨基吡啶-2-羧酸的投料摩尔比为1：1。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述缩合反应的缩合试剂包括4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐；
优选地，所述缩合反应的溶剂包括水。
5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述缩合反应的温度为25～50℃；
优选地，所述缩合反应的条件为碱性条件。
6.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述后处理包括以下步骤：
缩合反应结束后，将反应体系调至弱酸性，析出固体，得到所述金属螯合配体。
7.一种权利要求1所述的金属螯合配体在生物大分子检测中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生物大分子包括抗原、受体以及抗体中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生物大分子检测的仪器包括质谱流式细胞仪和电感耦合等离子体质谱仪。
10.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，所述金属螯合配体结合的金属包括稀土金属、镧系元素、过渡金属以及贵金属中的至少一种。
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