CN116035001B - 一种白葡萄球菌灭活剂及灭活方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制品技术领域，更具体地，涉及一种白葡萄球菌灭活剂及灭活方法。本发明提供的白葡萄球菌灭活剂，尤其适用于白葡萄球菌片生产中白葡萄球菌的灭活。通过将乳酸和甲醛按照一定比例混合使用，作为白葡萄球菌的灭活剂，能够在保障抗原免疫原性和胞壁酸含量稳定的前提下，降低传统灭活白葡萄球菌时甲醛的使用量，不仅降低了建设、生产成本，还降低了环境污染和健康风险。
Description
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，更具体地，涉及一种白葡萄球菌灭活剂及灭活方法。
背景技术
白葡萄球菌是免疫制剂气管炎菌苗重要的组成成分，口服白葡萄球菌300亿/公斤以上，即有显著的镇咳作用，其镇咳作用在菌体本身，作用部位在延脑咳嗽中枢部位，毒性小，总有效率高达91.2％。经广泛应用，深受广大患者欢迎，获得了明显的经济和社会效益，该微生物细菌产品是一个安全有效、质量可控的止咳药物。2000年通过了国家药典委员会的医学和药学再评价并于2002年获得了化学药品“国药准字”批准文号H42022881更名为“白葡萄球菌片”。白葡萄球菌片生产中的关键步骤之一是细菌灭活，因为加温50℃以上，丧失镇咳作用，所以目前经济有效的技术手段还是使用甲醛。
甲醛是疫苗生产中最常用的灭活剂，广泛运用于生物制品中抗原(病毒、细菌等)的灭活。甲醛是一种通过交联生物体的大分子来灭活生物体的有毒试剂，适宜浓度的甲醛一方面与微生物蛋白质的氨基结合形成羟甲基衍生物，随着作用时间的延长，羟甲基衍生物可再与酰胺发生交联反应，使微生物丧失毒性和繁殖能力，但仍能保持良好的免疫性：另一方面也可以使核酸灭活，其作用是通过与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶等含有胺基的碱基结合而使核酸变性，达到灭活的效果以获得蛋白结构稳定、免疫原性较高的抗原，用于制备疫苗终产品。尽管已被用于灭活菌苗数十年，有很多优点，但它可以通过改变表位的完整性，影响细胞壁上的抗原决定簇，从而对表面抗原的物理和化学特性以及免疫反应产生副作用。这些化学反应产生的反应产物可诱导细菌蛋白的交联与细菌颗粒的聚集。这可能妨碍甲醛的灭活效率，并且还可能导致疫苗中抗原的免疫原性部分破坏。此外高浓度的甲醛对环境造成了巨大的危害，因此，需要使用佐剂来降低甲醛使用量提高白葡萄球菌效力，以提高其性能。
目前白葡萄球菌菌粉基本都使用0.6wt％甲醛灭活，但是没有进行有效成分胞壁酸的评价；张许科等利用聚丙烯酸系聚合物和纤维素醚为佐剂，提升疫苗效果。王楠等利用壳聚糖、双链聚肌胞和乙酸盐溶液按照一定的比例混合，溶解后除菌过滤，制成一种四价猪链球菌佐剂，提升疫苗多价保护、提升稳定性、安全性。但是这些新灭活剂方法在白葡萄球菌中没有应用过，且对其细胞壁上的胞壁酸是否有保护作用也未知。
而乳酸杀菌是由不解离的分子决定，因为不电离的分子能透过细菌胞浆膜的脂质双分子层，影响细菌细胞膜电位，导致细菌超极化，进而达到灭活的功效。它的蒸气或喷雾用于消毒空气，广谱杀菌，是手术室动气消毒最传统的消毒方法，具有价廉、毒性低的优点，但杀菌力不够强。而乳酸液体消毒少见报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种白葡萄球菌灭活剂及灭活方法，通过将乳酸和甲醛按照一定比例混合使用作为白葡萄球菌的灭活剂，能够在保障抗原免疫原性和胞壁酸含量稳定的前提下，降低传统灭活白葡萄球菌时甲醛的使用量，解决了现有技术白葡萄球菌灭活剂中甲醛含量高引起的环境和健康风险等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种用于灭活白葡萄球菌的灭活剂，其为甲醛和乳酸的混合水溶液，其中甲醛的浓度为0.1～0.3wt％，乳酸的浓度为60～80wt％。
优选地，所述甲醛的浓度为0.1～0.2wt％，乳酸的浓度为70～80wt％。
按照本发明的另一个方面，提供了一种利用所述的灭活剂进行白葡萄球菌的灭活方法，将所述的灭活剂与白葡萄球菌菌体混合，对所述白葡萄球菌菌体进行灭活处理。
优选地，所述的灭活方法，包括如下步骤：
(1)将白葡萄球菌菌体与所述灭活剂混合，得到加入灭活剂后的菌体；
(2)将步骤(1)所述加入灭活剂后的菌体在30～40℃下搅拌2小时或以上，得到搅拌完成后的菌液；
(3)将步骤(2)所述搅拌完成后的菌液静置灭活2小时或以上，得到灭活后的白葡萄球菌菌液。
优选地，所述的灭活方法，还包括步骤：
(4)将灭活后的白葡萄球菌菌液进行浓缩获得灭活菌体，并对灭活菌体进行冷冻干燥制得白葡萄球菌菌粉。
优选地，步骤(1)所述白葡萄球菌菌体的制备方法包括如下步骤：将发酵后的白葡萄球菌菌液进行浓缩，得到所述白葡萄球菌菌体，其中，所述白葡萄球菌菌体的湿重与灭活后最终制得的白葡萄球菌菌粉的干重之比为(3～8)：1，进一步优选为(4～6):1。
优选地，将发酵后的白葡萄球菌菌液通过加入絮凝剂絮凝，待菌体沉淀下来后去除上清液，得到所述白葡萄球菌菌体；或者将发酵后的白葡萄球菌菌液通过离心分离，去除上清液，得到所述白葡萄球菌菌体。
优选地，步骤(1)每100g所述白葡萄球菌菌体中加入所述灭活剂的体积大于或等于150mL，进一步优选每100g所述白葡萄球菌菌体中加入所述灭活剂的体积为180～400mL。
优选地，步骤(2)所述搅拌，其搅拌速度为150～250rpm，搅拌时间为2～24h。
进一步优选地，步骤(2)所述搅拌，其搅拌速度为180～250rpm，搅拌时间为2～3h。
优选地，步骤(3)所述静置灭活时间为2～24h，进一步优选为2～6h。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下
有益效果：
(1)本发明提供的一种白葡萄球菌灭活剂，尤其适用于白葡萄球菌片生产中白葡萄球菌的灭活。通过将乳酸和甲醛按照一定比例混合使用，作为白葡萄球菌的灭活剂，并且使得其中甲醛的质量浓度为0.1～0.3wt％，乳酸的浓度为60～80wt％，实验发现采用本发明灭活剂对白葡萄球菌菌体进行灭活处理时，能够在保障抗原免疫原性和胞壁酸含量稳定的前提下，降低传统灭活白葡萄球菌时甲醛的使用量，降低了建设、生产成本，降低了环境污染和健康风险。
(2)本发明还提供了一种使用本发明提出的新型复合灭活剂对白葡萄球菌生产过程中经发酵液浓缩后得到的白葡萄球菌菌体进行白葡萄球菌的灭活工艺，通过控制灭活过程中搅拌速度、搅拌时间、灭活温度以及静置灭活时间工艺参数，确保细菌灭活效率的同时，维持白葡萄球菌抗原的免疫原性，并最大程度保持白葡萄球菌细胞壁中的胞壁酸含量。且本发明对发酵液浓缩后的白葡萄球菌菌体进行灭活处理，相对于现有技术通常直接对发酵液进行灭活处理，灭活剂的添加量大大降低。
(3)目前传统技术使用甲醛溶液灭活白葡萄球菌的最低浓度是0.5wt％，本发明灭活方法可以将甲醛使用剂量最低浓度降低到0.1wt％。本发明灭活方法能够减少灭活过程中抗原和有效成分的损失，并能够稳定抗原结构，增加有效成分含量，提高免疫原性和镇咳效果。本发明灭活方法可保证产品质量稳定性、均一性，大大减少了环境污染，将灭活甲醛浓度从0.5wt％左右降低至0.1wt％，并添加了一定量的乳酸，避免了高浓度的甲醛长时间的置于室温中，减少了人员身体损伤，同时提高了有效成分胞壁酸的含量，进而在保证免疫原性的基础上提高了白葡萄球菌片的镇咳效果。
附图说明
图1为实施例1中使用甲醛浓度为0.1wt％，乳酸浓度为60wt％，转速为180rpm，温度为37℃，搅拌2h，静置2h的灭菌效果图。
图2为实施例2中使用甲醛浓度为0.3wt％，乳酸浓度为80wt％，转速为250rpm，温度为40℃，搅拌3h，静置6h的灭菌效果图。
图3为实施例3中使用甲醛浓度为0.3wt％，乳酸浓度为60wt％，转速为150rpm，温度为37℃，搅拌3h，静置4h的灭菌效果图。
图4为实施例4中使用甲醛浓度为0.2wt％，乳酸浓度为70wt％，转速为250rpm，温度为37℃，搅拌2h，静置4h的灭菌效果图。
图5为实施例5中使用甲醛浓度为0.3wt％，乳酸浓度为60wt％，转速为150rpm，温度为30℃，搅拌2.5h，静置2h的灭菌效果图。
图6为实施例6中使用甲醛浓度为0.3wt％，乳酸浓度为60wt％，转速为150rpm，温度为39℃，搅拌2h，静置4h的灭菌效果图。
图7为对比例5中使用甲醛浓度为0.1wt％，乳酸浓度为60wt％，转速为100rpm，温度为60℃，搅拌1h，静置1h的灭菌效果图。
图8为对比例6中使用甲醛浓度为0.02wt％，乳酸浓度为60wt％，转速为100rpm，温度为39℃，搅拌2h，静置2h的灭菌效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供的一种用于灭活白葡萄球菌的灭活剂，其为甲醛和乳酸的混合水溶液，其中甲醛的浓度为0.1～0.3wt％，乳酸的浓度为60～80wt％。较佳实施例中，甲醛的浓度为0.1～0.2wt％，乳酸的浓度为70～80wt％。本发明提供的一种利用该复合灭活剂进行白葡萄球菌的灭活方法，采用该灭活剂对白葡萄球菌菌体进行灭活处理，能够维持白葡萄球菌抗原的免疫原性，减少灭活过程中白葡萄球菌中胞壁酸的损失。
一些实施例中，该灭活方法，包括如下步骤：
(1)将白葡萄球菌菌体与所述灭活剂混合，得到加入灭活剂后的菌体。
(2)将步骤(1)加入灭活剂后的菌体在30～40℃下搅拌2h或以上，得到搅拌完成后的菌液；
(3)将步骤(2)所述搅拌完成后的菌液静置灭活2h及以上，得到灭活后的白葡萄球菌菌体。
一些实施例中，所述的灭活方法，还包括步骤：
(4)将灭活后的白葡萄球菌菌液进行浓缩获得灭活菌体，并对灭活菌体进行洗涤和真空冷冻干燥制得白葡萄球菌菌粉。
一些实施例中，步骤(1)所述白葡萄球菌菌体的制备方法包括如下步骤：将发酵后的白葡萄球菌菌液进行浓缩，得到所述白葡萄球菌菌体，所述白葡萄球菌菌体的湿重与步骤(4)制得的白葡萄球菌菌粉的干重之比为(3～8)：1，较佳实施例中为(4～6):1。
一些实施例中，所述浓缩具体为：将发酵后的白葡萄球菌菌液通过加入絮凝剂絮凝，待菌体沉淀下来后去除上清液进行浓缩，得到所述白葡萄球菌菌体；或者将发酵后的白葡萄球菌菌液通过离心分离，去除上清液进行浓缩，得到所述白葡萄球菌菌体。
一些实施例中，步骤(1)每100g所述白葡萄球菌菌体中加入所述灭活剂的体积大于或等于150mL，较佳实施例中，每100g所述白葡萄球菌菌体中加入所述灭活剂的体积为180～400mL。
一些实施例中，步骤(2)所述搅拌，其搅拌速度为150～250rpm，搅拌时间为2～24h，较佳的搅拌速度为180～250rpm，搅拌时间为2～3h。步骤(3)所述静置灭活时间为2～24h，较佳为2～6h。
白葡萄球菌镇咳的有效成分为胞壁酸。胞壁酸是革兰氏阳性菌细胞壁中的一种阴离子多糖聚合物，构成细菌细胞壁肽聚糖组成中氨糖的一种，是氨基葡萄糖的C3与乳酸C2以醚键相连接而形成的产物。在某些细菌中其含量可高达整个细胞壁质量的60％，不仅维持了细菌的细胞形态，在细菌很多的生命活动中具有重要作用，而且白葡萄球菌中的胞壁酸有显著的镇咳作用。本发明经实验证实，由甲醛与乳酸联合灭活白葡萄球菌有助于保护抗原和有效成分胞壁酸，不影响白葡萄球菌的镇咳效果。此外，白葡萄球菌的替代灭活(甲醛和乳酸)和常规甲醛疫苗之间相比，灭活细菌所需的甲醛浓度小，可以改进白葡萄球菌的灭活工艺，而且毒性更小，保护环境。
实验发现，在抗原结构固定过程中，甲醛溶液的浓度要控制在一定的范围内，抗原的固定和细菌的灭活效果才能达到最佳。搅拌速度的变化影响菌液中甲醛溶液的浓度变化，对抗原的活性和灭活效率造成重要影响：搅拌速度过大、搅拌温度过高，搅拌时间和静置时间过长会使蛋白质和胞壁酸的结构发生变化而失去活性，有效成分损失增加：搅拌速度过慢，液体混合不佳，会阻碍局部能量的传递，蛋白质末端基团不能形成稳定的交联键，进而影响蛋白结构的固定，最终导致蛋白结构不稳定，灭活效果不佳。搅拌温度过低、甲醛乳酸比例不合适、搅拌时间和静置时间过短，会导致细菌与灭活剂反应不完全，无法达到灭菌和保护胞壁酸的效果。因此，本发明针对白葡萄球菌片生产过程中影响灭活的几个因素，例如：添加甲醛溶液浓度、添加乳酸浓度、甲醛乳酸的比例、搅拌速率、搅拌时间、搅拌温度、静置时间等方面进行摸索和条件优化，获得了本发明的灭活白葡萄球菌的方法。目前传统方法使用甲醛溶液灭活白葡萄球菌的最低浓度是0.5wt％，而本发明方法可以将甲醛使用量最低降低至0.1wt％。对于甲醛和乳酸的比例，实验发现二者比例不合适，可导致灭活不完全，达不到灭菌效果。本发明提出的灭活方法能够减少灭活过程中抗原和有效成分的损失，并能够稳定抗原结构，增加有效成分含量，提高免疫原性和镇咳效果。本发明方法可保证产品质量稳定性、均一性，大大减少了环境污染，将灭活甲醛浓度从0.5wt％左右降低至0.1wt％，并添加了一定量的乳酸，避免了高浓度的甲醛长时间的置于室温中，减少了人员身体损伤，同时提高了有效成分胞壁酸的含量，进而在保证免疫原性的基础上提高了白葡萄球菌片的镇咳效果。
本发明涉及一种在白葡萄球菌片生产中灭活细菌的灭活剂及灭活工艺，属于生物制品制备领域。本发明基于当前白葡萄球菌生产中大量使用甲醛灭活剂损害人体健康、降低产品质量的问题，开发出一种含有甲醛、乳酸的新型复合灭活剂，将灭活甲醛使用量从0.5wt％降低为0.1wt％，同时提升了白葡萄球菌菌粉质量及产品镇咳效果；此外，围绕该新型复合灭活剂的使用，本发明对白葡萄球菌片生产过程中温度控制、添加甲醛溶液浓度、添加乳酸浓度、搅拌速率、搅拌时间、静置时间等条件参数加以改进，获取了最优的灭活条件，减少了灭活过程中抗原和胞壁酸的损失，从而稳定了抗原结构，提高了免疫原性和镇咳效果。使用本发明中的新型复合灭活剂及灭活工艺，不仅可以降低白葡萄球菌片生产灭活环节的人员健康和环境污染风险，还可以提升白葡萄球菌片的关键活性成分指标，从而达到改良生产工艺、提高产品质量的效果。
当前白葡萄球菌生产中大量使用甲醛灭活剂，其甲醛使用量一般为0.6wt％，最低也需要0.5wt％，这一浓度一般是指，针对直接对经液体发酵培养获取的白葡萄球菌发酵液中加入甲醛灭活剂进行灭活时，发酵液中甲醛的终浓度为0.6wt％或0.5wt％。行业内可以对发酵液直接灭菌，也可以对经发酵液浓缩5～10倍以后得到的白葡萄球菌湿菌体加入灭活剂进行灭菌，本发明一些实施例中向浓缩后的湿菌体加入本发明灭活剂进行灭菌，每100g湿菌体中加入的灭活剂体积为180～400mL，而且灭活剂中甲醛浓度最高为0.3wt％，可以计算得知使用本发明灭活剂时单位量的白葡萄球菌干菌粉所消耗的甲醛用量远低于当前直接采用甲醛灭活剂时的甲醛用量。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。一些实施例中，经液体发酵培养获取白葡萄球菌液，包括如下步骤：
1)制备种子液：
按无菌要求，取白葡萄球菌冻存管内的菌种按照3％～10％的接种量接种到种子培养基中，在37±1℃，150rpm培养18～24小时，获得种子液；
2)制备发酵液：
将葡萄糖3～10g/L，酵母粉15～30g/L，蛋白胨9～15g/L，氯化钠4～6g/L，磷酸氢二钠1～4g/L，硫酸镁0.3～0.5g/L，磷酸二氢钾4～7g/L，硫酸铵1～3g/L，柠檬酸1～3g/L，氢氧化钠2～4g/L和微量元素(硫酸铜0.2～0.35g/L，硫酸锰1.6～2.05g/L，硫酸锌0.2～0.4g/L，氯化钴2.4～2.6g/L，氯化钙1.1～1.4g/L，浓硫酸53～58g/L)0.1～0.12％(体积百分数)添加用水补至全量制成发酵培养基，搅拌充分溶解后，用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调pH值至7.0～7.6后，灭菌；将种子液按照3％～10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，培养温度为37±1℃，通气量保持溶氧水平为20％，并通过添加葡萄糖控制糖含量不低于0.3wt％，发酵48h，得到白葡萄球菌发酵液。
本发明以下实施例和对比例中对上述方法得到的白葡萄球菌发酵液直接进行灭活，或对发酵液进行离心浓缩后得到的白葡萄球菌菌体采用对照组灭活剂以及本发明灭活剂进行灭活处理，并比较灭活效果。
对比例1
1.经液体发酵培养获取白葡萄球菌液。
1)制备种子液：
按无菌要求，取白葡萄球菌冻存管内的菌种按照5％的接种量接种到种子培养基(LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L)中，在37±1℃，150rpm培养20小时，获得种子液；
2)制备发酵液：
将葡萄糖6g/L，酵母粉22g/L，蛋白胨15g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钠3g/L，硫酸镁0.4g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸铵2g/L，柠檬酸2g/L，氢氧化钠3g/L和微量元素(硫酸铜0.2g/L，硫酸锰1.81g/L，硫酸锌0.3g/L，氯化钴2.5g/L，氯化钙1.3g/L，浓硫酸55.2g/L)0.1％(体积百分数)添加用水补至全量制成发酵培养基，搅拌充分溶解后，用氢氧化钠溶液和盐酸溶液调pH值至7.2后，灭菌；将种子液按照5％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，培养温度为37±1℃，通气量保持溶氧水平为20％，并通过添加葡萄糖控制糖含量不低于0.3wt％，发酵48h，得到白葡萄球菌发酵液。
2.向得到的白葡萄球菌发酵液中加入甲醛灭活剂，使其中甲醛的终浓度为0.6wt％，于37℃下180rpm搅拌2h，搅拌完成后的菌液静置灭活。静置菌液的温度在37℃，2h。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果，显示可以灭活，将灭活后的菌液离心、洗涤，获得菌体，并对菌体进行真空冷冻干燥制得40g菌粉。
4.干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸的含量。胞壁酸的含量检测方法具体为：
(1)衍生物的制备：将酸解旋干后的菌粉，多次加水溶解真空旋干蒸发，直到待测样品接近中性，准确称量冻干后的水解待测样品10mg，分别加入10mg盐酸羟胺，0.5mL吡啶，振荡溶解，移入安瓿瓶后封管，90℃水浴加热反应30min，并振荡摇晃，冷却至室温后，加入0.5mL醋酸酐，封管后于90℃水浴继续反应30min，离心，反应物直接进行气相色谱分析。
(2)气相色谱分析条件：色谱柱：Agilent 19091J-433(30mx250μmx0.25μm)；检测条件：初始温度为70℃保持0.5min后，然后10℃/min到160℃用于0分钟，然后5℃/min到280℃用于5分钟，运行时间：39分钟，进样量为1μL，载气为氦气，分流比为20：1。MS的检测参数：溶剂延迟：8.00min，低质量数：29.0，高质量数500.0，离子源：230℃，最大值250℃，MS四极杆：150℃，最大值200℃，通过数据库确定纯化样品的种类。经过气相色谱-质谱联用，得到气相色谱的峰形图，进行软件分析。
对比例2
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液，然后在4000rpm条件下离心处理30min，得到200g含水量约为80wt％的白葡萄球菌湿菌体。
2.灭活白葡萄球菌菌体：向得到的200g白葡萄球菌菌体中加入400mL灭活剂，灭活剂为85wt％的乳酸，于37℃下180rpm搅拌2h，搅拌完成后的菌液静置灭活。静置菌液的温度在37℃，2h。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果，显示无法灭活，将灭活后的菌液离心、洗涤，获得菌体，并对菌体进行真空冷冻干燥制得40g菌粉。
4.干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸的含量。具体方法同对比例1。
对比例3
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液。
2.将得到的白葡萄球菌发酵液进行85℃高温加热灭活1h。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果，显示可以灭活，将灭活后菌体放入真空冷冻干燥机干燥制得40g菌粉。
4.干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸的含量。具体方法同对比例1。
对比例4
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液。
2.向得到的白葡萄球菌菌液中加入灭活剂，灭活剂为β-丙内酯，加入该灭活剂使得发酵液中β-丙内酯的终浓度为0.25wt％，于4℃下100rpm搅拌8h，搅拌完成后的菌液静置灭活。静置菌液的温度在4℃，2h，灭活后的菌液于37℃，2h，使β-丙内酯发生水解。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果，显示可以灭活，将灭活后的菌液离心、洗涤，获得菌体，并对菌体进行真空冷冻干燥制得40g菌粉。
4.干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸的含量。具体方法同对比例1。
实施例1
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液，然后在4000rpm条件下离心处理30min，得到200g含水量约为80wt％的白葡萄球菌湿菌体。
2.灭活白葡萄球菌菌体：向得到的200g白葡萄球菌菌体中加入400mL灭活剂，灭活剂为甲醛和乳酸的混合溶液，其中甲醛的浓度为0.1wt％，乳酸的浓度为60wt％，于37℃下180rpm搅拌2h，搅拌完成后的菌液静置灭活。菌液的温度在37℃下静置2h。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果。将灭活后的菌体进行真空冷冻干燥，制得40g菌粉，干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸含量为12.246mg/g。
4.数据及分析：灭活效果由菌液在平板上是否生长决定。如图1所示，内容A：阴性对照；内容B：样品；内容C：阳性对照。无菌体在平板上生长，此情况下白葡萄球菌可以达到灭活效果。
实施例2
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液，然后在4000rpm条件下离心处理30min，得到200g含水量约为80wt％的白葡萄球菌湿菌体。
2.灭活白葡萄球菌菌体：向得到的200g白葡萄球菌菌体中加入400mL灭活剂，灭活剂为甲醛和乳酸的混合溶液，其中甲醛的浓度为0.3wt％，乳酸浓度为80wt％，于40℃下250rpm搅拌3h，搅拌完成后的菌液静置灭活。静置菌液的条件是40℃，6h。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果。将灭活后的菌体进行真空冷冻干燥，制得40g菌粉，干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸含量为12.289mg/g
4.数据及分析：如图2所示，内容A：阴性对照；内容B：样品；内容C：阳性对照。无菌体在平板上生长，此情况下白葡萄球菌可以达到灭活效果。
实施例3
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液，然后在4000rpm条件下离心处理30min，得到200g含水量约为80wt％的白葡萄球菌湿菌体。
2.灭活白葡萄球菌菌体：向得到的200g白葡萄球菌菌体中加入400mL灭活剂，灭活剂为甲醛和乳酸的混合溶液，其中甲醛的浓度为0.3wt％，乳酸的浓度为60wt％，于37℃下150rpm搅拌3h，搅拌完成后的菌液在37℃静置4h灭活。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果。将灭活后的菌体进行真空冷冻干燥，制得40g干燥菌粉，干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸含量为11.754mg/g
4.数据及分析：如图3所示，内容A：阴性对照；内容B：样品；内容C：阳性对照。无菌体在平板上生长，此情况下白葡萄球菌可以达到灭活效果。
实施例4
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液，然后在4000rpm条件下离心处理30min，得到200g含水量约为80wt％的白葡萄球菌湿菌体。
2.灭活白葡萄球菌菌体：向得到的200g白葡萄球菌菌体中加入400mL灭活剂，灭活剂为甲醛和乳酸的混合溶液，其中甲醛的浓度为0.2wt％，乳酸浓度为70wt％，于250rpm下搅拌2h，搅拌完成后的菌液在37℃，静置4h灭活。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果。将灭活后菌体放入真空冷冻干燥机干燥，制得40g干燥菌粉，干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸含量为12.118mg/g。
4.数据及分析：如图4所示，内容A：阴性对照；内容B：样品；内容C：阳性对照。使用甲醛和乳酸终浓度为0.2％和70％时，无菌体在平板上生长，此情况下白葡萄球菌可以达到灭活效果。
实施例5
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液，然后在4000rpm条件下离心处理30min，得到200g含水量约为80wt％的白葡萄球菌湿菌体。
2.灭活白葡萄球菌菌体：向得到的200g白葡萄球菌菌体中加入400mL灭活剂，灭活剂为甲醛和乳酸的混合溶液，其中甲醛的浓度为0.3wt％，乳酸浓度为60wt％，于30℃，150rpm下搅拌2.5h，搅拌完成后的菌液在30℃，静置2h灭活。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果。将灭活后的菌体进行真空冷冻干燥，制得40g菌粉，干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸含量为11.923mg/g。
4.数据及分析：如图5所示，内容A：阴性对照；内容B：样品；内容C：阳性对照。无菌体在平板上生长，此情况下白葡萄球菌可以达到灭活效果。
实施例6
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液，然后在4000rpm条件下离心处理30min，得到200g含水量约为80wt％的白葡萄球菌湿菌体。
2.灭活白葡萄球菌菌体：向得到的200g白葡萄球菌菌体中加入400mL灭活剂，灭活剂为甲醛和乳酸的混合溶液，其中甲醛的浓度为0.3wt％，乳酸的浓度为60wt％，于39℃下150rpm搅拌2h，搅拌完成后的菌液在39℃，静置4h灭活。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果。将灭活后的菌体进行真空冷冻干燥，干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸含量为11.893mg/g。
4.数据及分析：如图6所示，内容A：阴性对照；内容B：样品；内容C：阳性对照。无菌体在平板上生长，此情况下白葡萄球菌可以达到灭活效果。
对比例5
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液，然后在4000rpm条件下离心处理30min，得到200g含水量约为80wt％的白葡萄球菌湿菌体。
2.灭活白葡萄球菌菌体：向得到的200g白葡萄球菌菌体中加入400mL灭活剂，灭活剂为甲醛和乳酸的混合溶液，其中甲醛的浓度为0.1wt％，乳酸浓度为60wt％，于60℃下100rpm搅拌1h，搅拌完成后的菌液在60℃，静置1h灭活。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果。将灭活后的菌体进行真空冷冻干燥，制得40g菌粉，干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸含量为7.392mg/g。
4.数据及分析：如图7所示，内容A：阴性对照；内容B：样品；内容C：阳性对照。有菌体在平板上生长，此情况下白葡萄球菌无法达到灭活效果，且胞壁酸含量明显降低。
对比例6
1.按照对比例1方法获得白葡萄球菌发酵液，然后在4000rpm条件下离心处理30min，得到200g含水量约为80wt％的白葡萄球菌湿菌体。
2.灭活白葡萄球菌菌体：向得到的200g白葡萄球菌菌体中加入400mL灭活剂，灭活剂为甲醛和乳酸的混合溶液，其中甲醛的浓度为0.02wt％，乳酸的浓度为60wt％，于39℃下100rpm搅拌2h，搅拌完成后的菌液在39℃，静置2h灭活。
3.灭活结束后，取样，涂平板检验灭活效果。将灭活后的菌体进行真空冷冻干燥，制得40g菌粉，干燥后的菌粉，使用气相色谱质谱联用方法，检测胞壁酸含量为12.012mg/g。
4.数据及分析：如图8所示，内容A：阴性对照；内容B：样品；内容C：阳性对照。有菌体在平板上生长，此情况下白葡萄球菌无法达到灭活效果。
对比例1至对比例6，以及实施例1至实施例6菌粉中胞壁酸含量的检测均采用对比例1中胞壁酸检测方法，测试结果见表1。表1中SD表示重复检测6次的胞壁酸含量的标准差。
表1不同灭菌剂灭活白葡萄球菌效果
从表1中可以看出，与使用甲醛作为灭活剂相比，β-丙内酯、乳酸的使用可以提升白葡萄球菌粉胞壁酸的含量，但是乳酸无法灭活白葡萄球菌，而β-丙内酯虽然可以灭活但价格太昂贵。对比例5灭活温度升高至60℃，灭活振荡及静置灭活均只有1小时，白葡萄球菌无法达到灭活效果，且胞壁酸含量明显降低；对比例6甲醛含量仅0.02％，无法达到灭活效果。而实施例1至实施例6灭活剂中含有0.1～0.3wt％甲醛，60～80wt％乳酸时，能够灭活白葡萄球菌，且能够很好地保障抗原免疫原性和胞壁酸含量稳定。从实施例2和实施例4可以看出，适当提高乳酸的使用量可以一定程度上增加胞壁酸的含量，可能是因为胞壁酸是一种阴离子多糖聚合物，由氨基葡萄糖的C3与乳酸C2以醚键相连接而形成的产物。乳酸含量的提升增加了与氨基葡萄糖C3位上的反应，进而使得胞壁酸含量得到提升，提高了白葡萄球菌的镇咳效果。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用灭活剂进行白葡萄球菌灭活的方法，其特征在于，所述灭活剂为甲醛和乳酸的混合水溶液，其中甲醛的浓度为0.1～0.3wt%，乳酸的浓度为60～80wt%；该灭活方法，包括如下步骤：
（1）将白葡萄球菌菌体与所述灭活剂混合，得到加入灭活剂后的菌体；每100g所述白葡萄球菌菌体中加入所述灭活剂的体积大于或等于150mL；
（2）将步骤（1）所述加入灭活剂后的菌体在30～40℃下搅拌2～24h，得到搅拌完成后的菌液；所述搅拌，其搅拌速度为150～250rpm；
（3）将步骤（2）所述搅拌完成后的菌液静置灭活2～24h，得到灭活后的白葡萄球菌菌液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醛的浓度为0.1～0.2wt%，乳酸的浓度为70～80wt%。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：
（4）将灭活后的白葡萄球菌菌液进行浓缩获得灭活菌体，并对灭活菌体进行洗涤和真空冷冻干燥，制得白葡萄球菌菌粉。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述白葡萄球菌菌体的制备方法包括如下步骤：将发酵后的白葡萄球菌菌液进行浓缩，得到所述白葡萄球菌菌体，其中，所述白葡萄球菌菌体的湿重与灭活后最终制得的白葡萄球菌菌粉的干重之比为（3～8）：1。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将发酵后的白葡萄球菌菌液通过加入絮凝剂絮凝，待菌体沉淀下来后去除上清液，得到所述白葡萄球菌菌体；或者将发酵后的白葡萄球菌菌液通过离心分离，去除上清液，得到所述白葡萄球菌菌体。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述搅拌，其搅拌速度为180～250rpm，搅拌时间为2～3h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述静置灭活时间为2～6h。
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