CN116034872B - 一种贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，通过使用无菌镊子在超净工作台内将贺兰山女蒿组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织和不定芽与正常组织分离开来，转移到去玻璃化的培养基中进行组织培养。待部分玻璃化愈伤组织和不定芽恢复正常状态后，再转移至相同培养基中继续培养，最后将生长良好的再生苗取出放入生根培养基中进行生根培养。应用本技术可以使贺兰山女蒿组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化，再经继代培养形成正常的再生植株。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法。
背景技术
贺兰山女蒿(Hippolytia alashanensis)是菊科女蒿属的植物，具有较强的耐旱、耐寒、耐瘠薄性，为我国特有植物，主要分布在甘肃、内蒙古、宁夏等地，生长于海拔1900米至2250米的地区，多生长于石缝、草原、山坡或荒漠草原。其开花期的粗蛋白质含量较高，粗纤维含量较低，无氟浸出物较高，是冬季荒漠草原放牧场上的重要饲用植物。在对贺兰山女蒿组培快繁的研究中发现其具有较好的再生能力，容易诱导出愈伤组织并分化出大量不定芽，但是分化出的不定芽及无菌苗叶片出现肿胀、皱缩以及水浸半透明状等玻璃化现象，这不仅造成了人力，物力、财力的浪费，也阻碍了后续大规模育苗及其开发利用。因此十分有必要开展对其组培苗去玻璃化技术的研究。
玻璃化是外植体在组织培养过程中常见的现象，属于植物组织培养三大难题之一。目前，对玻璃化产生的原因，尚未形成统一定论。多数学者认为，可能是由于在高浓度激素以及高湿度的条件下植物形成的生理性病变，是对胁迫的一种适应性反应。现阶段克服玻璃化的措施主要有降低6-BA浓度、增加渗透剂或固化剂的浓度以及加强自然光照，改善培养容器的通风换气条件等措施，但这些办法都不能完全杜绝玻璃化现象的发生，也不能挽救玻璃化组织。
发明内容
本发明目的是提供一种贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽的去玻璃化方法以解决背景技术中存在的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，包括以下步骤：
（1）贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽处理：在超净工作台内将贺兰山女蒿组织培养过程中产生的不定芽与正常组织分离开，分成适宜大小，转移至去玻璃化培养基上进行组织培养，直至玻璃化愈伤组织和不定芽恢复正常状态，期间若组培瓶内水份过多，可以更换组培瓶，操作同上；
（2）处理后的愈伤组织和不定芽培养：将步骤（1）将恢复正常状态的贺兰山女蒿愈伤组织和不定芽在超净台内转移至相同的去玻璃化培养基上继续培养25-30天，之后将生长状态良好的再生苗转移到生根培养基中培养；
（3）如果在后续培养过程中贺兰山女蒿的愈伤组织和不定芽再次出现玻璃化迹象，重复步骤（1）和（2）；
在本发明中，所述培养条件为温度(25±2)℃，相对湿度为60％，光照时间14 h/d，光强为1500~2000 lx。
所述去玻璃化培养基成分如下：4.43g/L MS培养基，30g/L蔗糖，0.25 mg/L 6-BA，0.01 mg/L NAA，7.5g/L琼脂，余量为蒸馏水，培养基的PH调整为5.8-5.9。
所述生根培养基成分如下：1/2 MS培养基，30g/L蔗糖，0.3 mg/L NAA，7.0g/L琼脂，余量为蒸馏水，培养基的PH调整为5.8-5.9。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化方法，该方法无需增加任何特殊培养成分，也不需要增加其它专用设备，操作简便，效果显著。经过培养的贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽在恢复正常状态之后，能够正常生长最终形成完整的植株。这对于提高贺兰山女蒿的再生效率以及后续开发利用方面具有重要的意义。应用本技术可以使贺兰山女蒿组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化，再经继代培养形成正常的再生植株。
附图说明
本发明的贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化过程状态显示图，其中：
图1：玻璃化贺兰山女蒿愈伤组织和不定芽；
图2：玻璃化贺兰山女蒿愈伤组织和不定芽去玻璃化状态图；
图3：去玻璃化贺兰山女蒿愈伤组织和不定芽继代培养状态图；
图4：去玻璃化的贺兰山女蒿愈伤组织和不定芽生根培养状态图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步说明。本发明所涉及的术语：6-BA为6-苄基腺嘌呤；NAA为萘乙酸；MS基本培养基为4.43g/L；1/2MS培养基是在MS培养基的基础上，将其中大量元素和钙盐减少为全量的1/2；本发明实施例所用的试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
一种贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化方法，按下述步骤处理：
（1）贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽处理：在超净工作台内将贺兰山女蒿组织培养过程中产生的玻璃化不定芽与正常组织分离开，用无菌镊子分成适宜大小，转移到去玻璃化培养基上进行组织培养，去玻璃化培养基的成分为：4.43g/L MS培养基，30g/L蔗糖，0.25 mg/L 6-BA，0.01 mg/L NAA，7.5g/L琼脂，余量为蒸馏水，将培养基的PH调整为5.8-5.9。之后将其放置于温度为(25±2)℃，相对湿度为60％，光照时间14 h/d，光强为1500~2000 lx的组培室内进行培养，直至玻璃化愈伤组织和不定芽恢复正常状态，期间，若组培瓶内水份过多，可以更换组培瓶，操作同上；
（2）处理后的愈伤组织和不定芽培养：将步骤（1）中恢复正常状态的贺兰山女蒿愈伤组织和不定芽在超净台内转移至上述步骤（1）相同的培养基上继续培养25-30天，组培室的培养条件为温度为(25±2)℃，相对湿度为60％，光照时间14 h/d，光强为1500~2000 lx；
（3）生根培养：将生长状态良好的芽或芽丛在无菌条件下，切分为单个芽后，转移到生根培养基中诱导生根。生根培养基成分为：1/2 MS基本养基，30g/L蔗糖，0.3 mg/LNAA，7.0g/L琼脂，余量为蒸馏水，培养基的PH调整为5.8-5.9，最后放置于温度为(25±2)℃，相对湿度为60％，光照时间14 h/d，光强为1500~2000 lx的组培室内进行培养；
（4）如果在后续培养过程中贺兰山女蒿的愈伤组织和不定芽再次出现玻璃化迹象，重复步骤（1）和（2）。
将玻璃化的贺兰山女蒿愈伤组织和不定芽按照本发明所述培养方法进行培养后，可以将玻璃化组培苗逆转为正常组织，再经过继代培养和生根培养后，最终能够形成完整的植株，实验结果证明了该方法是真实有效的。
Claims (2)
1.一种贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽处理：在超净工作台内将贺兰山女蒿组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织和不定芽与正常组织分离开，分成适宜大小，转移至去玻璃化培养基上进行组织培养，直至玻璃化愈伤组织和不定芽恢复正常状态；
（2）处理后的愈伤组织和不定芽培养：将步骤（1）中恢复正常状态的贺兰山女蒿愈伤组织和不定芽在超净台内转移至相同培养基上继续培养25-30 天后，将生长状态良好的再生苗转移到生根培养基中培养；
（3）如果在后续培养过程中贺兰山女蒿的愈伤组织和不定芽再次出现玻璃化迹象，重复步骤（1）和（2）；其中，
步骤（1 ）中，所述的去玻璃化培养基成分如下：4.43g/L MS 培养基，30g/L 蔗糖，0.25mg/L 6-BA，0.01 mg/L NAA，7.5g/L 琼脂，余量为蒸馏水，培养基的pH 值为5.8-5.9；步骤（1）培养条件为温度(25±2)℃，相对湿度为60％，光照时间14 h/d，光强为1500~2000 lx；
步骤（2）中，所述的生根培养基成分如下：1/2 MS 培养基，30g/L 蔗糖，0.3 mg/LNAA，7.0g/L 琼脂，余量为蒸馏水，培养基的PH 调整为5.8-5.9。
2.根据权利要求1所述的一种贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，其特征在于，按下述步骤处理：
（1）贺兰山女蒿玻璃化愈伤组织和不定芽处理：在超净工作台内将贺兰山女蒿组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织和不定芽与正常组织分离开，用无菌镊子分成适宜大小，转移到去玻璃化培养基上进行组织培养，去玻璃化培养基的成分为：4.43g/L MS 培养基，30g/L 蔗糖，0.25 mg/L 6-BA，0.01 mg/L NAA，7.5g/L 琼脂，余量为蒸馏水，将培养基的PH 调整为5.8-5.9，之后将其放置于温度为(25±2)℃，相对湿度为 60％，光照时间 14 h/d，光强为1500~2000 lx 的组培室内进行培养，直至玻璃化愈伤组织和不定芽恢复正常状态，期间，若组培瓶内水分过多，更换组培瓶，操作同上；
（2）处理后的愈伤组织和不定芽培养：将步骤（1）中恢复正常状态的贺兰山女蒿愈伤组织和不定芽在超净台内转移至上述步骤（1）相同的培养基上继续培养25-30 天，组培室的培养条件为温度为(25±2)℃，相对湿度为60％，光照时间14 h/d，光强为1500~2000 lx；
（3）生根培养：将生长状态良好的芽或芽丛在无菌条件下，切分为单个芽后，转移到生根培养基中诱导生根，生根培养基成分为：1/2 MS 基本培养基，30g/L 蔗糖，0.3 mg/LNAA，7.0g/L琼脂，余量为蒸馏水，培养基的PH 调整为5.8-5.9，最后放置于温度为(25±2)℃，相对湿度为60％，光照时间14 h/d，光强为1500~2000 lx 的组培室内进行培养；
（4）如果在后续培养过程中贺兰山女蒿的愈伤组织和不定芽再次出现玻璃化迹象，重复步骤（1）和（2）。
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| GR01 | Patent grant | ||
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