CN113287524A - 一种三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，属于植物脱毒技术领域。所公开的具体步骤包括：(1)对三叶青无菌苗进行预培养；(2)切取经步骤(1)预培养后的三叶青无菌苗茎尖，进行分化培养，得到三叶青幼苗；(3)切取步骤(2)所得三叶青幼苗的茎尖，先利用浓度为50～60％的PVS2溶液对茎尖进行装载，再利用含有纳米碳酸钙的PVS2溶液对茎尖进行脱水，将装有PVS2溶液和茎尖的容器超低温冷冻；(4)将经步骤(3)超低温冷冻后的茎尖化冻，再进行恢复培养，得到三叶青脱毒苗。采用本发明所提供的玻璃化超低温疗法脱毒方法处理后的三叶青茎尖不仅成活率高，成活的幼苗脱毒率也高。

Description

一种三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法
技术领域
本发明涉及植物脱毒技术领域，特别涉及一种三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法。
背景技术
三叶青(Raidxe Tetrastigmae)又名金线吊葫芦，为葡萄科植物三叶崖爬藤(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的草质藤本。全草均可入药，以地下块根的药用效果最好。其主要成分为黄酮类、酚酸类、三萜类、甾类和二苯乙烯类等。药理活性研究表明，三叶青具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗炎、镇痛、解热、保肝等多种生物活性。临床上用于治疗高热惊厥、腹痛、肺炎、哮喘、肝炎等症，在民间有着广泛的应用。
在三叶青的种植过程中，病毒类病害已成为三叶青高产优产的严重障碍，目前已知的潜伏在三叶青中的病毒为烟草花叶病毒(TMV)，因此，如何从根本上消除三叶青烟草花叶病的危害，培育出优质的脱毒苗，已成为本领域亟待解决的技术问题。
玻璃化超低温疗法脱毒是将植物组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，由于已分化的成熟细胞含有大液泡，自由水含量较高，在超低温环境中能形成破坏细胞膜结构导致细胞死亡的树状冰晶，所以经液氮超低温处理后，含有病毒的成熟细胞死亡，不含病毒的顶端分生组织存活下来，经过后续培养形成无病毒植株。但目前该方法仍存在处理后的植物组织成活率低，及病毒清除率低的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，通过对玻璃化超低温疗法脱毒进行进一步的优化，使处理后的三叶青茎尖不仅成活率高，成活的幼苗脱毒率也高。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，包括以下步骤：
(1)对三叶青无菌苗进行预培养；
(2)切取经步骤(1)预培养后的三叶青无菌苗茎尖，进行分化培养，得到三叶青幼苗；
(3)切取步骤(2)所得三叶青幼苗的茎尖，先利用浓度为50～60％的PVS2溶液对茎尖进行装载，再利用含有纳米碳酸钙的PVS2溶液对茎尖进行脱水，将装有PVS2溶液和茎尖的容器超低温冷冻；
(4)将经步骤(3)超低温冷冻后的茎尖化冻，再进行恢复培养，得到三叶青脱毒苗；
步骤(1)中所述预培养的温度为40±2℃。
优选的，步骤(1)中所述预培养的光照强度为1800～2000Lux，光照时间为11～13h·d-1，预培养时间为6～8d。
优选的，步骤(2)和步骤(3)中切取的茎尖长度均为0.4～0.6mm。
切取的茎尖长度过短，后期恢复培养时不易成活，长度过长，则会导致脱毒不彻底。
优选的，步骤(2)中所述PVS2溶液为：含体积分数为30％甘油、15％乙二醇和15％DMSO的0.4M的蔗糖溶液。
优选的，步骤(3)中所述纳米碳酸钙的粒径为10～30nm，PVS2溶液中纳米碳酸钙的含量为0.3～0.6g/L。
优选的，步骤(3)中所述装载的时间为18～20min；步骤(3)中所述脱水的温度为20～25℃，时间为25～30min；步骤(3)中所述超低温冷冻为将所述脱水后的茎尖置于液氮中冷冻。
优选的，步骤(4)中所述化冻的温度为38～40℃，时间为2～4min。
优选的，步骤(4)中所述恢复培养为先将化冻后的茎尖暗培养5～7d，再转入光周期培养。
优选的，步骤(1)中所述预培养的培养基为：含有6-BA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L的MS培养基；步骤(2)中所述分化培养的培养基为：含有6-BA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L的MS培养基；步骤(4)中所述恢复培养的培养基为：含有CPPU 1.0mg/L、6-BA 0.1mg/L和GA31.0mg/L的WPM培养基。
本发明的有益技术效果如下：
本发明采用先将三叶青无菌苗进行预培养和分化培养的方式，减少三叶青无菌苗中的TMV病毒，其中，预培养采用的温度为40±2℃，在该温度下既可以保证三叶青无菌苗的生长，又可以破坏三叶青无菌苗中的TMV的蛋白质外壳，达到脱毒的效果。
玻璃化超低温疗法脱毒之所以会导致处理后的植物组织成活率低，原因在于低温处理过程中难以避免对植物组织产生破坏，影响其成活率。本发明采用在超低温处理的过程中加入纳米碳酸钙，加入的纳米碳酸钙能够改变PVS2溶液的冰晶形成状况，减少对三叶青茎尖未分化细胞的伤害，达到提高三叶青茎尖恢复培养成活率的效果。
采用本发明所提供的玻璃化超低温疗法脱毒方法对三叶青无菌苗进行处理，处理后的三叶青茎尖不仅成活率高，成活的幼苗脱毒率也高。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。
另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明实施例及对比例中所用的纳米碳酸钙的粒径为10～30nm；PVS2溶液为：含体积分数为30％甘油、15％乙二醇和15％DMSO的0.4M的蔗糖溶液。
实施例1
三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的步骤如下：
(1)无菌苗培养：取经检测带有TMV三叶青带芽茎段，用水冲洗干净，在无菌条件下用0.1％的氯化汞溶液浸泡30min，再转入次氯酸钠溶液中消毒，消毒后用无菌水进行冲洗，利用无菌纸吸干三叶青带芽茎段表面的水分，转入含有6-BA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L的MS培养基中，在光照强度为2000Lux，光照时间为12h·d-1，温度为25±1℃的条件下培养5d，得到三叶青无菌苗。
(2)预培养：将步骤(1)培养得到的三叶青无菌苗在光照强度为2000Lux，光照时间为12h·d-1，温度为40±2℃的条件下继续培养7d，培养基为含有6-BA 1.0mg/L和NAA0.5mg/L的MS培养基。
(3)分化培养：切取经步骤(2)预培养后的三叶青无菌苗茎尖(长度为0.4～0.6mm)，在含有6-BA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L的MS培养基中进行分化培养，得到三叶青幼苗，培养条件为：光照强度2000Lux，光照时间12h·d-1，温度25±1℃，培养时间30d。
(4)超低温玻璃化：切取步骤(2)所得三叶青幼苗的茎尖200段(长度为0.4～0.6mm)，装入冷冻管中，先加入浓度为50％的PVS2溶液对茎尖装载20min，用移液枪移除装载液，再加入含0.5g/L纳米碳酸钙的PVS2溶液在25℃下对茎尖进行脱水25min后，密封冷冻管，投入液氮中进行冷冻；
(5)恢复培养：冷冻管冷冻1d后取出，在40℃的水浴条件下化冻3min，取出茎尖，用1.2M的壳聚糖溶液洗涤，接入培养基(含有CPPU 1.0mg/L、6-BA 0.1mg/L和GA31.0mg/L的WPM培养基)中，先暗培养7d(温度25±1℃)，再转入光周期(光照强度2000Lux，光照时间12h·d-1，温度25±1℃)培养30d，观察培养情况，茎尖培养为完整的植株计为成活，否则计为死亡。
实施例2
三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的步骤如下：
(1)无菌苗培养：取经检测带有TMV三叶青带芽茎段，用水冲洗干净，在无菌条件下用0.1％的氯化汞溶液浸泡30min，再转入次氯酸钠溶液中消毒，消毒后用无菌水进行冲洗，利用无菌纸吸干三叶青带芽茎段表面的水分，转入含有6-BA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L的MS培养基中，在光照强度为2000Lux，光照时间为12h·d-1，温度为25±1℃的条件下培养5d，得到三叶青无菌苗。
(2)预培养：将步骤(1)培养得到的三叶青无菌苗在光照强度为1800Lux，光照时间为13h·d-1，温度为40±2℃的条件下继续培养8d，培养基为含有6-BA 1.0mg/L和NAA0.5mg/L的MS培养基。
(3)分化培养：切取经步骤(2)预培养后的三叶青无菌苗茎尖(长度为0.4～0.6mm)，在含有6-BA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L的MS培养基中进行分化培养，得到三叶青幼苗，培养条件为：光照强度2000Lux，光照时间12h·d-1，温度25±1℃，培养时间30d。
(4)超低温玻璃化：切取步骤(2)所得三叶青幼苗的茎尖200段(长度为0.4～0.6mm)，装入冷冻管中，先加入浓度为50％的PVS2溶液对茎尖装载19min，用移液枪移除装载液，再加入含0.3g/L纳米碳酸钙的PVS2溶液在25℃下对茎尖进行脱水25min后，密封冷冻管，投入液氮中进行冷冻；
(5)恢复培养：冷冻管冷冻1d后取出，在40℃的水浴条件下化冻3min，取出茎尖，用1.2M的壳聚糖溶液洗涤，接入培养基(含有CPPU 1.0mg/L、6-BA 0.1mg/L和GA31.0mg/L的WPM培养基)中，先暗培养5d(温度25±1℃)，再转入光周期(光照强度2000Lux，光照时间12h·d-1，温度25±1℃)培养30d，观察培养情况，茎尖培养为完整的植株计为成活，否则计为死亡。
实施例3
三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的步骤如下：
(1)无菌苗培养：取经检测带有TMV三叶青带芽茎段，用水冲洗干净，在无菌条件下用0.1％的氯化汞溶液浸泡30min，再转入次氯酸钠溶液中消毒，消毒后用无菌水进行冲洗，利用无菌纸吸干三叶青带芽茎段表面的水分，转入含有6-BA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L的MS培养基中，在光照强度为2000Lux，光照时间为12h·d-1，温度为25±1℃的条件下培养5d，得到三叶青无菌苗。
(2)预培养：将步骤(1)培养得到的三叶青无菌苗在光照强度为2000Lux，光照时间为12h·d-1，温度为40±2℃的条件下继续培养6d，培养基为含有6-BA 1.0mg/L和NAA0.5mg/L的MS培养基。
(3)分化培养：切取经步骤(2)预培养后的三叶青无菌苗茎尖(长度为0.4～0.6mm)，在含有6-BA 1.0mg/L和NAA 0.5mg/L的MS培养基中进行分化培养，得到三叶青幼苗，培养条件为：光照强度2000Lux，光照时间12h·d-1，温度25±1℃，培养时间30d。
(4)超低温玻璃化：切取步骤(2)所得三叶青幼苗的茎尖200段(长度为0.4～0.6mm)，装入冷冻管中，先加入浓度为50％的PVS2溶液对茎尖装载18min，用移液枪移除装载液，再加入含0.6g/L纳米碳酸钙的PVS2溶液在20℃下对茎尖进行脱水30min后，密封冷冻管，投入液氮中进行冷冻；
(5)恢复培养：冷冻管冷冻1d后取出，在38℃的水浴条件下化冻3min，取出茎尖，用1.2M的壳聚糖溶液洗涤，接入培养基(含有CPPU 1.0mg/L、6-BA 0.1mg/L和GA31.0mg/L的WPM培养基)中，先暗培养6d(温度25±1℃)，再转入光周期(光照强度2000Lux，光照时间12h·d-1，温度25±1℃)培养30d，观察培养情况，茎尖培养为完整的植株计为成活，否则计为死亡。
对比例1
与实施例1相比，步骤(4)中切取的三叶青无菌苗茎尖长度为0.2～0.4mm，其他条件与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，步骤(4)中对茎尖进行脱水时使用不含纳米碳酸钙的PVS2溶液，其他条件与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，省略步骤(2)，直接对步骤(1)所得三叶青无菌苗的茎尖进行后续处理。
对比例4
与实施例1相比，步骤(2)中的培养温度调整为25±1℃，其他条件与实施例1相同。
记录实施例1～3及对比例1～4恢复培养的结果，并利用荧光定量PCR的检测方法测定成活的茎尖中是否含有TMV病毒，计算恢复培养后茎尖的成活率和脱毒率，结果见表1。
成活率的计算公式为：成活率(％)＝茎尖成活数/200×100％；
脱毒率的计算公式为：脱毒率(％)＝不带病毒的茎尖数/茎尖成活数×100％。
表1
Figure BDA0003135296550000081
从表1中可以看出，对比例1的成活率明显低于实施例1，说明切取的茎尖长度过短不利于三叶青植株成活；对比例2的成活率及脱毒率均低于实施例1，说明加入的纳米碳酸钙能够在三叶青茎尖的超低温玻璃化过程中起到保护作用；对比例3的脱毒率最低，说明预培养阶段对三叶青的脱毒率影响最为明显；对比例4的脱毒率低于实施例1组，说明适当提高预培养的温度能够增加三叶青的脱毒率。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)对三叶青无菌苗进行预培养；
(2)切取经步骤(1)预培养后的三叶青无菌苗茎尖，进行分化培养，得到三叶青幼苗；
(3)切取步骤(2)所得三叶青幼苗的茎尖，先利用浓度为50～60％的PVS2溶液对茎尖进行装载，再利用含有纳米碳酸钙的PVS2溶液对茎尖进行脱水，将装有PVS2溶液和茎尖的容器超低温冷冻；
(4)将经步骤(3)超低温冷冻后的茎尖化冻，再进行恢复培养，得到三叶青脱毒苗；
步骤(1)中所述预培养的温度为40±2℃。
2.根据权利要求1所述的三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，其特征在于，步骤(1)中所述预培养的光照强度为1800～2000Lux，光照时间为11～13h·d-1，预培养时间为6～8d。
3.根据权利要求1所述的三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中切取的茎尖长度均为0.4～0.6mm。
4.根据权利要求1所述的三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，其特征在于，步骤(2)中所述PVS2溶液为：含体积分数为30％甘油、15％乙二醇和15％DMSO的0.4M的蔗糖溶液。
5.根据权利要求1所述的三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，其特征在于，步骤(3)中所述纳米碳酸钙的粒径为10～30nm，PVS2溶液中纳米碳酸钙的含量为0.3～0.6g/L。
6.根据权利要求1所述的三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，其特征在于，步骤(3)中所述装载的时间为18～20min；步骤(3)中所述脱水的温度为20～25℃，时间为25～30min；步骤(3)中所述超低温冷冻为将所述脱水后的茎尖置于液氮中冷冻。
7.根据权利要求1所述的三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，其特征在于，步骤(4)中所述化冻的温度为38～40℃，时间为2～4min。
8.根据权利要求1所述的三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，其特征在于，步骤(4)中所述恢复培养为先将化冻后的茎尖暗培养5～7d，再转入光周期培养。
9.根据权利要求1所述的三叶青玻璃化超低温疗法脱毒的方法，其特征在于，步骤(1)中所述预培养的培养基为：含有6-BA1.0mg/L和NAA0.5mg/L的MS培养基；步骤(2)中所述分化培养的培养基为：含有6-BA1.0mg/L和NAA0.5mg/L的MS培养基；步骤(4)中所述恢复培养的培养基为：含有CPPU1.0mg/L、6-BA0.1mg/L和GA31.0mg/L的WPM培养基。
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