CN113170733A - 萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的培养基及方法，通过使用无菌镊子在超净工作台内将萱草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织和不定芽与正常组织分离开来，转移所述培养基中进行组织培养。待玻璃化组织恢复正常状态后，转移至分化培养基(愈伤组织)或伸长培养基(不定芽)中继续培养。本发明可直接用于萱草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织或不定芽去玻璃化，再经继代培养可以形成正常的再生植株；本发明的优点在于针对萱草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织和不定芽能够有效去玻璃化的同时，无需增加任何特殊培养成分，也不需要增加其它专用设备，操作简便，效果显著。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的培养基及方法。
背景技术
萱草属多年生宿根草本，其种类繁多，花色丰富艳丽，适应性强，一次栽植，可供多年观赏，在城市绿化中常作为首选观赏性植物引进栽培。
植物组织培养是研究植物基因功能的有效途径，目前已经有很多关于萱草组织培养以及转基因的报道，但玻璃化是外植体在组织培养过程中常见的现象，属于植物组织培养三大难题之一。萱草组织培养过程中的玻璃化问题也十分严峻，亟待解决。
玻璃化现象是植物组织培养过程中特有的一种生理性病变，指在植物组织培养过程中，部分试管苗出现生长异常，组织呈现透明或半透明的水渍状，芽苗矮小肿胀失绿，叶片皱缩成纵向卷伸，脆弱易碎，又称过度水化现象。玻璃化组织常表现出分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗。目前玻璃化形成机理研究主要集中在水势过高的影响、生长调节剂平衡问题和矿质元素平衡供应问题三个方面，普遍认为是培养环境中各方面因子的共同作用导致植物组织新陈代谢紊乱，从而造成玻璃化现象的出现。现有解决办法主要有降低6-BA浓度和增加培养固化剂(琼脂或植物凝胶)的浓度，但这些办法都不能完全杜绝玻璃化现象的发生，也不能从根本上挽救玻璃化组织。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的培养基及方法，直接用于萱草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织或不定芽去玻璃化，效果显著，原玻璃化的萱草愈伤组织或不定芽经过该方法处理后，再经继代培养可以继续分化或伸长，形成正常的再生植株，无需增加任何特殊培养成分，也不需要增加其它专用设备就可促使玻璃化萱草愈伤组织和不定芽逆转成为正常组织。
为了实现上述目的，本发明提供的一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的培养基，包括1mg/L NAA 1000ul，与2.37g MS粉末、30g蔗糖、4.5g琼脂和2g活性炭粉末。
优选地，所述培养基的PH值为5.8；
优选地，萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，包括如下步骤：
步骤1：萱草玻璃化愈伤组织和不定芽处理：当正常培养的分化培养基上出现玻璃化的萱草愈伤组织或不定芽时，使用无菌镊子在超净工作台内将玻璃化部分与正常组织分离开来，如果玻璃化愈伤组织体积较大，应分成适宜大小，并从培养基上取出，转移至培养基上进行组织培养，直至玻璃化组织恢复正常状态，期间若瓶内水份过多，可以更换组培瓶，操作同上；
步骤2：处理后的愈伤组织及不定芽培养：将步骤1处理后恢复正常状态的萱草愈伤组织或不定芽在超净台内转移至分化培养基或伸长培养基上继代培养，5-8天后，原玻璃化萱草愈伤组织或不定芽即可正常分化或伸长；
步骤3：如果经过步骤2培养处理的去玻璃化萱草愈伤组织和不定芽在继代培养过程中再次出现玻璃化现象，重复步骤1和2；
优选地，所述步骤1中培养条件为温度(25±2)℃，相对湿度为50％-70％，光强为25001x，光照时间为16h/d；
优选地，所述步骤2中分化培养基成分如下：4.74g MS无机盐，30g/L蔗糖，2mg/L6BA，0.5mg NAA，4.5g/L琼脂，余量为水，PH 5.8；
优选地，所述步骤2中伸长培养基成分如下：4.74g MS无机盐，30g/L蔗糖，2mg/L6BA，1mg/L 2，4-D，0.3mg NAA，4.5g/L琼脂，余量为水，PH 5.8。
本发明提供的一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的培养基及方法，具有如下有益效果：
本发明针对萱草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织和不定芽能够有效去玻璃化的同时，无需增加任何特殊培养成分，也不需要增加其它专用设备，操作简便，效果显著。经过处理的萱草玻璃化愈伤组织和不定芽不仅可以有效去玻璃化恢复成正常状态，也能在原本的培养基中继续分化或伸长，最终形成完整植株。本发明对于萱草组织培养和萱草转基因具有重要的实际意义和广泛的应用前景，可以大大提高组织培养的成苗率，为促进萱草愈伤组织形成的研究积累了宝贵材料，有利于萱草植物组织培养技术和转基因育种工作的研究。
附图说明
图1为本发明的玻璃化萱草愈伤组织和不定芽处理过程状态显示图，。
图中：
A：玻璃化萱草愈伤组织和不定芽；
B：玻璃化萱草愈伤组织和不定芽经本发明所述处理5d；
C：玻璃化萱草愈伤组织和不定芽经本发明所述处理10d。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容。
如图1所示，为本发明提供的一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的培养基及方法，包括1mg/L NAA 1000ul，与2.37g MS粉末、30g蔗糖、4.5g琼脂和2g活性炭粉末。培养基通过用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调整PH至5.8。
其中，1mg/L NAA的配制方法为：取50mg NAA粉末溶于5ml 1mol/L NaOH溶液，震荡完全溶解后，用蒸馏水定容至50ml，得到1mg/L NAA。
1mol/L NaOH的配制方法：40g NaOH固体溶于400ml去离子水中，得到1MNaOH溶液。
1mol/L HCL的配制方法：43ml 36％浓盐酸溶于467ml去离子水中，得到1mol/LHCL溶液。
培养基的配制方法：取1mg/L NAA 1000ul，与2.37g MS粉末和30g蔗糖一同溶于1L去离子水，搅拌均匀，用1mol/LNaOH和1mol/L HCl调整PH至5.8，添加4.5g琼脂和2g活性炭粉末；121℃高温灭菌20min；灭菌完成后取出培养基，待培养基冷却后摇匀，无菌条件下分装培养基至灭菌的空置的干燥组培瓶中，每个组培瓶50ml培养基，培养基凝固后，封口膜包裹组培瓶，常温黑暗保存。
萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，包括如下步骤：
步骤1：萱草玻璃化愈伤组织和不定芽处理：当正常培养的分化培养基上出现玻璃化的萱草愈伤组织或不定芽时，使用无菌镊子在超净工作台内将玻璃化部分与正常组织分离开来，如果玻璃化愈伤组织体积较大，应分成适宜大小，并从培养基上取出，转移至培养基上进行组织培养，直至玻璃化组织恢复正常状态，期间若瓶内水份过多，可以更换组培瓶，操作同上；
步骤2：处理后的愈伤组织及不定芽培养：将步骤1处理后恢复正常状态的萱草愈伤组织或不定芽在超净台内转移至分化培养基或伸长培养基上继代培养，5-8天后，原玻璃化萱草愈伤组织或不定芽即可正常分化或伸长；
步骤3：如果经过步骤2培养处理的去玻璃化萱草愈伤组织和不定芽在继代培养过程中再次出现玻璃化现象，重复步骤1和2；
步骤1中培养条件为温度(25±2)℃，相对湿度为50％-70％，光强为25001x，光照时间为16h/d；
步骤2中分化培养基成分如下：4.74g MS无机盐，30g/L蔗糖，2mg/L 6BA，0.5mgNAA，4.5g/L琼脂，余量为水，PH 5.8；
步骤2中伸长培养基成分如下：4.74g MS无机盐，30g/L蔗糖，2mg/L 6BA，1mg/L 2，4-D，0.3mg NAA，4.5g/L琼脂，余量为水，PH 5.8。
实验证明，将玻璃化的萱草愈伤组织和不定芽在本发明所述培养基中组织培养1-7天后，逆转为正常组织，并经过正常培养后可以形成完整植株。证明了该方法是真实有效的。
本发明所用试剂耗材：
称量纸(上海泰坦科技股份有限公司，10×10cm)
镊子(上海三友外科器材有限公司)
MS培养基(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，货号HB8469-5)
活性炭(上海泰坦科技股份有限公司，货号P1413341)
NAA粉末(上海泰坦科技股份有限公司，货号P1180598)
琼脂(北京索莱宝科技有限公司，货号310C023)
蔗糖(上海泰坦科技股份有限公司，货号P1718451)
氢氧化钠NaOH(国药集团化学试剂有限公司)
盐酸HCL(国药集团化学试剂有限公司)
PH酸度测定仪(上海仪电科学仪器股份有限公司，货号02220128)
组培瓶(上海泰坦科技股份有限公司)。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的培养基，其特征在于，包括1mg/L NAA1000ul，与2.37g MS粉末、30g蔗糖、4.5g琼脂和2g活性炭粉末。
2.根据权利要求1所述的一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的培养基，其特征在于，所述培养基的PH值为5.8。
3.一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：萱草玻璃化愈伤组织和不定芽处理：当正常培养的分化培养基上出现玻璃化的萱草愈伤组织或不定芽时，使用无菌镊子在超净工作台内将玻璃化部分与正常组织分离开来，将玻璃化愈伤组织分成适宜大小，并从培养基上取出，转移至培养基上进行组织培养，直至玻璃化组织恢复正常状态，期间若瓶内水份过多，可以更换组培瓶，操作同上；
步骤2：处理后的愈伤组织及不定芽培养：将步骤1处理后恢复正常状态的萱草愈伤组织或不定芽在超净台内转移至分化培养基或伸长培养基上继代培养，5-8天后，原玻璃化萱草愈伤组织或不定芽即可正常分化或伸长；
步骤3：如果经过步骤2培养处理的去玻璃化萱草愈伤组织和不定芽在继代培养过程中再次出现玻璃化现象，重复步骤1和2。
4.根据权利要求3所述的一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，其特征在于，所述步骤1中培养条件为温度(25±2)℃，相对湿度为50％-70％，光强为25001x，光照时间为16h/d。
5.根据权利要求3所述的一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，其特征在于，所述步骤2中分化培养基成分如下：4.74g MS无机盐，30g/L蔗糖，2mg/L 6BA，0.5mgNAA，4.5g/L琼脂，余量为水，PH 5.8。
6.根据权利要求3所述的一种萱草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，其特征在于，所述步骤2中伸长培养基成分如下：4.74g MS无机盐，30g/L蔗糖，2mg/L 6BA，1mg/L2，4-D，0.3mg NAA，4.5g/L琼脂，余量为水，PH 5.8。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210727 |