CN116023412A - 一种修饰的核苷酸、组合物及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种修饰的核苷酸、组合物及试剂，本发明公开的修饰的核苷酸，只存在一个位置的取代，方便合成；且将修饰的acyTTP应用到质谱SNP的检测中，保证单碱基延伸酶延伸效率的同时，使得产物分子量区分开，提高质谱分辨率，保证结果判读的准确性，本发明公开了一种核酸质谱检测的新思路，对于核酸质谱检测具有重大意义。
Description
发明领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种修饰的核苷酸、组合物及试剂。
发明背景
单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，在人群中发生的频率高于1％，是人类可遗传的变异中最常见的一种，因此，SNP的检测对遗传病的诊断、筛查以及用药等方面有及其重要的指导作用。
目前，SNP检测的方法学主要包含实时荧光PCR法、PCR基因芯片法、PCR电泳法、PCR毛细电泳法分析法、PCR高分辨溶解曲线法、流式荧光杂交法、飞行时间质谱法，焦磷酸测序法、Sanger测序法等。其中，实时荧光PCR法、PCR电泳法、PCR毛细电泳法分析法、PCR高分辨溶解曲线法和流式荧光杂交法的优点在于耗时较短、灵敏度较高，能够实现某些场景下的检测，但因其通量有限，所以无法方便快捷地满足临床对于数十个甚至数百个基因位点的检测需求。基因芯片法、焦磷酸测序法和Sanger测序法，虽然检测较为准确，但检测成本较高，耗时较长，并不是SNP检测的首要选择。而飞行时间质谱法，检测速度快，数据分析简单，通量较高，即弥补了传统方法学的不足，又降低了成本，相比前面几种方法是一种更好的选择，但却存在检测结果不够准确的问题，使其应用的进一步发展受到了限制。
核酸质谱SNP检测主要基于PCR和引物延伸技术，其原理是首先通过PCR引物对待检测SNP位点的目标片段进行扩增，产生的PCR产物经过虾碱性磷酸酶(shrimp alkalinephosphatase,SAP)处理中和残留dNTPs。SAP消化反应结束后，向反应液中加入缓冲液，延伸引物，dideoxynucleotide(ddNTPs)以及单碱基延伸酶等组分进行引物延伸反应。以DNA扩增产物为模板，延伸引物可与待检测SNP位点的5’端结合，延伸一个碱基。引物延伸完成后，向反应液中加入阳性数值进行脱盐处理，去除吸附在核酸片段上的金属离子。脱盐完成后，将样品与基质转移到靶板形成共结晶，通过质谱检测获得谱图。通过计算谱图中产物的分子量与延伸引物的分子量的差值可分析该样品SNP位点的分型。
然而，以ddNTP作为底物时，单碱基延伸酶的结合效率低，延伸效果差，影响谱图结果判断的准确性。另外一种可用于单碱基延伸的核苷酸底物为线性核苷酸(acyclonucleotides，acyNTP)，将dNTP中常见的 2′-deoxyribofuranosyl sugar替换为2-hydroxyethoxymethyl group(如下所示)。DNA聚合酶对于acyNTP的识别效率为普通ddNTP的30倍(参考文献：Gardner,A.,and Jack,W.(2002).Acyclic and dideoxy terminatorpreferences denote divergent sugar recognition by archaeon and Taq DNApolymerases.Nucleic Acids Res.30, 605–613.doi:10.1093/nar/30.2.605)。
发明内容
本发明为了解决核酸质谱SNP检测中因为延伸效果差，带来的检测结果不准确的问题，采用acyNTP 代替传统的ddNTP作为底物,利用分子量差值可分析SNP位点分型的原理，对核苷酸进行修饰，公开了一种修饰的核苷酸，所述核苷酸的结构如下：
其中，X选自烷基；环烷基；-OR1；-SR1；-SO2NH2；-NR1R2和卤素；任选取代的芳基或杂环基；n 为1-12整数；
A选自CH2或O；
所述修饰的核苷酸分子量为474-924Da。
优选的，所述修饰的核苷酸分子量为481-924Da。
现有技术中acyNTP作为底物主要应用于测序，在核酸质谱SNP检测中应用较少。acyNTP作为底物时， acyCTP、acyATP、acyGTP和acyTTP分子量分别为425.12、449.12、465.14、440.10，A/T/C/G四个核苷酸之间分子量的差异如下：
表1核苷酸分子量的差异
| A | T | C | G | |
| A | 0 | -9 | -24 | 16 |
| T | 9 | 0 | -15 | 25 |
| C | 24 | 15 | 0 | 40 |
| G | 16 | -25 | -40 | 0 |
上表，核苷酸之间分子量的差异决定了核酸质谱SNP检测项目需要区分9Da差异的峰信号，然而质谱仪很难有效区分9Da差异的特征峰，尤其在大分子量检测区间如7000Da-12000 Da，从而导致部分SNP 类型无法精准区分，只有分辨率特别好的质谱仪，能够实现9Da的分辨，而普通质谱仪，分子量相差16Da 时，能够轻易且准确的进行区分。所以本发明在acyTTP上进行修饰以改变其分子量，选择分子量474Da 以上，优选481Da以上的核苷酸，保证了单碱基延伸酶对核苷酸底物高效识别的同时，使得各个核苷酸之间分子量可以区分，提高谱图分辨率与结果判读准确率。
核酸质谱利用分子量进行核酸分型，所以当修饰的核苷酸的分子量越大，四个核苷酸底物的分子量相差越大，谱图分辨更容易，所以对修饰的acyTTP上限并没有特别的限定，但考虑到小分子检测，过大的分子量合成困难，成本较高，普通小分子一般选择924Da以下就足够了，本发明分子量控制在924Da以下，所述924Da是通过当A＝O，n＝12时，选择分子量最小的烷基修饰(CH3)，计算得出的。
作为优选，X选自C1-C20烷基，优选C1-C10烷基，进一步优选C3-C10烷基；
作为优选，所述R1，R2独立选自H或C1-C20烷基，优选C1-C10烷基，进一步优选C3-C10烷基；
作为优选，所述芳基为任选取代的苯基，所述苯基取代基为一个或多个，独立选自C1-C10烷基；卤素、 -OR1或-NR1R2；
作为优选，卤素选自：F、Cl、Br或I，更优选Cl、Br或I；
作为优选，所述杂环基选自饱和杂环基，优选5到8元饱和杂环基；例如：四氢呋喃基、吗啉基、哌啶基、哌嗪基；或者所述杂环选自杂芳基，优选5到10元杂芳基，例如呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡啶基、吡喃基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基。所述杂环基独立任选被一个或多个C1-C10烷基；卤素、-OR1或-NR1R2取代。
优选的，本发明式I化合物的举例性的、非限制性的具体实例如下所示：
本发明另一方面公开了一种底物混合物，包括如式I所示化合物。
优选的，所述底物混合物还包括acyATP、acyGTP和acyCTP，结构式依次如下：
另一方面，本发明还公开了一种用于引物延伸的试剂，包含上述底物混合物。
另一方面，本发明还公开了一种用于核酸质谱检测的试剂盒，包含上述用于引物延伸的试剂。
本发明所述acyX-TTP表示：修饰后的核苷酸，即修饰后的acyTTP，其中X代表不同的取代基。
有益效果：
1、本发明公开的修饰的核苷酸，只存在一个位置的取代，方便合成。
2、本发明创造性的将修饰的acyTTP应用到质谱SNP的检测中，保证单碱基延伸酶延伸效率的同时，使得产物分子量区分开，提高质谱分辨率，保证结果判读的准确性。
附图说明：
图1：acy磺酰胺-TTP作为底物检测野生型新冠病毒模拟质粒；
图2：acy磺酰胺-TTP作为底物检测德尔塔突变株模拟质粒
图3：acy磺酰胺-TTP作为底物检测英国突变株模拟质粒；
图4：acy3C-TTP作为底物检测突变位点2027T>A的结果图；
图5：acyTTP和acyBr-TTP单碱基延伸的效果；
图6：引物残留物水品；
图7：acyBr-TTP作为底物检测突变位点1174A>T的结果图；
图8：acyBr-TTP作为底物临床检测质谱图；
图9：acy F-TTP作为底物检测突变位点1174A>T的结果图；
图10：acy F-TTP作为底物临床检测质谱图；
图11:acy-环丁烷甲醚-TTP作为底物检测突变位点rs817826；
图12:6种核苷酸的检测效果图。
具体实施方式：
制备例核苷酸的修饰合成
除了化合物I、II、III的用量以外，所有添加物质的用量均为过量的，不同物质合成的差别在于，得到的产物量不同。
A：当A为O，n＝1时
(1)化合物II的合成
称取30mmol化合物Ⅰ，加入到洁净的250mL三口烧瓶中；加入150mL二氯甲烷后氮气置换三次；氮气保护；体系为非均相；称取阿昔洛韦侧链50mmol，一次性加入到上述三口烧瓶中；体系为非均相；量取7.5mL N,O-双三甲基硅基乙酰胺，一次性加入到上述三口烧瓶中；上述反应混合物室温搅拌过夜；体系仍然为非均相；量取4mL N,O-双三甲基硅基乙酰胺，一次性加入到上述三口烧瓶中；上述反应混合物再次在室温搅拌3小时后，体系变澄清；用冰水浴将反应体系冷却至0℃；量取1.2mL无水四氯化锡，一次性加入到上述三口烧瓶中；不撤冷浴，上述反应混合物自然升温至室温，然后在室温搅拌过夜；将上述反应混合物小心倒入250mL饱和碳酸氢钠水溶液中，用250mL二氯甲烷萃取3 次，合并有机相后用无水硫酸钠干燥旋干；将残余的浅磺色固体用200mL甲基叔丁基醚打浆，得到白色固体；
(2)化合物III的合成
将(1)中合成的化合物II，加入到洁净的250mL单口瓶，用100mL甲醇溶解；氮气置换三次后氮气保护；称量纸称取5.2mmol叔丁醇钠，一次性加入到上述单口烧瓶中；将上述反应混合物室温搅拌过夜后将反应混合物直接旋干，所得残余物分散在50mL乙酸乙酯中，用1N盐酸酸化后，用50mL乙酸乙酯萃取4次，合并有机相后用无水硫酸钠干燥旋干得到白色固体。
(3)化合物IV的合成
称取0.2mmol化合物III，加入到洁净的50mL茄型瓶中；加入2mL无水乙腈后氮气置换三次，氮气保护；称取0.65mmol干燥过的吡啶，一次性加入到上述茄型瓶中；用冰水浴将反应体系冷却至0℃；称取0.3mmol 三氯氧磷，滴加到上述茄型瓶中；不撤冷浴，上述反应混合物在0℃搅拌30分钟后作为溶液A备用；称取 0.55mmol焦磷酸三正丁胺，加入到另一洁净的50mL茄型瓶中；加入2mL无水乙腈后氮气置换三次，氮气保护；量取1.5mL干燥过的三正丁胺，一次性加入到上述茄型瓶中；用冰水浴将反应体系冷却至0℃；将溶液A滴加到上述反应体系中；不撤冷浴，上述反应混合物在0℃搅拌30分钟；量取4mL去离子水，一次性加入到上述反应体系中，室温搅拌2小时；0℃浓缩掉有机溶剂后，残余水溶液用高压制备分离纯化系统 (Pre-HPLC)分离纯化；所得洗脱液冻干后得到白色固体，复溶至1mL冷的去离子水中，-20℃冻存。
可以列举下述结构进行验证。
当n＝1，分子量如表2所示。
表2化合物及质谱结构确认
B：当A为O，n大于1时
需要在上述A的合成步骤中(A：当A为O，n＝1时)加入长链合成的步骤，即在化合物III之后，首先合成长链，再修饰上三磷酸。
所以，化合物I到化合物III与上述步骤相同，当X取代为其他基团时，只需要替换化合物1，不需要更改合成的过程。
化合物III到化合物V，根据n数量的不同，添加不同量的环氧乙烷，控制合成的主要化合物，再通过Pre-HPLC纯化出所需化合物。化合物VI的合成过程与上述A的合成步骤中化合物IV的合成相同，区别在于，化合物IV是取合成的化合物III进行合成，化合物VI是取合成的化合物V进行合成，其余过程均相同。
本实施例以n＝2和n＝5为例。
当n＝2时，除了化合物I、II、III、V的用量以外，所有添加物质的用量均为过量的，不同物质合成的差别在于，得到的产物量不同。
化合物V的合成
称取20mmol化合物III，加入到洁净的100mL水热合成反应釜中，用35mL N,N-二甲基甲酰胺溶解；加入40mmol环氧乙烷后密封；室温搅拌72小时后将反应混合物直接旋干，所得残余物柱层析纯化，然后再用高压制备分离纯化系统(Pre-HPLC)分离纯化，MS确认结构；所得洗脱液冻干后得到白色固体。
根据上述方法，变换不同的X取代基，制备得到一系列化合物VI，结构如表3所示；
表3化合物及质谱结构确认
当n＝5时，系列化合物的合成方法如下：
化合物VII的合成
称取10mmol化合物III，加入到洁净的100mL水热合成反应釜中，用35mL N,N-二甲基甲酰胺溶解；加入60mmol环氧乙烷后密封；室温搅拌72小时后将反应混合物直接旋干，所得残余物柱层析纯化，然后再用高压制备分离纯化系统(Pre-HPLC)分离纯化，MS确认结构；所得洗脱液冻干后得到白色固体。
根据上述方法，变换不同的X取代基，制备得到一系列化合物VIII，结构如表4所示；
表4化合物及质谱结构确认
C：当A为CH2，n＝1时
(1)化合物IX的合成
称取30mmol化合物I，加入到洁净的250mL三口烧瓶中；加入150mL N,N-二甲基甲酰胺后氮气置换三次；氮气保护；冰水浴冷却至0℃，称取65mmol钠氢(60％in oil)分批次加入到反应体系中；加完后升温至70℃搅拌2小时；然后再用冰水浴冷却至0℃；称取35mmol4-溴丁基乙酸酯，滴加到上述反应体系中；加完后室温不撤冷浴，自然升温至室温，室温搅拌48小时；过滤，将滤液40℃水浴高真空旋干后柱层析(二氯甲烷：甲醇＝9:1)，得到白色固体；
(2)化合物X的合成
将步骤(1)中的化合物IX加入到洁净的100mL单口瓶，用50mL甲醇溶解；氮气置换三次后氮气保护；称量纸称取1.5mmol叔丁醇钠，一次性加入到上述单口烧瓶中；将上述反应混合物室温搅拌过夜后将反应混合物直接旋干，所得残余物分散在50mL乙酸乙酯中，用1N盐酸酸化后，用50mL乙酸乙酯萃取4次，合并有机相后用无水硫酸钠干燥旋干得到白色固体。
(3)化合物XI的合成
称取0.25mmol化合物X，加入到洁净的50mL茄型瓶中；加入2mL无水乙腈后氮气置换三次，氮气保护；称取0.65mmol干燥过的吡啶，一次性加入到上述茄型瓶中；用冰水浴将反应体系冷却至0℃；称取0.3mmol三氯氧磷，滴加到上述茄型瓶中；不撤冷浴，上述反应混合物在0℃搅拌30分钟后作为溶液 A备用；称取0.55mmol焦磷酸三正丁胺，加入到另一洁净的50mL茄型瓶中；加入2mL无水乙腈后氮气置换三次，氮气保护；量取1.5mL干燥过的三正丁胺，一次性加入到上述茄型瓶中；用冰水浴将反应体系冷却至0℃；将溶液A滴加到上述反应体系中；不撤冷浴，上述反应混合物在0℃搅拌30分钟；量取4 mL去离子水，一次性加入到上述反应体系中，室温搅拌2小时；0℃浓缩掉有机溶剂后，残余水溶液用高压制备分离纯化系统(Pre-HPLC)分离纯化；所得洗脱液冻干后得到白色固体，复溶至1mL冷的去离子水中，-20℃冻存。
根据上述方法，变换不同的X取代基，制备得到一系列化合物X，结构如表5所示:
表5化合物及质谱结构确认
D：当A为CH2，n大于1时
本制备例以n＝5为例，根据n数量的不同，添加不同量的溴烷基乙酸酯，控制合成的主要化合物，再通
过Pre-HPLC纯化出所需化合物。
具体步骤如下：
(1)化合物XII的合成
称取30mmol化合物I，加入到洁净的250mL三口烧瓶中；加入150mL N,N-二甲基甲酰胺后氮气置换三次；氮气保护；冰水浴冷却至0℃，称取65mmol钠氢(60％in oil)分批次加入到反应体系中；加完后升温至70℃搅拌2小时；然后再用冰水浴冷却至0℃；称取25mmol16-溴十六烷基乙酸酯，滴加到上述反应体系中；加完后室温不撤冷浴，自然升温至室温，室温搅拌48小时；过滤，将滤液40℃水浴高真空旋干后柱层析(二氯甲烷：甲醇＝9:1)，得到白色固体；
(2)化合物XIII的合成
称取2.5mmol化合物XII，加入到洁净的100mL单口瓶，用50mL甲醇溶解；氮气置换三次后氮气保护；称量纸称取1.2mmol叔丁醇钠，一次性加入到上述单口烧瓶中；将上述反应混合物室温搅拌过夜后将反应混合物直接旋干，所得残余物分散在50mL乙酸乙酯中，用1N盐酸酸化后，用50mL乙酸乙酯萃取4次，合并有机相后用无水硫酸钠干燥旋干得到白色固体。
(3)化合物XIV的合成
称取0.15mmol化合物XIII，加入到洁净的50mL茄型瓶中；加入2mL无水乙腈后氮气置换三次，氮气保护；称取0.65mmol干燥过的吡啶，一次性加入到上述茄型瓶中；用冰水浴将反应体系冷却至0℃；称取0.3mmol三氯氧磷，滴加到上述茄型瓶中；不撤冷浴，上述反应混合物在0℃搅拌30分钟后作为溶液A备用；称取0.55mmol焦磷酸三正丁胺，加入到另一洁净的50mL茄型瓶中；加入2mL无水乙腈后氮气置换三次，氮气保护；量取1.5mL干燥过的三正丁胺，一次性加入到上述茄型瓶中；用冰水浴将反应体系冷却至0℃；将溶液A滴加到上述反应体系中；不撤冷浴，上述反应混合物在0℃搅拌30分钟；量取4mL去离子水，一次性加入到上述反应体系中，室温搅拌2小时；0℃浓缩掉有机溶剂后，残余水溶液用高压制备分离纯化系统(Pre-HPLC)分离纯化；所得洗脱液冻干后得到白色固体，复溶至1mL冷的去离子水中，-20℃冻存。
根据上述方法，变换不同的X取代基，制备得到一系列化合物XIV，结构如表6所示；
表6化合物及质谱结构确认
效果例1质谱检测
A：SNP检测试剂盒的组分如下：
(1)提取试剂盒成分：裂解液、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液、蛋白酶K、磁珠溶液。
(2)多重PCR试剂盒组分：扩增反应液(40mM Tris-HCl，800μM dNTP，200nM引物，8mM MgCl2)，扩增酶液。
上述提取试剂盒与多重PCR试剂盒均来自重庆中元汇吉生物技术有限公司。
(3)虾碱性磷酸酶(SAP酶)处理体系：1μL 45mM Tris-HCl，1μL 2U/μL SAP酶，1μL水。
(4)延伸反应体系：4μl单碱基延伸反应液(45mM Tris-HCl，16μM单碱基延伸引物，0.6mM acyNTPs 混合液)，3μl 1U/μL单碱基延伸酶。
B：核酸质谱检测的步骤如下：
(1)样品DNA的提取：使用中元汇吉提取试剂盒成分提取DNA，仪器：中元汇吉全自动核酸提取仪器 EXM6000。
多重PCR反应(表7所示)：
表7 PCR反应体系
| 试剂名称 | 体积(μL) |
| 扩增反应液 | 10 |
| 扩增酶液 | 5 |
| DNA(上述提取的DNA) | 5 |
可以根据实验需求按照比例减少反应体积，以求可通过384PCR板进行高通量检测。将配制好的多重 PCR反应体系上PCR仪进行扩增，PCR扩增反应如表8所示：
表8 PCR扩增反应
PCR扩增完成后进行磷酸酶37℃消化30min，65℃失活5min处理，可以根据实验需求按照比例减少反应体积，以求可通过384PCR板进行高通量检测。
完成消化后，进行单碱基延伸反应。配制延伸反应体系，按照每孔7μl，将延伸反应体系加到经SAP消化处理的产物中，进行反应。
单碱基延伸反应设定如表9所示。
表9单碱基延伸反应
树脂脱盐处理：每反应孔添加树脂20mg和30μl ddH2O。可以根据实验需求按照比例减少树脂与ddH2O 的体积，以求可通过384PCR板进行高通量检测。上述树脂购买自市售产品。盖好反应管(如果用384PCR 板则封好封口膜)，放在旋转器上颠倒摇匀5分钟后短暂离心。
脱盐完成后上机检测，质谱检测的仪器来自重庆中元汇吉EXS3000质谱仪。
当A为O时，检测效果如效果例2-5所示
效果例2-SO2NH2修饰的效果
本效果例验证实施例9的质谱检测效果。
核苷酸结构式具体如下所示：
分子量为505Da，为了方便，命名为acy-磺酰胺-TTP，四个核苷酸的分子量差异如下：
表10四个核苷酸的分子量差异
| A | T | C | G | |
| A | 0 | 56 | -24 | 16 |
| T | -56 | 0 | -80 | -40 |
| C | 24 | 80 | 0 | 40 |
| G | 16 | 40 | -40 | 0 |
可以看出每个核苷酸之间的分子量相差较大。
临床试验：
新冠病毒模拟质粒检测及突变株模拟质粒分型鉴定
本发明利用修饰的核酸底物(acyATP、acyGTP、acyCTP和acy-磺酰胺-TTP 混合液)对新冠病毒质粒进行检测，该序列覆盖新冠病毒S基因上主流突变株的突变位点。
多重扩增引物如SEQ.ID.NO.1-8所示：
SEQ.ID.NO.1：ACGTTGGATGGAGTAAGACCCCTGGACCACCAGC
SEQ.ID.NO.2：ACGTTGGATGCCCAGACCCTAGAATAAGAC
SEQ.ID.NO.3：ACGTTGGATGTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTG
SEQ.ID.NO.4：ACGTTGGATGTTAACAATAAGTAGGGACTG
SEQ.ID.NO.5：ACGTTGGATGACTAATGTCTATGCAGATTC
SEQ.ID.NO.6：ACGTTGGATGCACAAACAGTTGCTGGTGCATGT
SEQ.ID.NO.7：ACGTTGGATGTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATC
SEQ.ID.NO.8：ACGTTGGATGTTTGTGGGTATGGCAATAGAG
单碱基延伸引物序列如如SEQ.ID.NO.9-16所示
SEQ.ID.NO.9：GGTACATGACAAGGTGC
SEQ.ID.NO.10：CTCTTAGTACCATTGGTCCCAGAG
SEQ.ID.NO.11：CAGGGCAAACTGGAA
SEQ.ID.NO.12：GGTAATTTATAATTATAATCAGCAAT
SEQ.ID.NO.13：AGATTAGACTTCCTAAACAATCTATAC
SEQ.ID.NO.14：AAAGTAACAATTAAAACCTT
SEQ.ID.NO.15：GTTGGTAACCAACACCAT
SEQ.ID.NO.16：TAGCTACACTACGTGCCCGCCGA
结果如表11-13和图1-3所示：
表11野生型新冠病毒模拟质粒
| 正确率 | 内标 | HV69-70del | K417T | K417N | L452R | E484K/Q | N501Y | P681R |
| 100％ | √ | ACATGT | K | K | L | E | N | P |
表12德尔塔突变株(B.1.617.2)模拟质粒
| 正确率 | 内标 | HV69-70del | K417T | K417N | L452R | E484K/Q | N501Y | P681R |
| 100％ | √ | ACATGT | K | K | R | Q | N | R |
表13英国突变株(B.1.1.7)模拟质粒
| 正确率 | 内标 | HV69-70del | K417T | K417N | L452R | E484K/Q | N501Y | P681R |
| 100％ | √ | DEL | K | K | L | E | Y | P |
结果显示本发明中的修饰的核酸底物配合试剂盒其他组分可准确检测出新冠病毒，并对主流突变株进行鉴定。
效果例3烷基修饰acyTTP检测效果
本效果例主要探究烷基中CH2数量的影响，因为本发明主要着重于分子量的影响，所以对烷基的结构并无要求，本发明所述烷基可以为直链烷基，可以有支链，可以是异构体。
本效果例选择在本发明的保护的分子量范围之内的，分子量相等，修饰烷基结构不同的两个核苷酸(实施例27-1和实施例27-2)进行效果验证。
核苷酸的结构：
上述核苷酸A和B的分子量均为512Da，为了方便将上述修饰的核苷酸命名为，acy3C-TTP。其中， acyATP、acy3C-TTP、acyCTP、acyGTP四个核苷酸的分子量为：449、512、425、465，acyATP/acy3C-TTP /acyCTP/acyGTP四个核苷酸之间分子量的差异如下：
表14分子量差异
| A | T | C | G | |
| A | 0 | 63 | -24 | 16 |
| T | -63 | 0 | -87 | -47 |
| C | 24 | 87 | 0 | 40 |
| G | 16 | 47 | -40 | 0 |
检测效果
2027T>A是常见的耳聋基因突变位点之一。
本发明分别使用无修饰的核苷酸底物(反应1)与修饰后的核苷酸底物(反应2、3)对受检测样本的 2027T>A位点进行分析。反应2中修饰的acyTTP为本实施例中核苷酸A，反应3中修饰的为本实施例中核苷酸B。
本实施例所述的无修饰的核酸底物为acyATP、acyGTP、acyCTP和acyTTP混合液，修饰的核酸底物为acyATP、acyGTP、acyCTP和acy3C-TTP混合液。
结果如图4所示，结果显示，该分析样本为2027T>A位点的突变基因携带患者，与测序结果保持一致。所述Primer-2027T>A的序列如SEQ.ID.NO.17：accagaaccttaccacccgc所示。
表15突变位点分析
| 反应 | 引物 | 引物分子量(m/z) | 延伸碱基 | 延伸产物分子量 |
| 1 | Primer-2027T>A | 5976.36 | A/T | 6256.27/6247.27 |
| 2 | Primer-2027T>A | 5976.36 | A/acy3C-TTP(A) | 6256.27/6310.23 |
| 3 | Primer-2027T>A | 5976.36 | A/acy3C-TTP(B) | 6256.27/6310.23 |
从图4可以看出，修饰后的acyTTP因为分子量更大，较容易与acyATP分隔开，增加判读的准确性，且分子量相同的acy3C-TTP(A)和acy3C-TTP(B)检测效果相同，可以得出，检测效果主要取决于分子量的差异，与核苷酸本身的结构相关性不大。
效果例4卤素修饰acyTTP的检测效果
(1)本实施例首先探究Br取代X的效果(即实施例2)，本效果例为了方便，将取代之后的acyTTP 命名为acyBr-TTP。
当n＝1时，结构式如下：
分子量505Da。
本效果例中涉及的单碱基延伸引物分子量以及用不同核苷酸底物延伸后的产物分子量如下：
表16 Br修饰acyTTP产物分子量分析
| 分子量(m/z) | |
| Primer1 | 5499.65 |
| Primer1+acy TTP | 5761.82 |
| Primer1+acy Br-TTP | 5826.74 |
上述Primer1的序列为SEQ.ID.NO.18gcagtagcaattatcgtc
检测谱图如图5所示，图5中下方谱图为acyTTP作为单碱基延伸核苷酸进行单碱基延伸的产物结果，图一上方谱图为acy Br-TTP作为单碱基延伸核苷酸进行单碱基延伸的产物结果，可以看出利用acyBr-TTP 代替acyTTP在底物中的作用，既可以实现TTP本身的功能(与A互补配对)，且保证了单碱基延伸酶的结合效率(以引物残留水平--引物峰峰面积/产物峰峰面积--表征单碱基延伸酶的识别结合能力，引物残留水平越低指示单碱基延伸酶识别效率越高)(图6)。
检测效果
检测耳聋基因SLC26A4突变位点1174A>T。1174A>T是最常见的耳聋基因突变位点之一，与大前庭水管综合征及Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)的关系密切。
本发明分别使用无修饰的核苷酸底物(反应1、反应2，两次生物学重复)与修饰后的核苷酸底物(反应3)对受检测样本的1174A>T位点进行分析。
本效果例所述的无修饰的核酸底物为acyATP、acyGTP、acyCTP和acyTTP混合液，修饰的核酸底物为acyATP、acyGTP、acyCTP和acyBr-TTP混合液。
结果如表17和图7所示，结果显示，该分析样本为1174A>T位点的突变基因携带患者，与测序结果保持一致。
表17突变位点分析
| 引物 | 引物分子量(m/z) | 延伸碱基 | 延伸产物分子量 | |
| 反应1/2 | Primer2-1174A>T | 4655.29 | A/T | 4926.25/4917.27 |
| 反应3 | Primer2-1174A>T | 4655.29 | A/Br-TTP | 4926.25/4982.16 |
上述Primer2-1174A>T的序列为SEQ.ID.NO.19：gcctttgggatcagc
当核苷酸底物未经过修饰时，A/T等位基因单碱基延伸产物的分子量差异为9Da，区分度低，在谱图上几乎两个峰叠加在一起，分辨难度较高，对仪器，算法要求高，存在判读错误的可能。而修饰后的核苷酸acy Br-TTP代替acy TTP后，A/T等位基因单碱基延伸产物的分子量差异55.9Da，大大提高判读准确率。
临床实验
本发明利用修饰的核酸底物(acyATP、acyGTP、acyCTP和acyBr-TTP混合液)对受检测样本进行耳聋基因20个SNP位点突变分析。耳聋相关易感基因SNP分型结果见下表18-20及图8：
表18多重扩增引物
表19单碱基延伸引物
| 编号 | 序列 | 位点名称 |
| SEQ.ID.NO.40 | ctccacagtcaagca | 1975G>C |
| SEQ.ID.NO.41 | aatcctgagaagatgt | 1174A>T |
| SEQ.ID.NO.42 | caccactgctctttccc | 1226G>A |
| SEQ.ID.NO.43 | tgttggagtgagatcac | 2027T>A |
| SEQ.ID.NO.44 | cacgaagatcagctgca | 235delC |
| SEQ.ID.NO.45 | gcagtagcaattatcgtc | IVS7-2A>G |
| SEQ.ID.NO.46 | cgtacacaccgcccgtcac | 1494C>T |
| SEQ.ID.NO.47 | acgtggactgctacattgcc | 538C>T |
| SEQ.ID.NO.48 | cagcgtggccactagccca | 281C>T |
| SEQ.ID.NO.49 | cagtgctctcctggacggcc | 1229C>T |
| SEQ.ID.NO.50 | gatgaacttcctcttcttctc | 299_300delAT |
| SEQ.ID.NO.51 | ggattagataccccactatgct | 1095T>C |
| SEQ.ID.NO.52 | tctgtagatagagtatagcatca | 2168A>G |
| SEQ.ID.NO.53 | tgtctgcaacaccctgcagccag | 176_191del16 |
| SEQ.ID.NO.54 | tgccagtgccctgactctgctggtt | 589G>A |
| SEQ.ID.NO.55 | acccctacgcatttatatagaggag | 1555A>G |
| SEQ.ID.NO.56 | aaaacaaatttctagggataaaata | IVS15+5G>A |
| SEQ.ID.NO.57 | gggcacgctgcagacgatcctggggg | 35delG |
| SEQ.ID.NO.58 | ccatgaagtaggtgaagattttcttct | 547G>A |
| SEQ.ID.NO.59 | aaaggacacattctttttga | 2162C>T |
表20耳聋相关易感基因SNP分型
由表20和图8可见，采用本发明提供的引物组能够对耳聋相关易感基因的20个SNP位点进行分型，正确率100％，与基因检测金标准一代测序结果一致。
(2)本效果例接着探究F的取代效果，F是卤族元素中分子量最小的元素，Cl的分子量大于F，两者分子量均大于CH3。但直接取代可能存在并不能完全拉开四种核酸的分子量差距的情况，acyCTP、acyATP、 acyGTP和acyTTP分子量分别为425.12Da、449.12Da、465.14Da、440.10Da，为了方便，将修饰后的核苷酸命名为acyF-TTP和acyCl-TTP。
表21修饰后的acyTTP分子量
| n | acyF-TTP分子量(Da) | acyCl-TTP分子量(Da) |
| 1 | 444.32 | 460.24 |
| 2 | 488.25 | 504.87 |
| 3 | 532.57 | 548.71 |
本发明保护的可以被谱图识别的分子量范围为434-440Da或474-880Da，优选为481-880Da，因为在谱图上相差9Da能勉强分开，但存在识别困难，只有质量较高的质谱可以分开，而相差16Da基本对质谱的要求较低，普通质谱也能识别。
当n＝1时，444Da与460Da均不在本发明选择的可以分辨开的分子量范围之内，因为444Da与acyATP 的分子量较为接近，460Da与acyGTP的分子量比较接近，相差小于9D a,在谱图上难以分开。所以若要选择F或Cl取代，可以选择n＝2以上。
当n＝2时，acy F-TTP结构式如下：
检测效果
检测耳聋基因SLC26A4突变位点1174A>T
本发明分别使用无修饰的核苷酸底物(反应1)与修饰后的核苷酸底物(反应2)对受检测样本的 1174A>T位点进行分析
本效果例所述的无修饰的核酸底物为acyATP、acyGTP、acyCTP和acyTTP，修饰的核酸底物为acyATP、 acyGTP、acyCTP和acy I-TTP
表22突变位点分析
| 引物 | 引物分子量(m/z) | 延伸碱基 | 延伸产物分子量 | |
| 反应1 | Primer2-1174A>T | 4655.29 | A/T | 4926.25/4917.27 |
| 反应2 | Primer2-1174A>T | 4655.29 | A/acy F-TTP | 4926.25/4965.18 |
结果如图9所示，修饰前的核苷酸T和A在谱图上十分接近，难以区分，而修饰后的核苷酸acy F-TTP 代替acy TTP后，A/T等位基因单碱基延伸产物的分子量差异39Da，大大提高判读准确率。
临床试验
所用多种PCR引物序列和单碱基延伸引物序列与上述(1)中临床试验中，所用相同。
表23耳聋相关易感基因SNP分型
| 位点名称 | 临床样本2 |
| 1975G>C | G |
| 1174A>T | A |
| 1226G>A | G |
| 2027T>A | T |
| 235delC | C/DEL |
| IVS7-2A>G | A |
| 1494C>T | C |
| 538C>T | C |
| 281C>T | C |
| 1229C>T | C |
| 2162C>T | C |
| 299_300delAT | AT |
| 1095T>C | T |
| 2168A>G | A |
| 176_191del16 | GCTGCAAGAACGTGTG |
| 589G>A | G |
| 1555A>G | A |
| IVS15+5G>A | G |
| 35delG | G |
| 547G>A | G |
由表23和图10可见，采用本发明提供的引物组能够对耳聋相关易感基因的20个SNP位点进行分型，正确率100％，与基因检测金标准一代测序结果一致。
效果例5 NR1修饰的效果
本效果例列举核苷酸的结构如下：
分子量为509.24，比本实施例中(1)中的核苷酸的分子量更大，所以四种核苷酸之间的差值肯定是更大的，为了方便命名为acy-环己酰胺-TTP
检测效果
rs817826单核苷酸多态性位点是可以判定前列腺高危人群的易感SNP位点，对于前列腺高位人群的筛查是十分重要的位点。
rs817826碱基为T/C，其序列通过http://genome.uscs.edu/数据库获得。
本发明分别使用无修饰的核苷酸底物(反应1)与修饰后的核苷酸底物(反应2)对受检测样本的rs817826 位点进行分析。
结果如图11所示，结果显示，该分析样本为rs817826位点的基因分型，与测序结果保持一致。
多重PCR引物序列：
SEQ.ID.NO.60：acgttggatg cactttatcc tcctagtgaa
SEQ.ID.NO.61：acgttggatg accgttgaga cttgagtag
单碱基延伸引物：
SEQ.ID.NO.62：cccctctaca gaggccctag taaa
表24突变位点分析
| 反应 | 引物 | 引物分子量(m/z) | 延伸碱基 | 延伸产物分子量 |
| 1 | Primer-rs817826 | 7266.83 | C/T | 7461.45/7476.67 |
| 2 | Primer-rs817826 | 7266.83 | C/acy-环己酰胺-TTP | 7461.45/7546.04 |
结果如图11所示，图中上面一条谱图显示的是，修饰后的acy-环己酰胺-TTP作为底物检测突变位点 rs817826的检测效果；图中底部谱线显示的是，未修饰的acyTTP作为底物检测突变位点rs817826的检测效果。结果显示，修饰后的acy-环己酰胺-TTP与acyCTP分隔更开，在谱图上判读更加容易。
效果例6当A为CH2的效果验证
本效果例探究将A从O替换为CH2对检测效果的影响
因为本发明保护的核苷酸种类较多，不能做到在实施例中完全列举，所以本效果例通过研究以下几个结构式，进行说明。
本效果例中涉及的单碱基延伸引物分子量以及用不同核苷酸底物延伸后的产物分子量与效果例4中相同
表25延伸产物分子量
| 分子量(m/z) | |
| Primer1 | 5499.65 |
| Primer1+acy TTP | 5761.82 |
| Primer1+acy I-TTP | <![CDATA[5873.73/5871.68(O/CH<sub>2</sub>)]]> |
| Primer1+acy 3F-TTP | <![CDATA[5831.02/5829.05(O/CH<sub>2</sub>)]]> |
| acy乙酸乙酯-TTP | <![CDATA[5823.07/5821.12(O/CH<sub>2</sub>) ]]> |
(1)
分子量分别为552和550，命名为acy I-TTP
(2)
分子量分别为510和508，命名为acy 3F-TTP
(3)
分子量分别为502和500，命名为acy苯-TTP
结果如图12所示，图中谱线1、2、3、4、5、6分别代表的是acy I-TTP(A)、acy I-TTP(B)、acy 3F-TTP(A)、acy 3F-TTP(B)、acy苯-TTP(A)、acy苯-TTP(B)作为底物检测突变位点1174A>T 的结果图。
从图中可以看出，就分子量而言，A为O或CH2相差并不大，所以在谱图上相隔较近，但相对于acyTTP 而言，分子量相差越大，越能够在谱图上分隔开。
序列表
<110> 中元汇吉生物技术股份有限公司
<120> 一种修饰的核苷酸、组合物及试剂
<130> 2021.9.15
<160> 62
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 1
acgttggatg gagtaagacc cctggaccac cagc 34
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 2
acgttggatg cccagaccct agaataagac 30
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 3
acgttggatg tgccactagt ctctagtcag tg 32
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 4
acgttggatg ttaacaataa gtagggactg 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 5
acgttggatg actaatgtct atgcagattc 30
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 6
acgttggatg cacaaacagt tgctggtgca tgt 33
<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 7
acgttggatg ttctaaccag gttgctgttc tttatc 36
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 8
acgttggatg tttgtgggta tggcaataga g 31
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 9
ggtacatgac aaggtgc 17
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 10
ctcttagtac cattggtccc agag 24
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 11
cagggcaaac tggaa 15
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 12
ggtaatttat aattataatc agcaat 26
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 13
agattagact tcctaaacaa tctatac 27
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 14
aaagtaacaa ttaaaacctt 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 15
gttggtaacc aacaccat 18
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 16
tagctacact acgtgcccgc cga 23
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 17
accagaacct taccacccgc 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 18
gcagtagcaa ttatcgtc 18
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 19
gcctttggga tcagc 15
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 20
acgttggatg aagtggcttt aacatatctg aacacacaat a 41
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 21
acgttggatg tcagagcggt caagttgaaa tctc 34
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 22
acgttggatg tgcttgctta cccagactca gagaagtc 38
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 23
acgttggatg tctccccctt gatgaacttc ctctt 35
<210> 24
<211> 33
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 24
acgttggatg gctcatcatt gagttcctct tcc 33
<210> 25
<211> 33
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 25
acgttggatg ctccccagcc tccaccagct tgt 33
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 26
acgttggatg tttgacagtt gttcaagaaa gagagccttt g 41
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 27
acgttggatg cccaggaaga gaactctaag gaag 34
<210> 28
<211> 39
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 28
acgttggatg actatgatag acactgcagc tagagatac 39
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 29
acgttggatg tgatgataag tgagccttaa taagtggg 38
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 30
acgttggatg gcattatttg gttgacaaac aaggaatt 38
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 31
acgttggatg gaacaccaca ctcaccccct 30
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 32
acgttggatg gtaggatcgt tgtcatccag tctcttcct 39
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 33
acgttggatg tgttgccatt cctcgacttg ttc 33
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 34
acgttggatg ggagtgaaga ttcttagatt ttccag 36
<210> 35
<211> 32
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 35
acgttggatg ctattcctga ttggacccca gt 32
<210> 36
<211> 32
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 36
acgttggatg gaacgttccc aaagtgccaa tc 32
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 37
acgttggatg gaaaaccaga accttaccac ccgc 34
<210> 38
<211> 32
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 38
acgttggatg gcaatgcggg ttctttgacg ac 32
<210> 39
<211> 38
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 39
acgttggatg ggaaccttga ccctcttgag atttcact 38
<210> 40
<211> 15
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 40
ctccacagtc aagca 15
<210> 41
<211> 16
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 41
aatcctgaga agatgt 16
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 42
caccactgct ctttccc 17
<210> 43
<211> 17
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 43
tgttggagtg agatcac 17
<210> 44
<211> 17
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 44
cacgaagatc agctgca 17
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 45
gcagtagcaa ttatcgtc 18
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 46
cgtacacacc gcccgtcac 19
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 47
acgtggactg ctacattgcc 20
<210> 48
<211> 19
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 48
cagcgtggcc actagccca 19
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 49
cagtgctctc ctggacggcc 20
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 50
gatgaacttc ctcttcttct c 21
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 51
ggattagata ccccactatg ct 22
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 52
tctgtagata gagtatagca tca 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 53
tgtctgcaac accctgcagc cag 23
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 54
tgccagtgcc ctgactctgc tggtt 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 55
acccctacgc atttatatag aggag 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 56
aaaacaaatt tctagggata aaata 25
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 57
gggcacgctg cagacgatcc tggggg 26
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 58
ccatgaagta ggtgaagatt ttcttct 27
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 59
aaaggacaca ttctttttga 20
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 60
acgttggatg cactttatcc tcctagtgaa 30
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 61
acgttggatg accgttgaga cttgagtag 29
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 62
cccctctaca gaggccctag taaa 24
Claims (10)
1.修饰的核苷酸，所述核苷酸的结构如式I所示：
其中，X选自烷基；环烷基；-OR1；-SR1；-SO2NH2；-NR1R2和卤素；任选取代的芳基或杂环基；
n为1-12整数；
A选自CH2或O；
所述修饰的核苷酸分子量为474-924Da，优选的，所述修饰的核苷酸分子量为481-924Da。
2.如权利要求1所述的核苷酸，其特征在于，X选自C1-C20烷基，优选C1-C10烷基，进一步优选C3-C10烷基。
3.如权利要求1所述的核苷酸，其特征在于，所述R1，R2独立选自H或C1-C20烷基，优选C1-C10烷基，进一步优选C3-C10烷基。
4.如权利要求1所述的核苷酸，其特征在于，所述芳基为任选取代的苯基，所述苯基取代基为一个或多个，独立选自C1-C10烷基；卤素、-OR1或-NR1R2；
作为优选，卤素选自：F、Cl、Br或I，更优选Cl、Br或I。
5.如权利要求1所述的核苷酸，其特征在于，所述杂环基选自饱和杂环基，优选5到8元饱和杂环基；例如：四氢呋喃基、吗啉基、哌啶基、哌嗪基；或者所述杂环选自杂芳基，优选5到10元杂芳基，例如呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡啶基、吡喃基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基。所述杂环基独立任选被一个或多个C1-C10烷基；卤素、-OR1或-NR1R2取代。
6.如权利要求1-5任意一项所述的核苷酸，其特征在于，本发明式I化合物的举例性的、非限制性的具体实例如下所示：
7.一种底物混合物，包括如式I所示化合物。
8.如权利要求7所述的底物混合物，其特征在于，还包括所述底物混合物还包括acyATP、acyGTP和acyCTP，结构式如下：
9.一种用于引物延伸的试剂，包含权利要求7或8所述的底物混合物。
10.一种用于核酸质谱检测的试剂盒，包含权利要求9所述的用于引物延伸的试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111239609.0A CN116023412A (zh) | 2021-10-25 | 2021-10-25 | 一种修饰的核苷酸、组合物及试剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111239609.0A CN116023412A (zh) | 2021-10-25 | 2021-10-25 | 一种修饰的核苷酸、组合物及试剂 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116023412A true CN116023412A (zh) | 2023-04-28 |
Family
ID=86072838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111239609.0A Pending CN116023412A (zh) | 2021-10-25 | 2021-10-25 | 一种修饰的核苷酸、组合物及试剂 |
Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN116023412A (zh) |
-
2021
- 2021-10-25 CN CN202111239609.0A patent/CN116023412A/zh active Pending
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