CN113943324B - 一种修饰的核苷酸,组合物及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域,具体涉及一种修饰的核苷酸,组合物及试剂,本发明公开的修饰的核苷酸,可以在两个位置分别或同时取代,选择范围广,且将修饰的acyATP应用到质谱SNP的检测中,保证单碱基延伸酶延伸效率的同时,使得产物分子量区分开,提高质谱分辨率,保证结果判读的准确性,本发明公开了一种核酸质谱检测的新思路,对于核酸质谱检测具有重大意义。
Description
发明领域
本发明涉及生物检测领域,具体涉及一种修饰的核苷酸,组合物及试剂。
发明背景
单核苷酸多态性(SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性,在人 群中发生的频率高于1%,是人类可遗传的变异中最常见的一种,因此,SNP的检测对遗传病的诊断、筛 查以及用药等方面有及其重要的指导作用。
目前,SNP检测的方法学主要包含实时荧光PCR法、PCR基因芯片法、PCR电泳法、PCR毛细电泳 法分析法、PCR高分辨溶解曲线法、流式荧光杂交法、飞行时间质谱法,焦磷酸测序法、Sanger测序法等。 其中,实时荧光PCR法、PCR电泳法、PCR毛细电泳法分析法、PCR高分辨溶解曲线法和流式荧光杂交 法的优点在于耗时较短、灵敏度较高,能够实现某些场景下的检测,但因其通量有限,所以无法方便快捷 地满足临床对于数十个甚至数百个基因位点的检测需求。基因芯片法、焦磷酸测序法和Sanger测序法,虽 然检测较为准确,但检测成本较高,耗时较长,并不是SNP检测的首要选择。而飞行时间质谱法,检测速度快,数据分析简单,通量较高,即弥补了传统方法学的不足,又降低了成本,相比前面几种方法是一种 更好的选择,但却存在检测结果不够准确的问题,使其应用的进一步发展受到了限制。
核酸质谱SNP检测主要基于PCR和引物延伸技术,其原理是首先通过PCR引物对待检测SNP位点 的目标片段进行扩增,产生的PCR产物经过虾碱性磷酸酶(shrimp alkalinephosphatase,SAP)处理中和残 留dNTPs。SAP消化反应结束后,向反应液中加入缓冲液,延伸引物,dideoxynucleotide(ddNTPs)以及 单碱基延伸酶等组分进行引物延伸反应。以DNA扩增产物为模板,延伸引物可与待检测SNP位点的5’ 端结合,延伸一个碱基。引物延伸完成后,向反应液中加入阳性数值进行脱盐处理,去除吸附在核酸片段 上的金属离子。脱盐完成后,将样品与基质转移到靶板形成共结晶,通过质谱检测获得谱图。通过计算谱 图中产物的分子量与延伸引物的分子量的差值可分析该样品SNP位点的分型。
然而,以ddNTP作为底物时,单碱基延伸酶的结合效率低,延伸效果差,影响谱图结果判断的准确性。 另外一种可用于单碱基延伸的核苷酸底物为线性核苷酸(acyclonucleotides,acyNTP),将dNTP中常见的 2′-deoxyribofuranosyl sugar替换为2-hydroxyethoxymethyl group(如图1)。DNA聚合酶对于acyNTP的识别效率为普通ddNTP的30倍(参考文献:Gardner,A.,and Jack,W.(2002).Acyclic and dideoxy terminatorpreferences denote divergent sugar recognition by archaeon and Taq DNApolymerases.Nucleic Acids Res.30,605–613.doi:10.1093/nar/30.2.605)。
发明内容
本发明为了解决核酸质谱SNP检测中因为延伸效果差,带来的检测结果不准确的问题,采用acyNTP 代替传统的ddNTP作为底物,利用分子量差值可分析SNP位点分型的原理,对核苷酸进行修饰,公开了一 种修饰的核苷酸,所述核苷酸的结构如下:
其中X1和X2相同或不同,各自独立选自H,C1-C20烷基、C3-C10环烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、 芳基、杂芳基或杂环基;
所述C1-C20烷基、C3-C10环烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、芳基、杂芳基或杂环基任选被取代基取 代或未取代;
所述取代基为一个或多个,各自独立选自氨基、卤素、羟基或巯基;
n为1-12整数;
A选自CH2或O;
所述修饰的核苷酸分子量为474-933Da。
优选的,所述修饰的核苷酸分子量为481-933Da。
现有技术中acyNTP作为底物主要应用于测序,在核酸质谱SNP检测中应用较少。acyNTP作为底物时, acyCTP、acyATP、acyGTP和acyTTP分子量分别为425.12、449.12、465.14、440.1。
其中acyATP与acyTTP核苷酸之间分子量的差异为9Da然而质谱仪很难有效区分9Da差异的特征峰, 尤其在大分子量检测区间如7000Da-12000 Da,从而导致部分SNP类型无法精准区分,只有分辨率特别好 的质谱仪,能够实现9Da的分辨,而普通质谱仪,分子量相差16Da时,能够轻易且准确的进行区分。所 以本发明在acyATP上进行修饰以改变其分子量,选择分子量474Da以上,优选481Da以上的核苷酸, 保证了单碱基延伸酶对核苷酸底物高效识别的同时,使得各个核苷酸之间分子量可以区分,提高谱图分辨 率与结果判读准确率。
核酸质谱利用分子量进行核酸分型,所以当修饰的核苷酸的分子量越大,四个核苷酸底物的分子量相 差越大,谱图分辨更容易,所以对修饰的acyTTP上限并没有特别的限定,但考虑到小分子检测,过大的 分子量合成困难,成本较高,普通小分子一般选择933Da以下就足够了。本发明分子量控制在933Da以 下,所述933Da是通过当A=O,n=12时,X1和X2为H时,计算得出的。
作为优选,所述烷基选自C1-C10的直链或支链的取代或未取代的烷基;所述烷基可被氨基、卤素、羟 基或巯基取代;
作为优选,所述烯基选自C2-C8的直链或支链的取代或未取代的烯基;所述烯基可被卤素取代;
作为优选,所述炔基选自C2-C5的直链或支链的取代或未取代的炔基;所述炔基可被羟基取代;
作为优选,所述芳基选自取代或未取代的苯基;所述苯基可被氨基或卤素取代;
作为优选,所述杂芳基选自作为优选优选5到10元杂芳基,例如,呋喃基、吡咯基、噻吩基、吡唑 基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、吡啶基、吡喃基、哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基;
作为优选,所述杂环基选自饱和杂环基,优选5到8元饱和杂环基;例如:四氢呋喃基、吗啉基、哌 啶基、哌嗪基;
作为优选,所述环烷基选自C3-C8的环烷基;
优选的,本发明式I化合物的举例性的、非限制性的具体实例如下所示:
本发明另一方面公开了一种底物混合物,包括如式I所示化合物。
优选的,所述底物混合物还包括acyTTP、acyGTP和acyCTP,结构式依次如下:
另一方面,本发明还公开了一种用于引物延伸的试剂,包含上述底物混合物。
另一方面,本发明还公开了一种用于核酸质谱检测的试剂盒,包含上述用于引物延伸的试剂。
有益效果:
1、本发明公开的修饰的核苷酸,可以在2位和6位同时或者分别取代,底物选择的范围广,灵活性很强。
2、本发明创造性的将修饰的acyATP应用到质谱SNP的检测中,保证单碱基延伸酶延伸效率的同时,使 得产物分子量区分开,提高质谱分辨率,保证结果判读的准确性。
附图说明:
图1:acy丁炔-ATP作为底物检测突变位点2027T>A的结果图;
图2:acy2-甲基-6-四氢吡咯基ATP作为底物检测突变位点CYP2P19*8-A的结果图;
图3:acy2-甲基-6-四氢吡咯基ATP作为底物临床检测质谱图;
图4:acy-癸烷-ATP(n=5)作为底物检测CD17(A→T)结果图;
图5:6种核苷酸的检测效果图。
具体实施方式:
制备例核苷酸的修饰合成
除了化合物1、2、3的用量以外,所有添加物质的用量均为过量的,不同物质合成的差别在于,得到 的产物量不同。
A:当A为O,n=1时
(1)化合物II的合成
称取30mmol化合物Ⅰ,加入到洁净的250mL三口烧瓶中;加入150mL二氯甲烷后氮气置换三次; 氮气保护;体系为非均相;称取阿昔洛韦侧链50mmol,一次性加入到上述三口烧瓶中;体系为非均 相;量取7.5mL N,O-双三甲基硅基乙酰胺,一次性加入到上述三口烧瓶中;上述反应混合物室温搅 拌过夜;体系仍然为非均相;量取4mL N,O-双三甲基硅基乙酰胺,一次性加入到上述三口烧瓶中;上 述反应混合物再次在室温搅拌3小时后,体系变澄清;用冰水浴将反应体系冷却至0℃;量取1.2mL无 水四氯化锡,一次性加入到上述三口烧瓶中;不撤冷浴,上述反应混合物自然升温至室温,然后在室 温搅拌过夜;将上述反应混合物小心倒入250mL饱和碳酸氢钠水溶液中,用250mL二氯甲烷萃取3 次,合并有机相后用无水硫酸钠干燥旋干;将残余的浅磺色固体用200mL甲基叔丁基醚打浆,得到白色固体;
(2)化合物III的合成
将(1)中合成的化合物II,加入到洁净的250mL单口瓶,用100mL甲醇溶解;氮气置换三次后氮 气保护;称量纸称取5.2mmol叔丁醇钠,一次性加入到上述单口烧瓶中;将上述反应混合物室温搅拌 过夜后将反应混合物直接旋干,所得残余物分散在50mL乙酸乙酯中,用1N盐酸酸化后,用50mL乙酸乙酯萃取4次,合并有机相后用无水硫酸钠干燥旋干得到白色固体。
(3)化合物IV的合成
称取0.2mmol化合物III,加入到洁净的50mL茄型瓶中;加入2mL无水乙腈后氮气置换三次,氮气保 护;称取0.65mmol干燥过的吡啶,一次性加入到上述茄型瓶中;用冰水浴将反应体系冷却至0℃;称取0.3 mmol三氯氧磷,滴加到上述茄型瓶中;不撤冷浴,上述反应混合物在0℃搅拌30分钟后作为溶液A备用; 称取0.55mmol焦磷酸三正丁胺,加入到另一洁净的50mL茄型瓶中;加入2mL无水乙腈后氮气置换三次,氮气 保护;量取1.5mL干燥过的三正丁胺,一次性加入到上述茄型瓶中;用冰水浴将反应体系冷却至0℃;将 溶液A滴加到上述反应体系中;不撤冷浴,上述反应混合物在0℃搅拌30分钟;量取4mL去离子水,一次性加入到上述反应体系中,室温搅拌2小时;0℃浓缩掉有机溶剂后,残余水溶液用高压制备分离纯化系统(Pre-HPLC)分离纯化;所得洗脱液冻干后得到白色固体,复溶至1mL冷的去离子水中,-20℃冻存。 可以列举下述结构进行验证。
当n=1,分子量如表1所示
表1化合物及质谱结构确认
B:当A为O,n大于1时
需要在上述A的合成步骤中(A:当A为O,n=1时)加入长链合成的步骤,即在化合物3之后, 首先合成长链,再修饰上三磷酸。
所以,化合物I到化合物III与上述步骤相同,当X取代为其他基团时,只需要替换化合物1,不需 要更改合成的过程。
化合物III到化合物V,根据n数量的不同,添加不同量的环氧乙烷,控制合成的主要化合物,再通 过Pre-HPLC纯化出所需化合物。化合物VI的合成过程与上述A的合成步骤中化合物IV的合成相同, 区别在于,化合物IV是取合成的化合物III进行合成,化合物VI是取合成的化合物V进行合成,其余 过程均相同。
本实施例以n=5为例。
当n=5,除了化合物I、II、III、V的用量以外,所有添加物质的用量均为过量的,不同物质合成的 差别在于,得到的产物量不同。
化合物V的合成
称取10mmol化合物III,加入到洁净的100mL水热合成反应釜中,用35mL N,N-二甲基甲酰胺溶解; 加入60mmol环氧乙烷后密封;室温搅拌72小时后将反应混合物直接旋干,所得残余物柱层析纯化,然 后再用高压制备分离纯化系统(Pre-HPLC)分离纯化;所得洗脱液冻干后得到白色固体。
根据上述方法,变换不同的X取代基,制备得到一系列化合物VI,结构如表2所示:
表2化合物及质谱结构确认
C:当A为CH2,n=1时
除了化合物I、VI、VII的用量以外,所有添加物质的用量均为过量的,不同物质合成的差别在于,得 到的产物量不同。
(1)化合物VII的合成
称取30mmol化合物I,加入到洁净的250mL三口烧瓶中;加入150mL N,N-二甲基甲酰胺后氮气置 换三次;氮气保护;冰水浴冷却至0℃,称取65mmol钠氢(60%in oil)分批次加入到反应体系中;加 完后升温至70℃搅拌2小时;然后再用冰水浴冷却至0℃;称取35mmol 4-溴丁基乙酸酯,滴加到上述反应体 系中;加完后室温不撤冷浴,自然升温至室温,室温搅拌48小时;过滤,将滤液40℃水浴高真空旋干 后柱层析(二氯甲烷:甲醇=9:1),得到白色固体;
(2)化合物VIII的合成
将步骤(1)中的化合物VII加入到洁净的100mL单口瓶,用50mL甲醇溶解;氮气置换三次后氮气 保护;称量纸称取1.5mmol叔丁醇钠,一次性加入到上述单口烧瓶中;将上述反应混合物室温搅拌过 夜后将反应混合物直接旋干,所得残余物分散在50mL乙酸乙酯中,用1N盐酸酸化后,用50mL乙酸乙酯萃取4次,合并有机相后用无水硫酸钠干燥旋干得到白色固体。
(3)化合物IX的合成
称取0.25mmol化合物VIII,加入到洁净的50mL茄型瓶中;加入2mL无水乙腈后氮气置换三次, 氮气保护;称取0.65mmol干燥过的吡啶,一次性加入到上述茄型瓶中;用冰水浴将反应体系冷却至0℃; 称取0.3mmol三氯氧磷,滴加到上述茄型瓶中;不撤冷浴,上述反应混合物在0℃搅拌30分钟后作为溶 液A备用;称取0.55mmol焦磷酸三正丁胺,加入到另一洁净的50mL茄型瓶中;加入2mL无水乙腈 后氮气置换三次,氮气保护;量取1.5mL干燥过的三正丁胺,一次性加入到上述茄型瓶中;用冰水浴将反 应体系冷却至0℃;将溶液A滴加到上述反应体系中;不撤冷浴,上述反应混合物在0℃搅拌30分钟; 量取4mL去离子水,一次性加入到上述反应体系中,室温搅拌2小时;0℃浓缩掉有机溶剂后,残余水 溶液用高压制备分离纯化系统(Pre-HPLC)分离纯化;所得洗脱液冻干后得到24.4mg白色固体,复溶至 1mL冷的去离子水中,-20℃冻存。
根据上述方法,变换不同的X取代基,制备得到一系列化合物IX,结构如表3所示:
表3化合物及质谱结构确认
D:当A为CH2,n大于1时
与当A为O的情况不同,当A为CH2时,需要先合成长链,再进行三磷酸修饰。
本实施例以n=5,除了化合物I、X、XI的用量以外,所有添加物质的用量均为过量的,不同物 质合成的差别在于,得到的产物量不同。
具体步骤如下:
(1)化合物X的合成
称取30mmo化合物I,加入到洁净的250mL三口烧瓶中;加入150mL N,N-二甲基甲酰胺后氮气置 换三次;氮气保护;冰水浴冷却至0℃,称取65mmol钠氢钠氢(60%in oil)分批次加入到反应体系中; 加完后升温至70℃搅拌2小时;然后再用冰水浴冷却至0℃;称取25mmol 16-溴十六烷基乙酸酯,滴加 到上述反应体系中;加完后室温不撤冷浴,自然升温至室温,室温搅拌48小时;过滤,将滤液40℃水浴 高真空旋干后柱层析(二氯甲烷:甲醇=9:1),得到白色固体;
(2)化合物XI的合成
称取2.5mmol化合物X,加入到洁净的100mL单口瓶,用50mL甲醇溶解;氮气置换三次后氮气保 护;称量纸称取1.2mmol叔丁醇钠,一次性加入到上述单口烧瓶中;将上述反应混合物室温搅拌过夜后将 反应混合物直接旋干,所得残余物分散在50mL乙酸乙酯中,用1N盐酸酸化后,用50mL乙酸乙酯萃取 4次,合并有机相后用无水硫酸钠干燥旋干得到0.86g白色固体。
(3)化合物XII的合成
称取0.15mmol化合物XI,加入到洁净的50mL茄型瓶中;加入2mL无水乙腈后氮气置换三次,氮 气保护;称取0.65mmol干燥过的吡啶,一次性加入到上述茄型瓶中;用冰水浴将反应体系冷却至0℃; 称取0.3mmol三氯氧磷,滴加到上述茄型瓶中;不撤冷浴,上述反应混合物在0℃搅拌30分钟后作为溶 液A备用;称取0.55mmol焦磷酸三正丁胺,加入到另一洁净的50mL茄型瓶中;加入2mL无水乙腈后 氮气置换三次,氮气保护;量取1.5mL干燥过的三正丁胺,一次性加入到上述茄型瓶中;用冰水浴将反应体系冷却至0℃;将溶液A滴加到上述反应体系中;不撤冷浴,上述反应混合物在0℃搅拌30分钟;量 取4mL去离子水,一次性加入到上述反应体系中,室温搅拌2小时;0℃浓缩掉有机溶剂后,残余水溶液 用高压制备分离纯化系统(Pre-HPLC)分离纯化;所得洗脱液冻干后得到11.4mg白色固体,复溶至1mL 冷的去离子水中,-20℃冻存。
根据上述方法,变换不同的X取代基,制备得到一系列化合物XII,结构如表4所示:
表4化合物及质谱结构确认
效果例1
A:SNP检测试剂盒的组分如下:
(1)提取试剂盒成分:裂解液、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液、蛋白酶K、磁珠溶液。
(2)多重PCR试剂盒组分:扩增反应液(40mM Tris-HCl,800μM dNTP,200nM引物,8mM MgCl2), 扩增酶液。
上述提取试剂盒与多重PCR试剂盒均来自重庆中元汇吉生物技术有限公司。
(3)虾碱性磷酸酶(SAP酶)处理体系:1μL 45mM Tris-HCl,1μL 2U/μL SAP酶,1μL水。
(4)延伸反应体系:4μl单碱基延伸反应液(45mM Tris-HCl,16μM单碱基延伸引物,0.6mM acyNTPs 混合液),3μl 1U/μL单碱基延伸酶。
B:核酸质谱检测的步骤如下:
(1)样品DNA的提取:使用中元汇吉提取试剂盒成分提取DNA,仪器:中元汇吉全自动核酸提取仪器 EXM6000。
多重PCR反应(表5所示):
表5 PCR反应体系
试剂名称 | 体积(μL) |
扩增反应液 | 10 |
扩增酶液 | 5 |
DNA(上述提取的DNA) | 5 |
可以根据实验需求按照比例减少反应体积,以求可通过384PCR板进行高通量检测。将配制好的多重 PCR反应体系上PCR仪进行扩增,PCR扩增反应如表6所示:
表6 PCR扩增反应
PCR扩增完成后进行磷酸酶37℃消化30min,65℃失活5min处理,可以根据实验需求按照比例减 少反应体积,以求可通过384PCR板进行高通量检测。
完成消化后,进行单碱基延伸反应。配制延伸反应体系,按照每孔7μl,将延伸反应体系加到经SAP消 化处理的产物中,进行反应。
单碱基延伸反应设定如表7所示。
表7单碱基延伸反应
树脂脱盐处理:每反应孔添加树脂20mg和30μl ddH2O。可以根据实验需求按照比例减少树脂与ddH2O 的体积,以求可通过384PCR板进行高通量检测。上述树脂购买自市售产品。盖好反应管(如果用384PCR 板则封好封口膜),放在旋转器上颠倒摇匀5分钟后短暂离心。
脱盐完成后上机检测,质谱检测的仪器来自重庆中元汇吉EXS3000质谱仪。
当A为O时,检测效果如效果例2-4所示
效果例2
本效果例列举核苷酸的结构如下:
分子量为501.22,命名为acy丁炔-ATP
2027T>A是SLC26A4基因上的突变,对于婴幼儿耳聋的早期筛查有着重要的意义。
本效果例中涉及的单碱基延伸引物分子量以及用不同核苷酸底物延伸后的产物分子量如下:
表8炔修饰acyATP产物分子量分析
分子量(m/z) | |
Primer1 | 5976.35 |
Primer1+acy ATP/acy TTP | 6256.20/6247.10 |
Primer1+acy丁炔-ATP/acy TTP | 6308.42/6247.10 |
Primer1的序列如SEQ.ID.NO.1:accagaaccttaccacccgc所示。
检测结果如图1所示,当核苷酸底物未经过修饰时,A/T等位基因单碱基延伸产物的分子量差异为9 Da,区分度低,在谱图上几乎两个峰叠加在一起,分辨难度较高,对仪器,算法要求高,存在判读错误的 可能。而修饰后的核苷酸acy丁炔-ATP代替acy ATP后,A/T等位基因单碱基延伸产物的分子量差异61.32 Da,大大提高判读准确率。
临床实验
本发明利用修饰的核酸底物(acy丁炔-ATP、acyGTP、acyCTP和acyTTP混合液)对受检测样本进 行耳聋基因20个SNP位点突变分析。耳聋相关易感基因SNP分型结果见下表9-11:
表9多重扩增引物
表10单碱基延伸引物
/>
表11耳聋相关易感基因SNP分型
/>
由表11可见,采用本发明提供的引物组能够对耳聋相关易感基因的20个SNP位点进行分型,正确率 100%,与基因检测金标准一代测序结果一致。
效果例3
本效果例列举核苷酸的结构如下:
分子量为532.28,为了方便命名为:acy2-甲基-6-四氢吡咯基ATP
检测CYP2P19*8-A突变位点
CYP2P19*8-A是氯吡格雷的突变位点,对血小板代谢用药有重要作用。
Primer2的序列如SEQ.ID.NO.56:GAGAAACGCCGGATCTCCTTCC所示。
表12修饰acyATP产物分子量分析
分子量(m/z) | |
Primer2 | 6680.44 |
Primer2+acy ATP/acy TTP | 6935.55/6926.45 |
Primer2+acy2-甲基-6-四氢吡咯基ATP/acy TTP | 7018.75/6926.45 |
结果如图2所示,核苷酸底物未经过修饰时,A/T等位基因单碱基延伸产物的分子量差异为9Da,区 分度低,在谱图上几乎两个峰叠加在一起,分辨难度较高,对仪器,算法要求高,存在判读错误的可能。而修饰后的核苷酸acy2-甲基-6-四氢吡咯基ATP代替acy ATP后,A/T等位基因单碱基延伸产物的分子量 差异92.30Da,大大提高判读准确率。
临床应用
氯吡格雷(波立维)是一种新型抗血小板药物,广泛应用于急性冠脉综合征、心肌梗死、缺血性脑卒 中以及外周动脉血管疾病等领域。心脏支架手术后的患者需长期服用氯吡格雷以防止支架内再梗。但氯吡 格雷使用过程中,出现较大的个体差异。研究发现约30%的患者不能将氯吡格雷充分代谢成为其活性成分, 因而无法发挥抗血小板作用,其原因和CYP2C19基因有关。
CYP2C19基因负责编码CYP2C19(S-美芬妥英羟化酶),CYP2C19可代谢血小板抑制剂(氯吡格雷), CYP2C19基因突变导致患者体内氯吡格雷代谢的差异,从而疗效不同。CYP2C19基因型检测可判断患者 代谢速率类型,合理调整用药剂量,是提高相关疾病治愈率,减少毒副作用的有效途径。
表13多重PCR扩增引物:
表14单碱基延伸引物
序号 | 序列 | 检测位点 |
SEQ.ID.NO.54 | CCTCTCCCACACAAATCC | CYP2P19*5 |
SEQ.ID.NO.55 | GGACTTGGCCTTACCTGGAT | CYP2P19*3 |
SEQ.ID.NO.56 | GAGAAACGCCGGATCTCCTTCC | CYP2P19*8 |
SEQ.ID.NO.57 | CTTCCTGATCAAAATGGAGAAGG | CYP2P19*7 |
SEQ.ID.NO.58 | GTCTTAACAAGAGGAGAAGGCTTCA | CYP2P19*4 |
SEQ.ID.NO.59 | TTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCC | CYP2P19*2 |
SEQ.ID.NO.60 | GTGGCGCATTATCTCTTACATCAGAGAT | CYP2P19*17 |
表15基因分型
检测位点 | 临床样本分型结果 |
CYP2P19*5 | WT |
CYP2P19*3 | WT |
CYP2P19*8 | WT |
CYP2P19*7 | WT |
CYP2P19*4 | WT |
CYP2P19*2 | WT |
CYP2P19*17 | 纯合突变,*17/*17 |
由表15和图3可见,采用本发明提供的引物组能够对CYP2C19基因突变位点进行分型,正确率100%, 与基因检测金标准一代测序结果一致。
效果例4
本效果例列举核苷酸的结构如下:
/>
分子量为765.63,为了方便命名为acy-癸烷-ATP(n=5)
β地贫基因CD17(A→T)是一种常规的产前检查,通过对孕期母亲及其配偶的筛查,明确是否携带 地贫基因,从而为诊断胎儿是否患有地贫给出参考数据。
本效果例中涉及的单碱基延伸引物分子量以及用不同核苷酸底物延伸后的产物分子量如下:
表16炔修饰acyATP产物分子量分析
分子量(m/z) | |
Primer3 | 5667.80 |
Primer3+acy ATP/acy TTP | 5922.83/5913.83 |
Primer3+acy-癸烷-ATP(n=5)/acy TTP | 6239.46/5913.83 |
的序列如SEQ.ID.NO.61:aacttcatccacgttcacc所示。
结果如图4所示,修饰后的acyATP与acyTTP的分子量相差更大,质谱更容易准确判读。
效果例5
本效果例探究将A从O替换为CH2对检测效果的影响
因为本发明保护的核苷酸种类较多,不能做到在实施例中完全列举,所以本效果例通过研究以下几个结构 式,进行说明。
本效果例中涉及的单碱基延伸引物分子量以及用不同核苷酸底物延伸后的产物分子量与效果例2中相 同。
表17延伸产物分子量
分子量(m/z) | |
Primer1 | 5976.35 |
Primer1+acy ATP | 6256.20 |
Primer1+acy 6-丙烯-Cl-ATP | 6316.73(A)/6314.76(B) |
Primer1+acy2-杂芳环-ATP | 6333.33(A)/6331.36(B) |
Primer1+acy2-羧基6-甲基-ATP | 6314.28(A)/6312.31(B) |
分子量分别为509.63和507.65,命名为acy 6-丙烯-Cl-ATP
分子量分别为526.23和526.26,命名为acy2-杂芳环-ATP
分子量分别为507.18和505.21,命名为acy2-羧基6-甲基-ATP
结果如图5所示,图中谱线1、2、3、4、5、6分别代表的是acy 6-丙烯-Cl-ATP(A)、acy6-丙烯-Cl-ATP (B)、acy2-杂芳环-ATP(A)、acy2-杂芳环-ATP(B)、acy2-羧基6-甲基-ATP(A)、acy2-羧基6-甲基-ATP (B)作为底物检测突变位点2027T>A的结果图。
从图中可以看出,就分子量而言,A为O或CH2相差并不大,所以在谱图上相隔较近,但相对于acyCTP 而言,分子量相差越大,越能够在谱图上分隔开。
序列表
<110> 中元汇吉生物技术股份有限公司
<120> 一种修饰的核苷酸,组合物及试剂
<130> 2021.10.18
<160> 61
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 1
accagaacct taccacccgc 20
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 2
acgttggatg aagtggcttt aacatatctg aacacacaat a 41
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 3
acgttggatg tcagagcggt caagttgaaa tctc 34
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 4
acgttggatg tgcttgctta cccagactca gagaagtc 38
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 5
acgttggatg tctccccctt gatgaacttc ctctt 35
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 6
acgttggatg gctcatcatt gagttcctct tcc 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 7
acgttggatg ctccccagcc tccaccagct tgt 33
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 8
acgttggatg tttgacagtt gttcaagaaa gagagccttt g 41
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 9
acgttggatg cccaggaaga gaactctaag gaag 34
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 10
acgttggatg actatgatag acactgcagc tagagatac 39
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 11
acgttggatg tgatgataag tgagccttaa taagtggg 38
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 12
acgttggatg gcattatttg gttgacaaac aaggaatt 38
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 13
acgttggatg gaacaccaca ctcaccccct 30
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 14
acgttggatg gtaggatcgt tgtcatccag tctcttcct 39
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 15
acgttggatg tgttgccatt cctcgacttg ttc 33
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 16
acgttggatg ggagtgaaga ttcttagatt ttccag 36
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 17
acgttggatg ctattcctga ttggacccca gt 32
<210> 18
<211> 32
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 18
acgttggatg gaacgttccc aaagtgccaa tc 32
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 19
acgttggatg gaaaaccaga accttaccac ccgc 34
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 20
acgttggatg gcaatgcggg ttctttgacg ac 32
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 21
acgttggatg ggaaccttga ccctcttgag atttcact 38
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 22
ctccacagtc aagca 15
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 23
aatcctgaga agatgt 16
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 24
caccactgct ctttccc 17
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 25
tgttggagtg agatcac 17
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 26
cacgaagatc agctgca 17
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 27
gcagtagcaa ttatcgtc 18
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 28
cgtacacacc gcccgtcac 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 29
acgtggactg ctacattgcc 20
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 30
cagcgtggcc actagccca 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 31
cagtgctctc ctggacggcc 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 32
gatgaacttc ctcttcttct c 21
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 33
ggattagata ccccactatg ct 22
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 34
tctgtagata gagtatagca tca 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 35
tgtctgcaac accctgcagc cag 23
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 36
tgccagtgcc ctgactctgc tggtt 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 37
acccctacgc atttatatag aggag 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 38
aaaacaaatt tctagggata aaata 25
<210> 39
<211> 26
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 39
gggcacgctg cagacgatcc tggggg 26
<210> 40
<211> 27
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 40
ccatgaagta ggtgaagatt ttcttct 27
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 41
aaaggacaca ttctttttga 20
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 42
acgttggatg acaggatgaa tgtggtatat attcag 36
<210> 43
<211> 34
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 43
acgttggatg ggagaacagg acacctgttg gtgc 34
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 44
acgttggatg aaggagcata tagtgggcct agg 33
<210> 45
<211> 31
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 45
acgttggatg agcacaagga ccacaaaagg a 31
<210> 46
<211> 31
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 46
acgttggatg tggggatggg gaggatggaa a 31
<210> 47
<211> 34
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 47
acgttggatg cccatcccaa aattccgcag cgtc 34
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 48
acgttggatg taacttgatg gaaaaattga atg 33
<210> 49
<211> 37
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 49
acgttggatg ggctgtctag gcaagactgt agtattc 37
<210> 50
<211> 38
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 50
acgttggatg ccagagcttg gcatattgta tctatacc 38
<210> 51
<211> 38
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 51
acgttggatg gtaaacacaa aactagtcaa tgaatcac 38
<210> 52
<211> 39
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 52
acgttggatg aacagttctt gcatattctg tctgtgcca 39
<210> 53
<211> 36
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 53
acgttggatg taaagttctg taaaatgaag gtcagg 36
<210> 54
<211> 18
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 54
cctctcccac acaaatcc 18
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 55
ggacttggcc ttacctggat 20
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 56
gagaaacgcc ggatctcctt cc 22
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 57
cttcctgatc aaaatggaga agg 23
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 58
gtcttaacaa gaggagaagg cttca 25
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 59
ttttcccact atcattgatt atttccc 27
<210> 60
<211> 28
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 60
gtggcgcatt atctcttaca tcagagat 28
<210> 61
<211> 19
<212> DNA
<213> Synthetic
<400> 61
aacttcatcc acgttcacc 19
Claims (5)
1.一种修饰的核苷酸,其特征在于, 所述修饰的核苷酸选自、/>、、、/> 、或/>。
2.一种底物混合物,包括如权利要求1中所述修饰的核苷酸。
3.如权利要求2所述的底物混合物,其特征在于,所述底物混合物还包括acyTTP、acyGTP和acyCTP,结构式依次如下:
,/>,。
4.一种用于引物延伸的试剂,包含权利要求2或3所述的底物混合物。
5.一种用于核酸质谱检测的试剂盒,包含权利要求4所述的用于引物延伸的试剂。
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