CN116019898A - 环状短肽在制备治疗脑部疾病及炎性疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是环状短肽或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗脑缺血、颅脑损伤、脑出血或炎症性疾病的药物中的应用，所述的环状短肽的氨基酸序列为cyclo(MQCNS)，M和S连接成环。本发明首次公开环状短肽在制备脑缺血、颅脑损伤、脑出血疾病和炎症性疾病药物中的应用。经动物实验证实，环状短肽能够减少脑缺血大鼠脑梗死体积，减少神经损伤，降低颅脑损伤大鼠脑含水量，减轻组织损伤，减少脑出血大鼠的神经损伤，降低脑含水量，减轻角叉菜胶致大鼠足肿胀程度和二甲苯诱发的小鼠耳肿胀度，抑制炎症反应。因此环状短肽具有治疗脑缺血、颅脑损伤、脑出血疾病和抑制炎症反应的功效，具有非常好的市场应用前景。

Description

环状短肽在制备治疗脑部疾病及炎性疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说，是环状短肽在制备治疗脑缺血、颅脑损伤、脑出血和炎症性疾病药物中的应用。

背景技术

脑卒中通常也称为脑中风，是一种由于脑部血管破裂或因血管阻塞导致血液流通障碍，引起脑部缺血、缺氧及脑组织损伤的一种急性脑血管疾病。随着老龄化的加剧，脑卒中的发病率也逐年增高，脑卒中已成为造成过早死亡和疾病负担的首位原因。根据发病原因，可以把脑卒中分为脑缺血和脑出血。

目前临床上脑缺血的治疗仍然局限于血栓溶解和/或手术取栓。血栓溶解和/或手术取栓治疗后，仍然约有三分之二的卒中幸存者存在不同程度的残疾。

脑出血后主要采用手术治疗和止血治疗，常用的手术方法有立体定向术、钻孔及(或)辅以血肿碎吸(包括内镜)或溶解引流术、开颅血肿清除术及脑室引流血肿溶解术，止血药物主要有6-氨基己酸、止血芳酸、抑肽酶以及重组活化因子Ⅶ等。然而，临床缺乏有效的脑出血后促进神经损伤恢复的药物。因此，深入开展脑卒中的药物防治研究具有重要意义。

颅脑损伤是近年来发病率不断上升的一个重要公共卫生问题。跌倒和机动车事故是造成颅脑损伤的两个主要原因。尽管颅脑损伤的总体数量在增加，但是总体的死亡率较低，然而颅脑损伤导致的相关的脑部损伤，并造成残疾的人数在逐年增加。颅脑损伤是外力直接机械损伤后脑组织解剖和功能的综合损伤。到目前为止，还没有有效地治疗颅脑损伤的药物，开发相关新药运用于颅脑损伤的治疗具有非常重要的意义。

当机体受到病原入侵、组织损伤时，炎症反应在抵御病原入侵、修复损伤机体、调整应激反应等方面都发挥重要作用。然而在病理情况下，异常的炎症反应经常导致机体免疫和代谢等生理过程紊乱和组织损伤，诱发局部或全身性炎症相关疾病，引起机体继发的损伤。所以，寻找有效的控制炎症反应，治疗炎症性疾病的药物对于临床治疗炎症性疾病的患者具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供环状短肽在制备治疗脑缺血、颅脑损伤、脑出血和炎症性疾病药物方面中的应用。

环状多肽因其稳定性好，不易被水解，广泛地运用于多肽类药物的研发中。我们在设计合成环状多肽时，偶然发现了一种具有治疗脑缺血、颅脑损伤、脑出血和炎症性疾病作用的环状短肽。这种环状短肽具有治疗脑缺血、颅脑损伤、脑出血和炎症性疾病的效果显著的优点。

本发明的第一方面，提供环状短肽或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗脑缺血、颅脑损伤、脑出血或炎症性疾病的药物中的应用；

所述的环状短肽的氨基酸序列为cyclo(MQCNS)(SEQ ID No.1)，肽链的M和S连接成环，其化学式为C₂₁H₃₄N₆O₈S₂，结构式如式I所示：

进一步的，所述的预防和/或治疗脑缺血的药物为减少脑缺血脑梗死体积，减少神经损伤的药物。

进一步的，所述的预防和/或治疗颅脑损伤的药物为有效减轻脑水肿，减轻组织损伤的药物。

进一步的，所述的预防和/或治疗脑出血的药物为有效地改善脑出血神经损伤，减轻脑水肿的药物。

进一步的，所述的预防和/或治疗炎症性疾病的药物为抑制急性炎症反应，减轻肿胀的药物。

更进一步的，所述的急性炎症反应为病原入侵或组织损伤造成的急性炎症反应。

进一步的，所述的药物以环状短肽或其药学上可接受的盐作为唯一活性成分。

进一步的，所述的环状短肽或其药学上可接受的盐与其他治疗脑缺血或颅脑损伤或脑出血或炎症性疾病药物共同作为活性成分。

进一步的，所述的药物中还包括一种或两种以上制药学上可接受的辅助成分；所述的制药学上可接受的辅助成分为赋形剂、填充剂或稀释剂。

更进一步的，上述药物包括0.01～99.99％的所述的环状短肽或其药学上可接受的盐，以及0.01～99.99％的辅助成分，所述百分比为占所述药物的质量百分比。

进一步的，所述的药物按照药物常规制备方法制备成临床上可接受的药物制剂。

更进一步的，所述的药物制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂。

更进一步的，所述的药物制剂可按剂型通过口服、静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射的途径应用于需要治疗的个体。

在本发明中，所述的环状短肽或其药学上可接受的盐可通过商业购买所得。其中所述其药学上可接受的盐为本领域常规的盐。

本发明优点在于：

1、基于发明人的偶然发现，本发明提供一种以环状短肽或其药学上可接受的盐作为药效成分的治疗脑缺血或颅脑损伤或脑出血或炎症性疾病药物，这种药物具有治疗脑脑缺血、颅脑损伤、脑出血和炎症性疾病的效果显著的优点。

2、本发明提出的环状短肽在制备治疗脑缺血或颅脑损伤或脑出血或炎症性疾病药物中的应用属于首次公开。经脑缺血的动物实验、颅脑损伤动物实验、脑出血动物实验和和抗炎动物实验验证，结果证实，环状短肽能够减少脑缺血大鼠脑梗死体积，减少神经损伤，降低颅脑损伤大鼠脑含水量，减轻组织损伤，减轻脑出血大鼠神经损伤，降低大鼠脑含水量，并能够减轻角叉菜胶致大鼠足肿胀程度和二甲苯诱发的小鼠耳肿胀度，抑制炎症反应。

因此环状短肽可作为治疗脑缺血、颅脑损伤、脑出血和炎症性疾病的药物，具有良好的开发应用前景。

附图说明

图1：TTC染色观察环状短肽对大鼠脑梗死体积的影响。

图2：大鼠脑梗死体积百分比统计。

图3：免疫荧光染色观察环状短肽对缺血大鼠神经损伤的影响。

图4：HE染色观察环状短肽对颅脑损伤大鼠脑组织损伤的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：环状短肽的合成

通过固相合成方法，从C端向N端方向合成短肽，具体步骤如下：

1、氨基去保护

取Fmoc-Ser(tBu)-2-Cl-Trt树脂，用20％哌啶(PIP/DMF)为去保护剂，室温反应25分钟。

2、接入保护氨基酸的活化

取保护氨基酸和HOBt，用DMF溶解后，置于-5℃的环境中冷却30分钟以上；另取DIC，用二氯甲烷溶解后，慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于-5℃的环境中搅拌反应60分钟以上，备用。

3、氨基酸偶联

在去保护后的树脂中加入经活化的第一个保护氨基酸(Met)，偶联至树脂上，洗涤树脂。

脱除第一个氨基酸残基的Fmoc保护，裸露出的活性氨基基团与下一个被Fmoc进行氨基保护的氨基酸(5mg)的羧基相连，形成第一个肽键(Met-Gln)。

按本发明分子结构的氨基酸顺序依次偶联、脱保护循环直至线状短肽的序列合成完毕(MQCNS)。

4、短肽环化

线状短肽偶联完最后一个氨基酸后，将树脂加入1％三氟乙酸的二氯甲烷溶液，洗涤树脂，二异丙基乙胺和三(2-羧乙基)膦酸盐的作用下线性短肽成环。

5、切割树脂

将环肽树脂加入裂解液中，脱去侧链，真空旋蒸除去三氟乙酸，将甲基叔丁基醚加入浓缩液析出固体。析出物经过洗涤后干燥即为环状短肽。

实施例2：环状短肽用于治疗脑缺血的动物实验

线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型是验证药物具有防治脑缺血作用常用的动物模型(刘华,刘月美,等.颈总动脉穿刺法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型.中国实验动物学报,2016,24(004):399-402.)，因此用此模型验证环状短肽对大脑中动脉栓塞大鼠脑缺血的保护作用。

1、动物

健康雄性SD大鼠，体重200～250g，每组10只，共分6组。购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格证号(动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005)。饲养于清洁级动物房。

2、药物

将实验大鼠进行分组：

正常组：正常饲养大鼠，未进行任何处理。

模型组：实施大脑中动脉栓塞模型，给予与药物实验组等量的生理盐水阳性对照组：实施大脑中动脉栓塞模型，给予依达拉奉注射液4.0mg/kg(南京先声东元制药有限公司生产)

低剂量组：实施大脑中动脉栓塞模型，给予环状短肽1.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

中剂量组：实施大脑中动脉栓塞模型，给予环状短肽2.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

高剂量组：实施大脑中动脉栓塞模型，给予环状短肽4.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

3、实验方法

将SD大鼠称重编号，以50mg/kg剂量腹腔注射2％戊巴比妥进行麻醉，待大鼠无疼痛反射后将其仰卧固定在鼠板上，用剪刀沿颈部正中剪开约1cm皮肤暴露皮下组织，用弯镊钝性拨开皮下脂肪及筋膜，暴露颈部肌群，找到二腹肌将其掀开，仔细剥离颈外动脉、颈内动脉和颈总动脉，并在三根动脉下方各穿一根细线。用细线结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，轻轻挑起颈总动脉血管后将线栓插入颈总动脉，轻推线栓使其进入颈内动脉，继续轻推至颅内，待感受到明显的阻力，说明线栓头部已经超过大脑中动脉与前动脉交叉处进入前动脉。将颈内动脉下方的细线结扎来固定线栓防止线栓回退，把多余的细线剪短在伤口上涂抹青霉素防止感染并进行缝合，缝合后将大鼠放暖灯下保暖。从线栓开始阻断大脑中动脉血流开始计时，2h后轻轻拉出线栓看到黑色标记即可实现再灌注。

3.1TTC染色检测脑梗死体积

大鼠脑缺血2h再灌注24h后分组，并连续静脉注射给药3天后以50mg/kg剂量腹腔注射2％戊巴比妥进行麻醉，待动物无自主意识和疼痛感觉后，用剪刀将大鼠腹部剪开，用5ml注射器穿入腹主动脉，收集血液，待收集结束后用止血钳夹住腹主动脉。然后打开胸腔，暴露心脏，用生理盐水进行心脏灌注，先快后满进行灌注，待大鼠上肢和头部苍白且流出的液体为透明后表示灌注完成，用铡刀将鼠头取下，在不破坏大鼠大脑结构的前提下小心取出大鼠脑组织，立即放入-20℃进行冷冻。冷冻20min后取出脑组织，用手术刀片从前往后对大脑进行冠状面的切片，切成6片且每片厚度均匀。将切好的冠状面大脑切片放入2％TTC染色液中进行染色。待切片染色均匀后，再加入4％多聚甲醛进行固定，用扫描仪对各组大鼠脑组织切片进行扫描拍照，通过Imagine Pro Plus软件圈出梗死区域，计算梗死区域占患侧半脑总面积的百分比。

3.2免疫荧光染色观察大鼠神经组织

大鼠脑缺血2h再灌注24h后分组，并连续静脉注射给药3天后以50mg/kg剂量腹腔注射2％戊巴比妥进行麻醉，取出大鼠脑组织，采用石蜡切片，脱蜡、封闭、孵育一抗(NeuN)、二抗，加入DAPI复染细胞核后，将切片置于荧光显微镜下观察并采集图像。

3.3行为评分观察大鼠神经功能的状况

大鼠脑缺血2h再灌注24h后连续尾静脉给药3天，期间每天对大鼠进行Longa行为学评分观察大鼠神经功能的状况。

参照Longa行为学评分标准对大鼠的神经功能进行评分。0分：无明显的神经功能损伤，可以正常活动；1分：神经功能的损伤较轻，对侧前爪不能完全伸展，提尾后可出现前肢对侧交叉的症状；2分：中度神经功能损伤，行走时对侧前肢或后肢无法正常行走，症状表现为向对侧转圈；3分：重度神经功能损伤，行走时对侧前肢和后肢都无法正常行走，表现为向对侧倾倒；4分：意识丧失，无法自发行走。

4、实验结果

结果如图1、2所示，大鼠脑组织正常部位的染色为红色，受到缺血损伤的梗死区域染色为白色。其中正常组大鼠无梗死区域，全脑染色均为红色，模型组大鼠缺血侧半脑出现较明显的白色梗死区域。与模型组相比，依达拉奉阳性对照组、环状短肽中剂量组(2mg/kg)和环状短肽高剂量组(4mg/kg)大鼠缺血侧白色的梗死区域体积明显减小(P<0.05)。

大鼠脑缺血2h再灌注24h后分组尾静脉注射给予环状短肽(4mg/kg)，连续给药3天后，取大鼠脑组织进行免疫荧光染色实验。免疫荧光染色结果如图3所示，与正常组相比，模型组大鼠皮层NeuN阳性神经元细胞数量明显减少，环状短肽高剂量组大鼠皮层NeuN阳性神经元细胞数量明显增加。

大鼠脑缺血2h再灌注24h后连续尾静脉给药3天，期间每天进行Longa行为学评分实验。如表1所示，各组大鼠从第1天开始，评分逐渐减少，到给药第3天各组大鼠行为学评分均减少到1左右，说明大鼠在脑缺血再灌注损伤后存在自发的修复过程。第1天时，与模型组相比，环状短肽高剂量组的神经行为学评分明显减少(P<0.05)，第2天时，与模型组相比，阳性药组和环状短肽中剂量组和高剂量组的神经行为学评分明显减少(P<0.05)，在第3天时，与模型组相比，各给药组神经行为学评分均明显减少(P<0.05)。

上述实验结果表明，环状短肽对大鼠脑卒中损伤具有保护作用。

表1环状短肽对脑缺血大鼠行为学评分的影响

^##P<0.01，与正常组相比；^*P<0.05，与模型组相比

实施例3：环状短肽用于治疗颅脑损伤的动物实验

液压打击法制作大鼠颅脑损伤模型是验证药物具有防治颅脑损伤作用常用的动物模型(唐菁华,孙秀勤,王建军.阿托伐他汀对颅脑损伤大鼠神经元凋亡的抑制作用.中国临床神经外科杂志,2020,25(04):40-43.)，因此用此模型验证环状短肽对大鼠颅脑损伤的保护作用。

1、动物

健康雄性SD大鼠，体重200～250g，每组8只，共分6组。购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格证号(动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005)。饲养于清洁级动物房。

2、药物

将实验大鼠进行分组：

正常组：正常饲养大鼠，未进行任何处理。

模型组：实施液压打击，给予与药物实验组等量的生理盐水

阳性对照组：实施液压打击，给予依达拉奉注射液4.0mg/kg(南京先声东元制药有限公司生产)

低剂量组：实施液压打击，给予环状短肽1.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

中剂量组：实施液压打击，给予环状短肽2.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

高剂量组：实施液压打击，给予环状短肽4.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

3、实验方法

大鼠称重，以50mg/kg剂量腹腔注射2％戊巴比妥进行麻醉，待麻醉效果满意后，将大鼠置于手术台上，俯卧位固定于立体定位仪上。大鼠门齿挂于门齿环上，使用耳杆固定头部两侧。随后，使用动物剃毛刀剪去头顶部毛发，碘酒酒精消毒头皮。使用剪刀沿大鼠头正中线剪开长约1.5cm的皮肤切口，分离骨膜，暴露颅骨，用牙科钻磨开一直径为5mm的圆形骨窗，将打击管粘接固定于圆形骨窗上，用37℃生理盐水将打击管注满。待大鼠恢复角膜反射后，将打击管与液压打击仪打击端连接，调整液压打击仪，使其打击强度为2.0atm。打击后，去除打击管，进行皮肤消毒后缝合头皮，将大鼠放回笼中饲养。

正常组仅剪开头皮，分离骨膜，磨出骨窗，不进行液压打击，其余步骤与模型组相同。

制作颅脑损伤模型后30分钟内，通过尾静脉给予正常组、模型组生理盐水，给予阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组相应的药物。

3.1大鼠脑组织含水量的测定

制作颅脑损伤模型24小时后，大鼠分别以戊巴比妥麻醉处死后，迅速断头取脑，滤纸吸干表面水分，用天平精密称取湿重，置于95℃烘箱中烘烤24h至恒重，称取干重。计算脑组织含水量：脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。

3.2HE染色观察大鼠脑组织病理变化

制作颅脑损伤模型1天、3天和7天后，大鼠分别以戊巴比妥麻醉处死后，取出大鼠脑组织，采用石蜡切片，脱蜡、苏木素染细胞核，伊红染细胞质，在乙醇中脱水，中性树胶封片，显微镜镜检，图像采集分析。

4、实验结果

如表2所示，大鼠制作颅脑损伤模型24小时后，检测脑组织含水量。模型组脑损伤后脑含水量为79.06±0.22％，与正常组相比差异显著(P<0.01)，环状短肽低剂量组脑含水量为78.80±0.12％，与模型组相比差异明显(P<0.05)，环状短肽中剂量组脑含水量为78.27±0.14％，与模型组相比差异明显(P<0.01)，环状短肽高剂量组脑含水量为77.88±0.19％，与模型组相比差异明显(P<0.01)。

表2.环状短肽对颅脑损伤大鼠脑含水量的影响

^##P<0.01，与正常组相比；^*P<0.05，^**P<0.01，与模型组相比

大鼠制作颅脑损伤模型1天、3天和7天后，取脑组织，HE染色观察脑组织的病理变化。如图4所示，正常组脑组织皮层结构正常，水肿，细胞层次清楚，排列整齐有序，神经元核仁清晰。模型组脑组织损伤后1天，组织发生明显水肿，细胞胞体轻微肿胀，可见细胞核固缩或破碎。损伤后3天，脑组织损伤灶及其周边组织发生水肿加重，神经细胞肿胀进一步加深，胞浆浓染，细胞核固缩及缺失。损伤后7天，神经细胞肿胀明显减轻。环状短肽高剂量组损伤后1天，损伤区域组织较模型组水肿程度明显减轻，损伤后3天，损伤及周围组织仍有水肿，但较模型组明显减轻。损伤后7天，水肿减轻明显。

实验结果表明，颅脑损伤能够引起脑水肿，而环状短肽能够有效减轻脑水肿，减轻脑组织的病理变化。

实施例4：环状短肽用于治疗脑出血的动物实验

脑出血是一种常见病、多发病，相关的动物模型有很多种。目前使用较多的胶原酶脑出血模型，因为胶原酶脑出血模型相对更接近临床脑出血的病理过程。我们参照文献使用Ⅳ型胶原酶配合肝素建立动物模型验证环状短肽对大鼠脑出血的治疗作用(张艳玲,陈康宁,邵淑琴,等.采用Ⅳ型胶原酶构建大鼠脑出血模型.第三军医大学学报,2002,24(12):1394-1395.)。

1、动物

健康雄性SD大鼠，体重200～250g，每组8只，共分6组。购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格证号(动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005)。饲养于清洁级动物房。

2、药物

将实验大鼠进行分组：

正常组：正常饲养大鼠，未进行任何处理。

模型组：制作脑出血模型，给予与药物实验组等量的生理盐水

阳性对照组：制作脑出血模型，给予依达拉奉注射液4.0mg/kg(南京先声东元制药有限公司生产)

低剂量组：制作脑出血模型，给予环状短肽1.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

中剂量组：制作脑出血模型，给予环状短肽2.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

高剂量组：制作脑出血模型，给予环状短肽4.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

3、实验方法

大鼠称重，以50mg/kg剂量腹腔注射2％戊巴比妥进行麻醉，待麻醉效果满意后，将大鼠置于手术台上，俯卧位固定于立体定位仪上。大鼠门齿挂于门齿环上，使用耳杆固定头部两侧。随后，使用动物剃毛刀剪去头顶部毛发，碘酒酒精消毒头皮。取前囟为原点，向右3mm，向后1mm，深度5mm为注射点(尾状核)，注射2.0μL的Ⅳ型胶原酶(每1μL含Ⅳ型胶原酶0.2U及肝素2U)。

正常组仅剪开头皮，不注射Ⅳ型胶原酶，其余步骤与模型组相同。

制作脑出血模型后2h，通过尾静脉给予正常组、模型组生理盐水，给予阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组相应的药物，给药1周。

3.1行为评分观察大鼠神经功能的状况

大鼠连续尾静脉给药7天后对大鼠进行Longa行为学评分观察大鼠神经功能的状况。

参照Longa行为学评分标准对大鼠的神经功能进行评分。0分：无明显的神经功能损伤，可以正常活动；1分：神经功能的损伤较轻，对侧前爪不能完全伸展，提尾后可出现前肢对侧交叉的症状；2分：中度神经功能损伤，行走时对侧前肢或后肢无法正常行走，症状表现为向对侧转圈；3分：重度神经功能损伤，行走时对侧前肢和后肢都无法正常行走，表现为向对侧倾倒；4分：意识丧失，无法自发行走。

3.2大鼠脑组织含水量的测定

给药结束后，大鼠分别以戊巴比妥麻醉处死后，迅速断头取脑，滤纸吸干表面水分，用天平精密称取湿重，置于95℃烘箱中烘烤24h至恒重，称取干重。计算脑组织含水量：脑组织含水量(％)＝(湿重-干重)/湿重×100％。

4、实验结果

大鼠脑出血后连续尾静脉给药7天，进行Longa行为学评分实验。如表3所示，与模型组相比，阳性对照组、中剂量组和高剂量组神经行为学评分均明显减少(P<0.05，P<0.01)。

表3环状短肽对脑出血大鼠行为学评分的影响

^##P<0.01，与正常组相比；^*P<0.05，^**P<0.01，与模型组相比

如表4所示，大鼠制作脑出血模型后，检测脑组织含水量。模型组脑损伤后脑含水量为78.43±0.20％，与正常组相比差异显著(P<0.01)，环状短肽中剂量组脑含水量为77.90±0.25％，与模型组相比差异明显(P<0.05)，环状短肽高剂量组脑含水量为77.03±0.29％，与模型组相比差异明显(P<0.01)。

表4.环状短肽对脑出血大鼠脑含水量的影响

^##P<0.01，与正常组相比；^*P<0.05，^**P<0.01，与模型组相比

实验结果表明，环状短肽能够有效地改善脑出血大鼠神经行为学变化，减轻脑水肿。

实施例5：环状短肽用于治疗角叉菜胶致大鼠足肿胀的动物实验

当机体受到病原入侵、组织损伤时，炎症反应在抵御病原入侵、修复损伤机体、调整应激反应等方面都发挥重要作用。然而在病理情况下，异常的炎症反应经常导致机体免疫和代谢等生理过程紊乱和组织损伤，与多种疾病的发生密切相关。

角叉菜胶致大鼠足肿胀模型是常用的评价或筛选抗炎药物的动物模型。当角叉菜胶被注射入大鼠足跖内后，角叉菜胶能使大鼠局部毛细血管扩张、血管通透性增高、局部水肿等症状，与人体的急性炎症反应十分类似。我们参照文献使用角叉菜胶建立致大鼠足肿胀模型验证环状短肽对大鼠炎症反应的治疗作用(肖百全,朱少璇,杨威,等.角叉菜胶致大鼠足肿胀模型探讨及其机制研究.中国实用医药,2008,3(23):63-65.)。

1、动物

健康雄性SD大鼠，体重180～200g，每组8只，共分6组。购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格证号(动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005)。饲养于清洁级动物房。

2、药物

将实验大鼠进行分组：

正常组：正常饲养大鼠，未进行任何处理。

模型组：制作炎症模型，给予与药物实验组等量的生理盐水

阳性对照组：制作炎症模型，给予地塞米松注射液5.0mg/kg(国药集团容生制药有限公司生产)

低剂量组：制作炎症模型，给予环状短肽2.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

中剂量组：制作炎症模型，给予环状短肽4.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

高剂量组：制作炎症模型，给予环状短肽8.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

3、实验方法

大鼠通过腹腔注射给予正常组、模型组生理盐水，给予阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组相应的药物，给药1次30min后，用记号笔标记右足踝关节处，接着右足趾皮下注射50μL 2％角叉菜胶溶液(2％角叉菜胶溶液配制：精确称量角叉菜胶粉末于烧杯中，在40～45℃水浴下，加定量的生理盐水浸泡溶胀，搅拌溶解，配制成2.0％角叉菜胶溶液，密封，置4℃冰箱冷藏，备用)致炎，测量各组0h、1h、2h、4h、6h、8h足趾体积。

计算大鼠的足趾肿胀度：足趾肿胀度(％)＝(各组足趾体积－正常组足趾平均体积)/正常组足趾平均体积×100％。

4、实验结果

如表5所示，与模型组相比，阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠足趾肿胀度均明显减少(P<0.05，P<0.01)。

表5环状短肽对大鼠足趾肿胀度的影响

^*P<0.05，^**P<0.01，与模型组相比。

实验结果表明，环状短肽能够有效地抑制炎症反应，减轻角叉菜胶诱发的大鼠足肿胀。

实施例6：环状短肽用于治疗二甲苯致小鼠的耳肿胀动物实验

二甲苯致小鼠耳胀模型也是常用的评价或筛选抗炎药物的动物模型。当二甲苯涂抹在小鼠耳部时，二甲苯也能使小鼠的局部毛细血管扩张、血管通透性增高、局部水肿等症状，与人体的急性炎症反应十分类似。我们参照文献使用二甲苯建立小鼠耳肿胀模型验证环状短肽对小鼠炎症反应的治疗作用(周娟,张梦军,郭嘉伟,等.小鼠耳肿胀模型及药理应用.国际检验医学杂志,2012(17):60-62.)。

1、动物

健康雄性BALB/C小鼠，体重18～20g，每组8只，共分6组。购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，质量合格证号(动物合格证号：SCXK(沪)2007-0005)。饲养于清洁级动物房。

2、药物

将实验小鼠进行分组：

正常组：正常饲养小鼠，未进行任何处理。

模型组：制作炎症模型，给予与药物实验组等量的生理盐水

阳性对照组：制作炎症模型，给予地塞米松注射液5.0mg/kg(国药集团容生制药有限公司生产)

低剂量组：制作炎症模型，给予环状短肽3.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

中剂量组：制作炎症模型，给予环状短肽6.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

高剂量组：制作炎症模型，给予环状短肽9.0mg/kg(上海淘普生物科技有限公司生产)。

3、实验方法

小鼠通过腹腔注射给予正常组、模型组生理盐水，给予阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组相应的药物，在小鼠右耳正反面均匀涂抹二甲苯各20μL，以左耳为对照。给药30分钟后处死，沿耳廓线剪下双耳，用直径7mm的YLS-Q4耳肿打耳器(济南益延科技发展有限公司)取两耳同一部位，称重，求左右耳重量差和肿胀抑制率(肿胀抑制率(％)＝(模型组肿胀度-给药组肿胀度)/模型组肿胀度×100％，比较各组药物抗炎作用。

4、实验结果

如表6所示，与模型组相比，阳性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠左右耳重量差均明显减少(P<0.01)。

表6环状短肽对小鼠耳肿胀度的影响

^##P<0.01，与正常组相比；^*P<0.05，^**P<0.01，与模型组相比

实验结果表明，环状短肽能够有效地抑制炎症反应，减轻二甲苯诱发的小鼠耳肿胀。

上述结果表明，环状短肽能够减少脑缺血大鼠脑梗死体积，减少神经损伤，降低颅脑损伤大鼠脑含水量，减轻组织损伤，减轻脑出血大鼠神经损伤，降低脑含水量，并能够减轻角叉菜胶致大鼠足肿胀程度和二甲苯诱发的小鼠耳肿胀度，抑制炎症反应，可开发为相应的治疗脑部疾病和抗炎的药物。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.环状短肽或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗脑缺血、颅脑损伤、脑出血或炎症性疾病的药物中的应用；所述的环状短肽的氨基酸序列为cyclo(MQCNS)，肽链的M和S连接成环，其结构式如式I所示：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗脑缺血的药物为减少脑缺血脑梗死体积，减少神经损伤的药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗颅脑损伤的药物为有效减轻脑水肿，减轻组织损伤的药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗脑出血的药物为有效地改善脑出血神经损伤，减轻脑水肿的药物。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗炎症性疾病的药物为抑制急性炎症反应，减轻肿胀的药物。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物以环状短肽或其药学上可接受的盐作为唯一活性成分。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的环状短肽或其药学上可接受的盐与其他治疗脑缺血或颅脑损伤或脑出血或炎症性疾病药物共同作为活性成分。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物中还包括一种或两种以上制药学上可接受的辅助成分；所述的制药学上可接受的辅助成分为赋形剂、填充剂或稀释剂。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物按照药物常规制备方法制备成临床上可接受的药物制剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的药物制剂为颗粒剂、胶囊剂、片剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂。

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