CN116003641B

CN116003641B - 丁香多糖、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN116003641B
Application number: CN202111230082.5A
Authority: CN
Inventors: 丁侃; 靳灿; 张波; 裴荣娟; 李佳; 臧奕; 冯勃; 许叶春; 黄春帆; 陈霞; 杜振云; 李美霞
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2021-10-21
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2024-05-31
Anticipated expiration: 2041-10-21
Also published as: CN116003641A

Abstract

本公开涉及丁香多糖、其制备方法及应用。具体而言，本公开涉及由丁香花蕾提取得到的一种丁香多糖、其制备方法、包含其的药物组合物和在制备抗冠状病毒(包括SARS‑CoV‑2病毒)的药物中的应用。所述丁香多糖的分子量范围为3～200kDa。经实验证实，根据本公开的丁香多糖具有抗冠状病毒活性，特别是抗SARS‑CoV‑2活性。

Description

丁香多糖、其制备方法及应用

技术领域

本公开涉及多糖技术领域，具体涉及一种丁香多糖、其制备方法、包含其的药物组合物和在制备抗冠状病毒(包括SARS-CoV-2病毒)的药物中的应用。

背景技术

丁香(Syzygium aromaticum L.)，又名公丁香、支解香、雄丁香等是桃金娘科植物，常以花蕾入药。

当前未见丁香多糖可用于抗冠状病毒，特别是SARS-CoV-2(即2019新型冠状病毒，又称COVID-19)的报道。

发明内容

本公开的发明人由丁香花蕾提取得到一种丁香多糖，并通过细胞实验证实所述丁香多糖对SARS-CoV-2病毒具有抑制作用，有望开发成为抗冠状病毒(包括SARS-CoV-2病毒)的药物。

本公开一方面提供一种丁香多糖，其由丁香花蕾水提得到，分子量范围为3～200kDa。特别地，所述丁香多糖的重均分子量(Mw)为3kDa至200kDa，数均分子量(Mn)为3kDa至100kDa，分子量分布(Mw/Mn)为1至5

在一些实施方式中，所述丁香多糖含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的摩尔比例范围为3.5～6.5:3.1～6.5:3.0～15.5:7.0～10.5:20.0～53.5:6.3～18.5:2.0～7.5:8.5～20.5。

在一些实施方式中，所述丁香多糖含有甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔比例为35.5～70.0:5.6～30.8:15.3～62.3。

在一些实施方式中，所述丁香多糖含有半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比例为50.0～98.0:2.1～10.2:1.5～5.6。

本公开另一方面提供制备丁香多糖的方法，包括如下步骤：

(1)将丁香花蕾沸水提取得到提取液，

(2)提取液浓缩后透析得到透析液；

(3)透析液浓缩后加入乙醇进行沉淀；

(4)收集沉淀得丁香多糖A。

根据本公开的制备丁香多糖A的方法还可以包括在沸水提取前用水室温浸泡丁香花蕾的步骤。浸泡时间没有特别限制，例如可以为6h以上，例如12～24h。

所述丁香花蕾可以是干燥的或者是新鲜的丁香花蕾。

上述步骤(1)中，以质量体积比g/mL计，丁香花蕾与水的料液比可以为1:10～1:50，例如1:10～1:30，以水能够淹没药材为宜，但不限于此。沸水提取的时间没有特别限制，只要提取出丁香多糖即可，一般可以为2-4小时，但不限于此。对于提取的次数没有特别限制，例如，沸水提取可以进行1-3次，但不限于此。在进行多次提取的情况下，将提取液合并后进行后续步骤。

在上述步骤(2)中，透析时间没有特别限制，只要能够适当去除不希望的小分子化合物杂质即可。例如，可以进行2-3天，但不限于此。

在上述步骤(3)中，透析液浓缩后还可以包括离心以除去透析中产生的沉淀的步骤。离心可以在4000～8000rpm离心5～10min。离心后取上清液加入乙醇进行沉淀。

对于加入乙醇的量没有特别限定，只要能够产生足够的多糖沉淀即可。例如可以加入上清液体积的2～6倍，例如3～6倍体积的乙醇。乙醇可以是体积浓度在85％以上的乙醇，例如为95％乙醇或者无水乙醇。

在上述步骤(4)中，在收集沉淀之前可以包括除去混合液上层的大部分乙醇的步骤，以减少处理体积。

在上述步骤(4)中，收集沉淀的方法不限。例如可以通过离心，然后弃去上清得到沉淀。离心例如可以在4000～10000rpm离心10～15min。

在上述步骤(4)中，还可以包括将沉淀烘干的步骤。烘干的目的在于除去乙醇，对于温度没有特别限制，例如可以为30～60℃，例如50℃，烘干时间没有特别限制，例如可以为4～24h，例如4～10h。

在上述步骤(4)中，还可以包括将沉淀复溶于水中，进行固液分离，然后将所得液体冻干得丁香多糖A的步骤。

根据本公开的制备丁香多糖的方法还可以包括色谱纯化步骤。

在一个实施方式中，色谱纯化步骤采用阴离子交换柱DEAE FAST FLOW进行，收集0.2M NaCl洗脱液的洗脱组分，得到丁香多糖B。

更具体而言，采用阴离子交换柱DEAE FAST FLOW的色谱纯化步骤包括如下步骤：

(1)将上述制备的丁香多糖A溶于水中，去除沉淀(例如通过离心)；

(2)在阴离子交换柱DEAE FAST FLOW上依次以去离子水、0.05M NaCl、0.1M NaCl、0.2M NaCl、0.4M NaCl、0.8M NaCl和1M NaCl水溶液作为洗脱液洗脱，收集0.2M NaCl洗脱液的洗脱组分，得到丁香多糖B。

在一个实施方式中，色谱纯化步骤采用阴离子交换柱DEAE FAST FLOW和凝胶层析柱进行，包括如下步骤：

(2)在阴离子交换柱DEAE FAST FLOW上依次以去离子水、0.05M NaCl、0.1M NaCl、0.2M NaCl、0.4M NaCl、0.8M NaCl和1M NaCl水溶液作为洗脱液洗脱，收集0.1M NaCl洗脱液的洗脱组分，得到丁香多糖C；

(3)将丁香多糖C经凝胶层析柱，以0.2M NaCl水溶液为流动相进行纯化得到丁香多糖D。

经实验证实，根据本公开的丁香多糖具有抗冠状病毒活性，特别是抗SARS-CoV-2活性。例如，作为丁香多糖A的实例的实施例1的丁香多糖922对SARS-CoV-2病毒的半数抑制浓度为5.00～9.00μg/mL，对3CLpro蛋白半数抑制浓度IC₅₀为27.55～30.00±5.82(μg/mL)；作为丁香多糖B的实例的实施例2的丁香多糖9222在浓度为20μg/mL时对SARS-CoV-23CLpro蛋白的抑制率为75.05～80.00±1.11％，半数抑制浓度IC₅₀为1.18～3.00±0.20(μg/mL)；作为丁香多糖D的实例的实施例2的丁香多糖922112在浓度为100μg/mL时对SARS-CoV-2 PLpro蛋白的抑制率为92.88％。

因此，本公开另一方面提供一种药物组合物，其含有根据本发明的丁香多糖。所述药物组合物还可以包含药学上可接受的辅料，例如佐剂、稀释剂、崩解剂、表面活性剂、着色剂、染料、甜味剂、风味剂、滑爽剂、包衣剂等，但不限于此。

根据需要，本发明的药物组合物还可以包括其他药物活性成分。例如可以包含其他具有抗冠状病毒活性的组分以增强抗冠状病毒能力，或者包含用于治疗其他疾病的药物活性成分以实现多种疾病的联合治疗，但是不限于此。

本公开再一方面提供根据本发明的丁香多糖用于制备抗冠状病毒的药物，特别是抗SARS-CoV-2的药物的用途。

在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。

在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值。在本文中，在可实现发明目的的前提下，数值应理解成具有该数值有效位数的精确度。举例来说，数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化，并且在某些方面，小于或等于0.1％的变化。

以上描述旨在是说明性的而不是限制性的。例如，上述实施方式(或其一个或更多特征)可以彼此组合使用。例如本领域普通技术人员在阅读上述描述时可以使用其它实施方式。另外，在上述实施方式中，各种特征可以被分组在一起以简化本公开。

附图说明

图1是922单糖组成分析图

图2是9222单糖组成分析图

图3是922112单糖组成分析图

图4显示922抗SARS-CoV-2病毒活性结果

图5显示922对3CLpro蛋白酶抑制作用检测结果

图6显示922112对PLpro蛋白酶抑制作用检测结果

具体实施方式

下面通过实施例对本公开进一步详细说明。然而，提供以下的实施例仅用于更容易地理解本发明，且本发明的范围并不限于此。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。实施例中所采用的方法、试剂和条件，除非另有说明，否则为本领域常规的方法、试剂和条件。

实施例1：多糖提取

1.浸泡：将干燥/新鲜的丁香花蕾用水室温浸泡12～24h；

2.煎煮：加入丁香花蕾与水的料液比在1:10～1:30(g/mL)，保证水能够淹没药材，保持微沸腾煎煮2-4小时，过滤后重新加水继续微沸腾煎煮2-4小时，合并两次的提取液；

3.透析：将提取液加热浓缩得到浓缩液，自然冷却至室温，然后用玻璃纸包裹浓缩液对流动水透析处理2～3天；

4.醇沉：将袋内的透析液加热浓缩到适当体积，自然冷却至室温，4000～8000rpm离心5～10min，取上清边加入上清液体积的3～6倍体积的95％乙醇边搅拌，静置过夜得到醇沉液；

5.离心烘干：采用虹吸方法吸去醇沉液上层大部分的乙醇仅余少量乙醇，然后混匀余下醇沉液，4000～10000rpm离心10～15min，弃去上清，得到沉淀放烘箱50℃烘4～10h。

6.复溶冻干：沉淀经烘箱除去乙醇后，将沉淀复溶于0.5～2L水中，离心取上清放冻干机冻干即得到丁香水提粗多糖922，得率为1～5wt％(基于干燥丁香花蕾总重)。

实施例2：多糖分离纯化

1.多糖经阴离子交换柱DEAE FAST FLOW分离：

将丁香水提粗多糖922按6～10g溶解于60～100mL的去离子水中，旋涡振荡使样品充分溶解后，4000～8000rpm离心5～10min，取上清上样。流动相依次为去离子水、0.05M氯化钠、0.1M氯化钠、0.2M氯化钠、0.4M氯化钠、0.8M氯化钠和1M氯化钠水溶液。收集样品时，流速为1mL/min，每管收集15min，收集100管。

经去离子水洗脱得到去离子水洗脱组分9220，得率为0.77～2％；经0.05M NaCl洗脱得到0.05M NaCl洗脱组分92205，得率为0.1～1％；经0.1M NaCl洗脱得到0.1M NaCl洗脱组分9221，得率为0.5～3％；经0.2M NaCl洗脱得到0.2M NaCl洗脱组分9222，得率为0.5～6％；经0.4M NaCl洗脱得到0.4M NaCl洗脱组分9224，得率为0.5～6％。以上得率基于丁香水提粗多糖922的重量。

2.多糖经凝胶柱纯化：

将经阴离子交换柱分离得到的多糖组分进一步经S100凝胶层析柱纯化，以得到均一的多糖。

将上面得到的样品9221按100～200mg溶解于2.5～5mL的去离子水，旋涡振荡助溶。样品充分溶解后，4000rpm离心10min，取上清上样。流动相为0.2M氯化钠水溶液，流速为1mL/5min，上样12h后开始收集样品，每管收集15min，收集100管，得到均一多糖922112，得率为10～60％。

实施例3：多糖纯度和单糖组成分析

1.多糖分子量测定：

精密称取多糖样品2mg，溶于300～600μL的0.1M硝酸钠水溶液，振荡使样品充分溶解，4000～8000rpm离心5～10min，取上清过0.22μM的滤膜后上样进行分子量测定。

多糖专用凝胶色谱柱串联∶UltrahydrogelTM 2000(7.8mm×300mm，排阻极限5×104～10×106Da)和UltrahydrogelTM 500(7.8mm×300mm，排阻极1×104～4×105Da)。色谱条件∶流动相为0.1M硝酸钠水溶液，流速为0.5mL/min，进样量为10～20μL，柱温25℃，紫外吸收波长为280nm，示差检测器温度为25℃，检测。进入HPGPC仪器的流动相均需脱气。

样品的分子量根据多糖标准曲线来计算：取已知分子量的标准品葡聚糖系列(180Da，667Da，6,000Da，11,300Da，21,700Da，48,800Da，113,000Da，210,000Da，393,000Da，805,000Da)分别溶于流动相，配置成浓度为2mg/mL溶液，离心，取上清液，自动进样分析。由GPC专用软件绘制标准曲线。

采用上述方法对所得到的丁香多糖922、9222和922112进行分子量测定，发现三者分子量范围为3～200kDa。

丁香多糖922的重均分子量(Mw)为5.56kDa，数均分子量(Mn)为1.11kDa，分子量分布(Mw/Mn)为5。

丁香多糖9222的重均分子量(Mw)为15.8kDa，数均分子量(Mn)为6.36kDa，分子量分布(Mw/Mn)为2.48。

丁香多糖922112的重均分子量(Mw)为4.04kDa，数均分子量(Mn)为3.05kDa，分子量分布(Mw/Mn)为1.32。

2.多糖单糖组成分析：

1)完全酸水解：称取样品2mg，溶于2mL蒸馏水旋涡振荡助溶，尽可能将样品(可加热或超声)溶解，将样品溶液加入鸡心瓶(规格50/19)中，然后加入2mL 4M三氟乙酸(TFA)混匀，加鸡心瓶配套空心塞密塞，并用医用橡胶膏封闭好塞子与鸡心瓶接触口，110℃下加热水解4h。水解后冷却，加甲醇减压蒸干多次，以除尽TFA。加200μL蒸馏水溶解水解产物。

2)1-苯基-3-甲基本5-吡唑酮(PMP)衍生化过程：从上一步所得200μL水解产物中取100μL加入至10mL EP管中加入100μL的0.6M NaOH溶液混匀。加入现配的200μL0.5M PMP的甲醇溶液，封管混匀，在70℃水浴中加热1h+40min，反应结束后冷却至室温，然后加入200μL 0.3M HCl水溶液，再加入400μL去离子水使此时体系总体积为1mL。

3)标准品溶液配置：采用甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖9个单糖标准品。每种单糖先用去离子水为配置9mg/mL。然后各取100μL混合，制备成9种单糖标准品混合液，其中每种单糖的浓度为1mg/mL。衍生化时取出100μL该标准品混合液进行衍生化操作。

4)萃取：取衍生化样品加入三氯甲烷(体积比为1：1～10)，在振荡器上振荡3min，8000rpm离心5min，室温静置30min。保留上层水相，同样操作用三氯甲烷重复萃取3次，取上层水相经0.22μm微孔滤膜过滤后进行HPLC分析。

5)HPLC分析：

分析柱为C18反相色谱柱(安捷伦XDB-C18，PN号:990967-902，4.6x 250mm,5μm)，流动相为pH 7.0磷酸盐缓冲液/乙腈(磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为33:7)，柱温为35℃，流速为1mL/min，紫外吸收波长245nm，进样量为10μL，检测时间为1h。

采用上述PMP柱前衍生法(PMP-HPLC)对所得到的丁香多糖922、9222和922112进行糖组成分析，结果见图1-3，其中，图1是922单糖组成分析图；图2是9222单糖组成分析图；图3是922112单糖组成分析图。

结果表明：922含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的摩尔比例范围为3.5～6.5:3.1～6.5:3.0～15.5:7.0～10.5:20.0～53.5:6.3～18.5:2.0～7.5:8.5～20.5；9222含有甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔比例为35.5～70.0:5.6～30.8:15.3～62.3；922112含有半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比例为50.0～98.0:2.1～10.2:1.5～5.6。

实施例4：多糖抗病毒活性筛选

1.抗SARS-CoV-2病毒活性筛选：

将WIV04毒株在veroe6细胞中传代，用菌斑法检测其滴度。用指定浓度的药物与veroe6细胞共孵育，在病毒感染复数(MOI)为0.01时感染SARS-CoV-2病毒。37℃孵育24h后，收集上清液，用磁珠病毒RNA提取试剂盒(Shanghai Finegene Biotech，FG438)提取病毒RNA，用Tagman探针对S基因RBD区进行实时RT-PCR定量，然后如下计算抑制率：

抑制率(％)＝(1-实验组RNA拷贝数/溶剂对照组RNA拷贝数)*100％

按照上述方法使用上述制备的丁香多糖922以不同浓度(具体浓度为：由600μg/ml或200ug/ml开始，进行3倍梯度稀释，共7个浓度)对SARS-CoV-2病毒抑制作用进行检测，计算抑制率，然后通过graphpad prism软件进行非线性拟合计算EC₅₀。结果见图4。

结果表明，丁香多糖922具有抗SARS-CoV-2病毒活性，其半数抑制浓度EC₅₀为5.01μg/mL。

2. 2019-nCoV 3CLpro蛋白酶活抑制作用检测：

2019-nCoV是一种RNA病毒，其增殖依于RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的对母系RNA的再生，而2019-nCoV 3CLpro蛋白是2019-nCoV关键蛋白RdRp成为活性形式的关键蛋白。2019-nCoV 3CLpro蛋白通过水解病毒pp1a和pp1ab蛋白，使其形成成熟产物nsp1-16，进而组装成具有活性的RdRp。目前2019-nCoV 3CLpro已被认为是治疗冠状病毒的药物靶标之一。

基于SARS-CoV-2 3CL^pro蛋白是一种蛋白水解酶的基本特点，建立荧光法检测SARS-CoV-2 3CL^pro蛋白活性的筛选体系。SARS-CoV-2 3CL^pro蛋白可特异性剪切P1位为Gln(Q)的底物，其活性检测可采用荧光多肽为底物，通过检测荧光信号的生成来反映其蛋白水解酶的活性。

SARS-CoV-2 3CLpro蛋白酶活检测使用荧光标记多肽底物(序列：MCA-AVLQSGFRK(DNP)K)。SARS-CoV-2 3CLpro酶溶液(在反应液中稀释到0.5μM)与多糖在反应液(20mMTris,pH7.3,150mM NaCl,1mM EDTA,1％Glycerol,0.01％Tween-20)中室温共孵育10分钟，加入底物(40μM，反应液总体积50μL)。开始反应后用EnVision Xcite Multilabel Reader(PerkinElmer)检测反应液的荧光强度(激发光320nm，发射光405nm)，每个剂量设三个复孔。对照孔(DMSO)的荧光值设为100％，化合物处理孔用相对于对照孔的百分数来表示其活性率。

按照上述方法使用上述制备的丁香多糖922和9222以不同浓度(浓度从0.14μg/mL到100μg/mL)对3CLpro蛋白酶活抑制作用进行检测，测试活性剂量依赖关系，即IC₅₀/EC₅₀值，通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为Graphpad Prism 8，拟合所使用的模型为四参数剂量效应积分模型(four-parameter concentration–responsemodel)(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥3)，在结果中以标准偏差(StandardDeviation,SD)或者标准误差(Standard Error,SE)表示。

图5显示丁香多糖922对3CLpro蛋白酶活抑制作用。结果表明，丁香多糖922对SARS-CoV-2 3CL^pro蛋白酶半数抑制浓度IC₅₀为27.55±5.82(μg/mL)。

另外，丁香多糖9222在浓度为20μg/mL时对SARS-CoV-2 3CL^pro蛋白的抑制率为75.05±1.11％，半数抑制浓度IC₅₀为1.18±0.20(μg/mL)。

3. 2019-nCoV PLpro蛋白酶活抑制作用检测：

2019-nCoV是一种RNA病毒，其增殖依赖于RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的对母系RNA的再生，而2019-nCoV PLpro蛋白是2019-nCoV关键蛋白RdRp成为活性形式的关键蛋白。PLpro可特异性识别并剪切双甘氨酸多肽，多聚蛋白ppla(pp1ab)N端nsp1-2、nsp2-3和nsp3-4之间的LXGG序列，参与1a(1ab)复制酶蛋白N端的切割加工并释放成熟产物nsp1、nsp2和nsp3，进而组装成具有活性的RdRp。目前2019-nCoV PLpro已被认为是治疗冠状病毒的药物靶标之一。

基于SARS-CoV-2 PLpro蛋白是一种蛋白水解酶的基本特点，建立荧光法检测SARS-CoV-2 PLpro蛋白活性的筛选体系。SARS-CoV-2 PL^pro蛋白可特异性识别并剪切双甘氨酸多肽，其活性检测可采用荧光多肽为底物，通过检测荧光信号的生成来反应其蛋白水解酶的活性。

SARS-CoV-2 PL^pro蛋白酶活检测使用香豆素标记的多肽底物(序列：Z-RLRGG-AMC)。SARS-CoV-2 PL^pro酶溶液(在反应液中稀释到40nM)与多糖在反应液(20mM TrispH8.0,0.01％Tween20,0.5mM DTT)中室温共孵育10分钟，加入底物(50μM，反应液总体积50μL),开始反应后用EnVision Xcite Multilabel Reader(PerkinElmer)检测反应液的焚光强度(激发光355nm，发射光460nm)，每个剂量设三个复孔。对照孔(DMSO)的荧光值设为100％，化合物处理孔用相对于对照孔的百分数来表示其活性率。

按照上述方法使用上述制备的丁香多糖922112以不同浓度(浓度从0.14μg/mL到100μg/mL))对PLpro蛋白酶活抑制作用进行检测，测试活性剂量依赖关系。IC₅₀/EC₅₀值通过样品活性对样品浓度进行非线性拟和得到，计算所用软件为Graphpad Prism 8，拟合所使用的模型为四参数剂量效应积分模型(four-parameter concentration–response model)(varible slope)，对于大多数抑制剂筛选模型，将拟合曲线底部和顶部设定为0和100。一般情况下，每个样品在测试中均设置复孔(n≥3)，在结果中以标准偏差(StandardDeviation,SD)或者标准误差(Standard Error,SE)表示。

图6显示丁香多糖922112对PLpro蛋白酶活抑制作用。结果显示：922112在浓度为100μg/mL时对PL^pro蛋白的抑制率为92.88％。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海药物研究所

中国科学院武汉病毒研究所

<120> 丁香多糖、其制备方法及应用

<130> DI21-2017-XC91

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 多肽底物

<400> 1

Ala Val Leu Gln Ser Gly Phe Arg Lys Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 多肽底物

<400> 2

Arg Leu Arg Gly Gly

1 5

Claims

1.一种丁香多糖，其由丁香花蕾水提得到，分子量范围为3～200kDa，其中，

所述丁香多糖含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的摩尔比例范围为3.5～6.5:3.1～6.5:3.0～15.5:7.0～10.5:20.0～53.5:6.3～18.5:2.0～7.5:8.5～20.5；或者

所述丁香多糖含有甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔比例为35.5～70.0:5.6～30.8:15.3～62.3；或者

所述丁香多糖含有半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比例为50.0～98.0:2.1～10.2:1.5～5.6。

2.根据权利要求1所述的丁香多糖，其重均分子量(Mw)为3kDa至15.8kDa，数均分子量(Mn)为1.1kDa至6.36kDa，分子量分布(Mw/Mn)为1至5。

3.一种制备丁香多糖的方法，包括如下步骤：

(1)将丁香花蕾沸水提取得到提取液，

(2)提取液浓缩后透析得到透析液；

(3)透析液浓缩后加入乙醇进行沉淀；

(4)收集沉淀得丁香多糖A，

其中，所述丁香多糖A分子量范围为3～200kDa，含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的摩尔比例范围为3.5～6.5:3.1～6.5:3.0～15.5:7.0～10.5:20.0～53.5:6.3～18.5:2.0～7.5:8.5～20.5。

4.根据权利要求3所述的方法，其还包括在沸水提取前用水室温浸泡丁香花蕾的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，浸泡时间为6h以上。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，浸泡时间为12～24h。

7.根据权利要求3所述的方法，其中，所述丁香花蕾是干燥的或者是新鲜的丁香花蕾。

8.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(1)中，以质量体积比g/mL计，丁香花蕾与水的料液比为1:10～1:50；沸水提取的时间为2-4小时；沸水提取进行1-3次。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，丁香花蕾与水的料液比为1:10～1:30。

10.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(2)中，透析时间进行2-3天。

11.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(3)中，透析液浓缩后还包括离心，以除去透析中产生的沉淀的步骤。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，在4000～8000rpm离心5～10min。

13.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(3)中，加入乙醇的量为上清液体积的2～6倍；乙醇为体积浓度在85％以上的乙醇。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，加入乙醇的量为上清液体积的3～6倍体积；乙醇为95％乙醇或者无水乙醇。

15.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(4)中，在收集沉淀之前还包括除去混合液上层的大部分乙醇的步骤。

16.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(4)中，通过离心然后弃去上清，得到沉淀。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，在4000～10000rpm离心10～15min。

18.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(4)中，还包括将沉淀烘干的步骤。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，烘干温度为30～60℃，烘干时间为4～24h。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，烘干时间为4～10h。

21.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤(4)中，还包括将沉淀复溶于水中，进行固液分离，然后将所得液体冻干得丁香多糖A的步骤。

22.根据权利要求3-21任一项所述的方法，还包括色谱纯化步骤。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，色谱纯化步骤采用阴离子交换柱DEAE FASTFLOW进行，收集0.2M NaCl洗脱液的洗脱组分，得到丁香多糖B；

其中，所述丁香多糖B分子量范围为3～200kDa，含有甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的摩尔比例为35.5～70.0:5.6～30.8:15.3～62.3。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，采用阴离子交换柱DEAE FAST FLOW的色谱纯化步骤包括如下步骤：

(1)将权利要求3中所述的丁香多糖A溶于水中，去除沉淀；

(2)在阴离子交换柱DEAE FAST FLOW上依次以去离子水、0.05M NaCl、0.1M NaCl、0.2MNaCl、0.4M NaCl、0.8M NaCl和1M NaCl水溶液作为洗脱液洗脱，收集0.2M NaCl洗脱液的洗脱组分，得到丁香多糖B。

25.根据权利要求22所述的方法，其中，色谱纯化步骤采用阴离子交换柱DEAE FASTFLOW和凝胶层析柱进行，包括如下步骤：

(1)将权利要求3中所述的丁香多糖A溶于水中，去除沉淀；

(2)在阴离子交换柱DEAE FAST FLOW上依次以去离子水、0.05M NaCl、0.1M NaCl、0.2MNaCl、0.4M NaCl、0.8M NaCl和1M NaCl水溶液作为洗脱液洗脱，收集0.1M NaCl洗脱液的洗脱组分，得到丁香多糖C；

(3)将丁香多糖C经凝胶层析柱，以0.2M NaCl水溶液为流动相进行纯化得到丁香多糖D，

其中，所述丁香多糖D分子量范围为3～200kDa，含有半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖的摩尔比例为50.0～98.0:2.1～10.2:1.5～5.6。

26.一种药物组合物，其含有根据权利要求1或2所述的丁香多糖，和任选的药学上可接受的辅料。

27.根据权利要求1或2所述的丁香多糖用于制备抗SARS-CoV-2的药物的用途。