CN104292305B

CN104292305B - 一种多肽、制备方法及其应用

Info

Publication number: CN104292305B
Application number: CN201410023908.4A
Authority: CN
Inventors: 刘宁; 翟仙敦; 王帅宝; 张学智
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: TIANJIN BOFEIDE SCIENCE & TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2017-06-09
Anticipated expiration: 2034-01-17
Also published as: CN104292305A

Abstract

本发明公开了一种多肽、制备方法及其应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的多肽，是从北豹蛙皮肤中提取的一种生物活性多肽，即亮氨酸‑缬氨酸‑精氨酸‑甘氨酸‑半胱氨酸‑色氨酸‑苏氨酸‑赖氨酸‑丝氨酸‑酪氨酸‑脯氨酸‑脯氨酸‑赖氨酸‑脯氨酸‑半胱氨酸‑苯丙氨酸‑缬氨酸‑精氨酸多肽，能渗入带负电荷的单层脂质囊泡，抑制嗜酸性粒细胞和巨噬细胞集落的形成，降低嗜酸性粒细胞生成前体细胞和肥大细胞的活性，通过结合类胰蛋白酶的活性中心抑制类蛋白酶的活性，从而达到治疗过敏性鼻炎哮喘综合症的目的。

Description

一种多肽、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种多肽，同时还涉及该多肽的制备方法及其应用。

背景技术

过敏性鼻炎哮喘综合症是指同时发生的临床或亚临床的上和下呼吸道的过敏性症状，两者往往同时并存。过敏性鼻炎哮喘症的上、下呼吸道的免疫学和病理学改变分别是发生在鼻黏膜和支气管黏膜的过敏性炎症，即炎症细胞渗出，嗜酸性粒细胞、肥大/嗜碱细胞增多。目前对这种疾病的治疗尚无特效药物，如应用吸入性皮质激素或β-2兴奋剂等对哮喘的治疗也只能是缓解症状，并不能治愈或使病程逆转。

类胰蛋白酶是主要由肥大细胞分泌的一种炎症介质，在过敏反应炎症发生过程中起到一定的促进作用。肥大细胞能够分泌α、β和γ类胰蛋白酶，其中β-类胰蛋白酶是肥大细胞脱颗粒过程中释放的主要同工酶。β-类胰蛋白酶能够促进人类肥大细胞脱颗粒，加剧组胺型支气管收缩，增加嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的迁移以及肺肌细胞和呼吸道平滑肌细胞的增殖。研究证明类胰蛋白酶抑制剂可以降低小鼠哮喘模型中炎症的发生率，可以减少嗜酸性粒细胞的浸润和支气管的反应性。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于治疗过敏性鼻炎哮喘综合症的多肽。

本发明的第二个目的是提供一种多肽的制备方法。

本发明的第三个目的是提供一种多肽在制备治疗过敏性鼻炎的药物方面的应用。

本发明的第四个目的是提供一种多肽在制备治疗哮喘的药物方面的应用。

本发明的第五个目的是提供一种多肽在制备治疗过敏性鼻炎哮喘综合症的药物方面的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。具体为：亮氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-色氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丝氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-精氨酸多肽，记为亮-精多肽。

上述多肽的组织提取制备方法（动物组织提取法），包括下列步骤：

1）取北豹蛙皮肤，剁碎后置于4℃的酸化乙醇中消化12h，后离心分离，取上清液旋转浓缩，冷冻干燥，得冻干物；

2）体积排阻色谱法分离：将步骤1）所得冻干物置于浓度为2mol/L的乙酸中处理后，装入葡聚糖凝胶G50色谱柱中，以浓度为2mol/L的乙酸平衡，柱子流速10mL/h，收集色谱峰60组分，冻干，即得所述多肽。

所述酸化乙醇是由乙醇与浓度为0.7mol/L的盐酸按体积比为3:1的比例配制而成的；所述酸化乙醇的用量为：每g皮肤组织加入8mL酸化乙醇。

步骤1）中所述离心分离的温度为4℃，离心力为3000g，时间为30min。

上述多肽的化学合成制备方法（人工合成法），包括下列步骤：

1）以2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯为缩合剂，采用王树脂Fmoc-氨基酸-王树脂固相合成法逐一耦合每一个保护氨基酸，合成得到全保护的肽链树脂；

2）用切割试剂对侧链全保护的肽链树脂进行切割，将肽链从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，得多肽粗品；

3）将多肽粗品溶于二甲基亚砜与水按照体积比为2:8的比例配制而成的混合物中，制成多肽浓度为0.01mmol/L的粗品溶液；

4）将步骤3）所得粗品溶液采用制备型HPLC进行纯化，用电喷射质谱检测纯化的目的多肽，即得。

步骤2）中所述切割试剂为三氟乙酸、苯酚、水、三异丙基硅烷按照体积比为88:5:5:2的比例配制而成的混合物。

步骤4）中所述纯化的色谱条件为：色谱柱为Nucleosil C-18，250×20mm；流动相A为三氟乙酸/水=0.1:99.9（v/v），流动相B为三氟乙酸/乙腈/水=0.1:80.0:19.9（v/v/v）；线性梯度10%～70%B/70min，0.68%乙腈/min。

上述多肽在制备治疗过敏性鼻炎的药物方面的应用。

上述多肽在制备治疗哮喘的药物方面的应用。

上述多肽在制备治疗过敏性鼻炎哮喘综合症的药物方面的应用。

将所述多肽用灭菌双蒸水或PBS缓冲液稀释制成浓度为0.1～5mg/mL的混合物，使用时，将该混合物直接滴入鼻腔或雾化后吸入鼻腔。用药周期为每天一次，连续7天。

本发明的多肽，是从北豹蛙皮肤中提取的一种生物活性多肽，即亮氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-色氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丝氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-精氨酸多肽，能渗入带负电荷的单层脂质囊泡，抑制嗜酸性粒细胞和巨噬细胞集落的形成，降低嗜酸性粒细胞生成前体细胞和肥大细胞的活性，通过结合类胰蛋白酶的活性中心抑制类蛋白酶的活性，从而达到治疗过敏性鼻炎哮喘综合症的目的。

本发明的多肽的制备方法，可从北豹蛙皮肤中提取或人工合成法制备，工艺简单，操作方便，适合大规模工业化生产。

附图说明

图1为实施例5中AHR检测结果示意图；

图2为实施例5中实验小鼠肺泡组织HE染色图像定量分析结果示意图；

图3为实施例5中实验小鼠肺组织PAS染色图像定量分析结果示意图；

图4为实施例5中MSB染色检测肺组织ECM蛋白沉积结果示意图；

图5为实施例5中肺总胶原蛋白含量检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1

本实施例的多肽的组织提取制备方法（动物组织提取法），包括下列步骤：

1）酸化乙醇法提取：取北豹蛙皮肤，剁碎后置于4℃的酸化乙醇中消化12h，每克皮肤组织加入8mL酸化乙醇（所述酸化乙醇是由乙醇与浓度为0.7mol/L的盐酸按体积比为3:1的比例配制而成的），后在4℃、3000g条件下离心分离30min，取上清液旋转浓缩，冷冻干燥，得冻干物；

2）体积排阻色谱法分离：将步骤1）所得冻干物置于浓度为2mol/L的乙酸中处理后，装入葡聚糖凝胶G50色谱柱（90×1.6cm）中，以浓度为2mol/L的乙酸平衡，柱子流速10mL/h，收集色谱峰60组分，冻干，即得多肽。

所得多肽经Edman降解法测序分析，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：亮氨酸-缬氨酸-精氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-色氨酸-苏氨酸-赖氨酸-丝氨酸-酪氨酸-脯氨酸-脯氨酸-赖氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-精氨酸多肽。

将本实施例所得多肽用灭菌双蒸水稀释制成浓度为0.1mg/mL的混合物，将该混合物直接滴入鼻腔，治疗过敏性鼻炎哮喘综合症。用药周期为每天一次，连续7天。

实施例2

本实施例的多肽的化学合成制备方法（人工合成法），包括下列步骤：

1）以王树脂（0.6mmol/g）为起始树脂，采用Fmoc固相合成法逐一耦合每一个保护氨基酸，所述耦合采用的缩合剂为2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯，合成得到侧链全保护的肽链树脂；

2）用切割试剂对侧链全保护的肽链树脂进行切割，将肽链从树脂上裂解下来并去除侧链保护基团，得多肽粗品；所述切割试剂为三氟乙酸、苯酚、水、三异丙基硅烷按照体积比为88:5:5:2的比例配制而成的混合物；

4）将步骤3）所得粗品溶液采用制备型HPLC进行纯化，所述纯化的色谱条件为：色谱柱为Nucleosil C-18，250×20mm；流动相A为三氟乙酸/水=0.1:99.9（v/v），流动相B为三氟乙酸/乙腈/水=0.1:80.0:19.9（v/v/v）；线性梯度10%～70%B/70min（0.68%乙腈/min），用电喷射质谱检测纯化的目的多肽，即得。

上述化学合成制备方法中，步骤1）和步骤2）的具体操作过程如下：

a.预处理：用二氯甲烷清洗并膨胀Fmoc-Arg-王树脂，用二甲基酰胺（DMF）洗涤除去杂质；用印三酮检测剂检查Fmoc-Arg-王树脂的质量，以确保树脂没有游离的氨基酸，所述的Fmoc-Arg-王树脂起始浓度为0.6mmol/g；

b.脱保护：沿管壁小心加入含20％（v/v）哌啶的DMF溶液，缓慢摇匀5min；再加入过量的含20％（v/v）哌啶的DMF溶液冲洗管壁，用玻棒把颗粒物赶到管底，置放在摇床上进行脱保护反应20～30min；

c.印三酮检测：用DMF冲洗3～4次，洗掉哌啶；冲洗时，加入少量DMF覆盖过固体物，旋转活塞时只有DMF和哌啶可以通过玻砂孔隙中漏掉，剩余的固体混悬物即是脱了保护的Arg-王树脂；取少量反应物作检验，有明显蓝紫色为正常，说明氨基酸的氨基端已经脱保护；

d.缩合：往反应器中加入第二个保护氨基酸，以及缩合剂2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯，玻棒搅动混匀，放置在摇床上反应50min；

e.印三酮检测：用DMF洗涤3～4次，洗涤时DMF溶液和溶解在DMF中的未反应的过量氨基酸从玻砂孔隙中漏掉，而反应产物因连接在树脂上不能通过玻砂；取少量反应产物作检验，无色为正常，说明氨基酸的氨基端已经完全反应；

f.脱保护反应：按照b～e步骤重复进行脱保护反应，即印三酮检测是否脱保护、加入待反应氨基酸和缩合剂进行缩合反应、印三酮检测是否反应完全，直至完成整条肽链的合成，得侧链全保护的肽链树脂；

g.切割：取步骤f所得侧链全保护的肽链树脂，用DMF清洗3次，乙醇和二氯甲烷清洗3次，加入按照三氟乙酸、苯酚、水及三异丙基硅烷的体积比为88:5:5:2的比例混合配成的切割液，磁力搅拌2h，以切除王树脂和侧链保护基，溶液呈现亮红色或黄色，用旋转蒸发仪蒸干三氟乙酸，再用乙醚沉淀多肽；洗涤3次，加入冰醋酸溶解，过滤并冷冻干燥，得多肽粗品。

将本实施例所得多肽用PBS缓冲液稀释制成浓度为1mg/mL的混合物，将该混合物雾化吸入鼻腔，治疗过敏性鼻炎哮喘综合症。用药周期为每天一次，连续7天。

实施例3

本实施例采用实施例1所得多肽做动物试验。

材料与方法：

（1）动物分组：选择健康雌性Wistar大鼠50只，体重120～140g，随机分为5组，即对照组、模型组、治疗Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，每组10只，单笼饲养。

（2）过敏性鼻炎动物模型：第一天将1mL生理盐水、1.5mg卵清蛋白、2mg氢氧化铝溶胶和1×10¹⁰个灭活百日咳杆菌混合液分5点注射到大鼠皮下各0.2mL。第五天除百日咳外再次将混合液注入皮下。从第14天开始激发大鼠：每天用1%的卵蛋白生理盐水溶液滴鼻，每侧鼻孔各30μL，每天一次，共10次。滴鼻激发后30min内行为学（喷嚏和抓鼻次数）及症状表现（鼻分泌物）满足≥2分即为造模成功。

评分标准：0分，无喷嚏抓鼻、喷嚏及鼻分泌物；1分，喷嚏＜4个，轻度抓鼻，前鼻孔有鼻分泌物；2分，喷嚏4～10个，抓鼻频繁，鼻分泌物超过前鼻孔；3分，喷嚏＞11个，持续抓鼻、摩擦，脸部布满鼻分泌物。

（3）治疗方案：用实施例1所得多肽治疗Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，分别将多肽用PBS稀释至0.1、3、6mg/mL，每只滴鼻100μL，每天一次，共给药7天，记录行为学分数，降至2分以下即为初步确定有效。

（4）统计分析，数据用SPSS16.0统计一般线性模型软件分析，数据以平均数±标准差表示，组间比较采用邓肯氏法检验，以p＜0.05为差异显著标准。

治疗效果分析如表1所示。从表1可以看出，模型组过敏性鼻炎症状量化数据显著高于对照组，表明造模成功；本发明药物浓度0.1、3、6mg/mL治疗2天后，均有显著效果（p＜0.05）；用药7天，治疗Ⅱ、Ⅲ组较用药两天有进一步显著好转（p＜0.05）。这些结果表明，本发明药物在0.1-6mg/mL浓度范围内对大鼠过敏性鼻炎动物模型具有显著的疗效。

表1实施例3的动物试验治疗效果分析

治疗天数

对照组

模型组

治疗Ⅰ组

治疗Ⅱ组

治疗Ⅲ组

SEM

0

2.76a

2.79a

2.77a

0.021

2

0c

2.77a

2.01b

1.88b

2.03b

0.082

7

0d

2.73a

1.11b

0.68c

0.56c

0.086

注：同行无相同字母表示差异显著，p＜0.05。

实施例4

本实施例采用实施例2所得多肽做动物试验。

材料与方法：SPF级健康雄性BALB／C小鼠50只，6～8周龄，体质量18～22g，实验分为五组，即空白对照组、哮喘模型组、实施例3所得多肽治疗Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，每组10只，每只小鼠单笼饲养。

（1）哮喘模型组，在实验的第l、7、14天通过腹腔注射200μg卵清蛋白和500μg氢氧化铝配制成的溶液致敏。从第15天将小鼠置于特制塑料容器内，用5％卵清蛋白生理盐水10mL超声雾化吸入1h，每天一次，共激发10次。卵清蛋白激发后小鼠出现烦躁、呛咳、呼吸加快及轻度紫绀等哮喘发作症状。

（2）空白对照组，注射等量0.9％生理盐水代替卵清蛋白并吸入0.9％生理盐水10mL，余同哮喘组。

（3）实施例2所得多肽治疗Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组，分别将多肽用灭菌双蒸水稀释至0.1、2、5mg/mL。从第26天，分别每组每只超声雾化吸入亮-精多肽溶液30min，每天一次，连续7天，余同哮喘模型组。

（4）支气管肺泡灌洗液（BALF）嗜酸性粒细胞（Eos）细胞计数（%），末次雾化吸入24h后，以1％戊巴比妥钠（50mg／kg）腹腔注射麻醉后，以静脉留置导管作气管插管。以1、0.8mLPBS分2次作支气管肺泡灌洗，并收集BALF1mL。BALF在4℃下以400r／min离心5min，沉渣以100μL PBS液重悬。使用Wright-Giemsa染色后，在血细胞计数器下至少计数200个细胞做细胞分类计数。下腔静脉放血处死小鼠，打开胸腔，结扎右总支气管，于远端切下，放于l0％中性甲醛中保存。

（5）类胰蛋白酶检测，下腔静脉采血2mL，立刻置入含干燥EDTA的试管中混匀抗凝，静置30min，1500r/min离心10min，留取血浆冻存于-20℃待检。检测方法：采用酶标仪（美国Molecular Devices340PC型）以450nm波长读盘。在全自动体外变应原检测仪（瑞典Pharmacia UipCAP100）上进行类胰蛋白酶测定。

治疗效果见表2。从表2可以看出，哮喘组BALF Eos数量和类胰蛋白酶活性显著高于对照组，表明造模成功；采用本发明的药物分别以0.1、2、5mg/mL治疗7天后，两项指标均显著下降（p＜0.05），表明本亮-精多肽对小鼠哮喘模型具有显著疗效。

表2实施例2所得多肽对哮喘动物模型的治疗效果

注：同行无相同字母表示差异显著，p＜0.05。

实施例5

本实施例采用实施例1、2所制备的多肽进行动物试验。

实验设计：实验选择雄性BALB/C小鼠24只，随机分为4组，即对照组、模型组、治疗Ⅰ、Ⅱ，每组6只。过敏性鼻炎哮喘模型动物：第1天，将卵清蛋白40μg、氢氧化铝2mg、灭活百日咳杆菌1×10¹⁰个、生理盐水0.6mL混合液分三点进行腹膜注射；第8-10、15-17天，将卵清蛋白20μg和灭活百日咳杆菌1×10⁵个溶于生理盐水40μL对小鼠进行滴鼻处理；对照组：动物只进行氢氧化铝腹膜注射和生理盐水滴鼻处理。

检测指标：在第11、18天检测气道反应性（AHR），以确定诱发效果，在第0、25天检测AHR以观察发病前和治疗后的状况，以Penh表示；在第25天AHR检测后，用CO₂将鼠窒息死亡，眼内取血，以检血清IgE和IgG₁；取左侧肺组织，MSB染色检测胶原蛋白含量，HE染色检测支气管周围炎症程度，PAS染色检测粘液分泌量。

治疗方案：将实施例1和2所得多肽分别用生理盐水配制成3mg/mL浓度的亮-精多肽溶液，分别用于治疗组Ⅰ和Ⅱ；在第18天AHR检测后12h，每只超声雾化吸入亮-精多肽溶液20min，每天一次，连续7天。

治疗效果：本发明多肽对过敏性气道动物模型的治疗效果如下：

在过敏性呼吸系统疾病发生发展过程中，AHR是最典型的症状。检测AHR，通常以无创检测法，以Penh表示。本实验过程中对AHR检测结果如图1所示，其中横坐标实验处理时间（天）中，0为诱导前，11-18为强化后，25为治疗7天后。从表1可以看出，第0-18天，诱导和强化使得Penh迅速增加，表明造模成功。18-25天为治疗期，Penh急剧下降，治疗Ⅰ和Ⅱ组分别达到了211%和256%，均显著低于模型组902%（p＜0.05），表明本发明的多肽能显著降低过敏性鼻炎和哮喘小鼠动物模型的呼吸道的过敏性反应。

本实验中，对肺泡组织进行HE染色，在模型组小鼠支气管周围浓密排列着主要由淋巴细胞和嗜酸性粒细胞组成的单细胞类炎症渗出物，经本发明多肽治疗，极大地减少了这些渗出物（p＜0.05），图像定量分析结果见图2所示。同样，经PAS染色检测肺组织中黏液的分泌量，两个治疗组显著低于模型组（p＜0.05），结果见图3。这些检测结果表明本发明多肽对治疗支气管炎症和哮喘具有显著作用。

肺脏间质组织由胶原蛋白、弹性素及蛋白糖类构成，当纤维母细胞受到化学性或物理性伤害时，会分泌胶原蛋白进行肺间质组织的修补，进而造成肺脏纤维化，降低肺泡的气体交换功能。支气管上皮组织下细胞外基质蛋白（ECM）的沉积以及胶原蛋白总量是哮喘患者气道重塑的典型特征。本实验中，两个治疗组显著降低了这些指标（p＜0.05），如图4、5所示，表明本发明多肽对阻止肺纤维化，恢复肺的功能具有明显的疗效。

结论：本实验中，治疗组对卵清蛋白和百日咳诱导的过敏性鼻炎和哮喘小鼠动物模型的气道高反应性、支气管炎症渗出物、黏膜分泌、ECM蛋白以及肺胶原蛋白分泌量均具有显著的降低作用，表明本发明多肽对过敏性鼻炎哮喘综合症具有显著治疗作用。

Claims

1.如SEQ ID NO:1所示的多肽在制备治疗过敏性鼻炎的药物方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述多肽用灭菌双蒸水或PBS缓冲液稀释制成浓度为0.1~5mg/mL的混合物。