CN116003508A - 一种含氰基的硒代丁内酰胺化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐及其制备方法和用途，其中，R₁选自任选地被1至5个氟取代的(C₁‑C₆烷基)氨基、任选地被1至5个氟取代的C₁‑C₆烷基‑C(O)NH‑和任选地被1至5个氟取代的C₁‑C₆烷基‑S(O)₂NH‑。本发明通过用硒取代丁内酰胺环中的氧，所得的硒代丁内酰胺化合物与相应的丁内酰胺阳性对照药物相比，抗新冠病毒的活性显著提高。

Description

一种含氰基的硒代丁内酰胺化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种含氰基的硒代丁内酰胺化合物及其制备方法和用途。

背景技术

冠状病毒在系统分类上属套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）。冠状病毒属的病毒是具囊膜（envelope）、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。冠状病毒直径约80～120nm，基因组5′端具有甲基化的帽状结构，3′端具有poly(A)尾，基因组全长约27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒仅感染脊椎动物，如人、鼠、猪、猫、犬、狼、鸡、牛、禽类。冠状病毒最先是1937年从鸡身上分离出来，病毒颗粒的直径60～200nm，平均直径为100nm，呈球形或椭圆形，具有多形性。病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕，不同的冠状病毒的棘突有明显的差异。在冠状病毒感染细胞内有时可以见到管状的包涵体。

6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV（引发重症急性呼吸综合征）和MERS-CoV（引发中东呼吸综合征）。截至目前为止，已经出现了多种SARS-CoV-2的变异株。

单股正链RNA病毒，其刺突（S）蛋白与人体细胞膜上受体ACE2结合后进入细胞并释放出病毒RNA，病毒RNA在宿主细胞中翻译成两条多聚蛋白pp1a和pp1ab，这两种多聚蛋白被3CLpro和PLpro切割，裂解为多种新冠病毒所需的非结构蛋白（NSP），随后在RNA聚合酶（RdRp）等多种非结构蛋白的共同作用下复制-转录，翻译出子代结构蛋白，再与子代正链RNA相结合，通过高尔基体和ERGIC管腔组装成为新的病毒粒子释放。

目前药物主要围绕病毒侵入人体增殖过程中不可或缺的刺突（S）蛋白、3CL蛋白酶、RNA聚合酶三个靶点开展研究。在炙手可热的口服药赛道中，辉瑞的Paxlovid最为瞩目。Paxlovid已在全球10多个国家被批准或授权紧急使用。Paxlovid是由两种抗病毒药物组成，其中PF-07321332就是奈玛特韦（Nirmatrelvir），是一种CL蛋白酶抑制剂。奈玛特韦抑制新冠病毒复制，利托那韦通过抑制奈玛特韦的体内代谢，延长其体内有效血药浓度。然而，本领域仍然需要更加有效的药物，以有效防治。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种含氰基的硒代丁内酰胺化合物及其制备方法和用途。本发明通过对PF-07321332及其类似物进行结构改造，显著提高了PF-07321332及其类似物毒的活性。

在本发明的上下文中，所述包括SARS-CoV-2原始毒株以及Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron等多种SARS-CoV-2变异株。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一方面，本发明提供一种式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，R₁选自任选地被1至5个氟取代的(C₁-C₆烷基)氨基、任选地被1至5个氟取代的C₁-C₆烷基-C(O)NH-和任选地被1至5个氟取代的C₁-C₆烷基-S(O)₂NH-。

优选地，其中R₁选自CF₃C(O)NH-、CF₃S(O)₂NH-、CH₃C(O)NH-、CH₃CH₂C(O)NH-或CF₃CH₂NH-。优选地，所述化合物的结构如下所示：

另一方面，本发明提供一种制备所述的式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐的方法，包括以下步骤：

将式（II）所示的化合物与硒试剂在溶剂中混合，并于10~40℃下反应1~3小时，得到式（I）所示的化合物；其中R₁如上所定义。

优选地，所述溶剂选自甲苯、苯、氯苯和二甲苯中的一种或多种；所述硒试剂为Woollins试剂或硒；所述反应在室温下进行；和/或所述反应进行1.5~2.5h。

优选地，本发明所述的方法还包括反应结束后向反应混合物中加入有机溶剂和碱水溶液搅拌，分液，蒸干有机相，和柱层析分离的步骤；更优选地，所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基叔丁基醚和/或乙酸异丙酯，和/或所述碱水溶液为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾、氢氧化钠和/或氢氧化钾的水溶液。

又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述的式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或赋形剂。

优选地，所述的药物组合物还包含维生素C。将本发明的式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐与维生素C组合后，可以进一步提高其抗病毒治疗效果。

另一方面，本发明还提供了所述式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗由冠状病毒感染引起的疾病的药物中的用途，优选地，所述冠状病毒为新冠病毒。

本发明人出乎意料地发现，当用硒替代化合物PF-07321332或其类似物的丁内酰胺环上的氧时，得到的化合物与相应的未进行硒代的化合物PF-07321332或其类似物相比，活性显著提高。例如，本发明的化合物Y7201对于SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的抑制活性约是PF-07321332的2倍以上。本发明的化合物与相应的未硒代的化合物相比具有显著提高的抗SARS-CoV-2 β-冠状病毒的活性。本发明的化合物可以制备用于预防和/或治疗由新冠病毒（包括SARS-CoV-2原始毒株以及Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron等多种SARS-CoV-2变异株）感染所诱发的疾病和/或症状的药物，且具有显著提高的疗效。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明进行进一步的详细说明，使得本领域技术人员更全面地理解本发明。具体实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不以任何方式限定本发明。

以下实施例中所用试剂和原料，如无特别说明，均为可商购获得。其中，PF-07321332购自网化（山东）化学科技有限公司；硒试剂（Woollins试剂）购自药明览博（武汉）化学科技有限公司；EV71 3Cpro购自Sigma-Aldrich试剂公司。

实施例1

将PF-07321332（500mg）加入甲苯（10mL）中，加入Woollins试剂（600mg），氮气保护下室温反应2小时。加入乙酸乙酯和碳酸氢钠水溶液搅拌15分钟，分液，有机相干燥旋干，柱层析得固体Y7201 350mg，收率62.2%。MS(m/z): 564.2(M+H)⁺。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)δ9.43-9.30 (m, 1 H), 8.96 (d, J=8.3 Hz, 1 H), 7.22 (s, 1 H), 5.02-4.90 (m,1H), 4.44-4.35 (m, 1H), 4.13 (s, 1H), 3.96-3.82 (m, 1H), 3.65 (d, J=10.8 Hz,1H), 3.03-2.89 (m, 1H), 2.89-2.68 (m, 1H), 2.35-2.23 (m, 1H), 2.19-1.99 (m,2H), 1.71-1.59 (m, 2H), 1.59-1.48 (m, 1 H), 1.30 (d, J=7.7 Hz, 1H), 1.02 (s,3H), 0.98 (s, 9H), 0.85 (s, 3H)。

实施例2：化合物对SARS-CoV-2 3CL蛋白酶的抑制活性评价

化合物对新型冠状病毒3CL蛋白酶（SARS-CoV-2 3CLpro）的抑制活性测试。利用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer FRET）技术测定针对3CL蛋白酶的抑制剂的酶水平抑制活性。

<操作流程>

在96孔板上，每孔中加入27.5μL酶缓冲液（20mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mMEDTA，pH7.3），同时加入2.5μL不同浓度的化合物和5μL EV71 3Cpro（最终浓度3μM）。在37℃下共孵育20min。之后加入15μL缓冲液稀释的荧光底物（最终浓度20μM）。利用Gen5荧光分度计测定荧光参数，激发波长和发射波长分别为340nm和490nm，保持37℃，10min后读取数据。阴性对照，不加入化合物，其余操作相同。

<各测定项目值的计算>

所得数据利用软件GraphPadPrism7.0处理，计算IC₅₀值。实验结果如表1所示。

由以上结果可知，Y7201显示出显著提高的SARS-CoV-2 3CL蛋白酶抑制活性，约是PF-07321332的2倍以上。由于SARS-CoV-2 3CL蛋白酶是SARS-CoV-2原始毒株以及包括Alpha、Beta、Gamma、Delta和Omicron在内的多种SARS-CoV-2变异株所共有的，因此，本发明的化合物对SARS-CoV-2原始毒株及其变异株均有抑制作用。本发明的化合物可以制备用于预防和/或治疗由新冠病毒感染所诱发的疾病和/或症状的药物，且具有显著提高的疗效。

实施例3：抗SARS-CoV-2 β-冠状病毒活性测定

在12孔一次性细胞培养板中，制备融合的细胞培养物单层。将Vero16细胞维持在补充有10%FBS的DMEM中，并补充1%青霉素/链霉素。Vero16细胞培养物的顶端表面在用1×PBS感染前24小时和1小时洗涤，然后在37℃用1×PBS感染1.5小时。使用表达绿色荧光蛋白的重组SARS-CoV-2 β-冠状病毒（SARS-CoV-2β RFP）、以0.1pfu/细胞的感染复数感染Vero16细胞。除去顶端清洗液，加入病毒接种物，并将接种的培养物在37℃，5%CO₂孵育3小时。除去接种物，Vero16细胞的顶端表面用500μL 1×PBS洗涤3次以除去残余病毒。以10μM开始制备实施例化合物的3倍系列稀释液，一式三份，并在感染前大约30分钟将其加入培养物基底外侧的Vero16细胞培养基中。在48小时温育后通过细胞培养物的荧光成像评估病毒复制。此外，通过在Vero16细胞单层上通过空斑测定测量Vero16顶端洗液中感染性病毒的产量以及通过实时PCR测定定量来自总细胞RNA的病毒RNA产量来定量病毒复制。测定结果示于表2。

由表2的结果可以看出，本发明的化合物具有突出的抗SARS-CoV-2β-冠状病毒的活性，并且与阳性对照药物PF-07321332相比，本发明的化合物抗SARS-CoV-2β-冠状病毒的活性显著提高。

附图说明：

图1为奈玛特韦(Nirmatrelvir)，是一种新冠病毒的3CL蛋白酶抑制剂；

图2为含氰基的硒代丁内酰胺化合物的结构通式；

图3为Y7201的结构；

图4为含氰基的硒代丁内酰胺化合物反应式；

图5为合成Y7201的化合物反应式；

图6为实施例2中所得数据利用软件GraphPadPrism7.0处理，计算的IC₅₀值；

图7为通过在Vero16细胞单层上通过空斑测定测量Vero16顶端洗液中感染性病毒的产量以及通过实时PCR测定定量来自总细胞RNA的病毒RNA产量来定量病毒复制的测定结果；

图8为含氰基的硒代丁内酰胺化合物的结构通式。

Claims (9)

1.一种式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐：其中，R₁选自任选地被1至5个氟取代的(C₁-C₆烷基)氨基、任选地被1至5个氟取代的C₁-C₆烷基-C(O)NH-和任选地被1至5个氟取代的C₁-C₆烷基-S(O)₂NH-。

2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R₁选自CF₃C(O)NH-、CF₃S(O)₂NH-、CH₃C(O)NH-、CH₃CH₂C(O)NH-或CF₃CH₂NH-。

3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述化合物的结构如下所示：

4.一种制备权利要求1至3中任一项所述的式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐的方法，包括以下步骤：将式（II）所示的化合物与硒试剂在溶剂中混合，并于10~40℃下反应1~3小时，得到式（I）所示的化合物；其中R₁如权利要求1至3中任一项所定义。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述溶剂选自甲苯、苯、氯苯和二甲苯中的一种或多种；所述硒试剂为Woollins试剂或硒；所述反应在室温下进行；和/或所述反应进行1.5~2.5h。

6.如权利要求4所述的方法，还包括反应结束后向反应混合物中加入有机溶剂和碱水溶液搅拌，分液，蒸干有机相，和柱层析分离的步骤；优选地，所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基叔丁基醚和/或乙酸异丙酯，和/或所述碱水溶液为碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸钾、氢氧化钠和/或氢氧化钾的水溶液。

7.一种药物组合物，包含权利要求1至3中任一项所述的式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体或赋形剂。

8.如权利要求7所述的药物组合物，还包含维生素C。

9.权利要求1至3中任一项所述的式（I）所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防和/或治疗由冠状病毒感染引起的疾病的药物中的用途；优选地，所述冠状病毒为新冠病毒。

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