CN116003364A - 微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法；该方法先氯化胆碱和草酸混合，搅拌至形成澄清透明的低共熔试剂，稀释；将地奥司明溶解于稀释后的低共熔试剂中，混匀；将溶解了地奥司明的低共熔试剂进行微波处理，控制微波功率为300‑500W；将微波处理过后的低共熔试剂中加入超纯水，冷藏；离心分离，洗涤冻干，得香叶木素。相较于酸水解法，本发明不要使用长时间的高温处理，能耗较低，也不需要使用强酸溶剂，对环境较为友好；相较于酶解法，本发明不需要使用价格昂贵的糖苷酶，水解成本较低。本发明水解地奥司明的效率高达98％以上，能耗低，成本低，所使用的低共熔试剂可回收再利用。
Description
技术领域
本发明涉及香叶木素的制备，具体涉及一种微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法。
背景技术
香叶木素是天然黄酮类化合物的一种，化学名称为3',5,7-三羟基-4'-甲氧基黄酮，分子式为C16H12O6，分子量为300.26，结构式如下：
香叶木素粉末呈黄色，熔点为256-258℃，不溶于水，但溶于弱碱性溶液和甲醇、乙醇等有机溶剂。药理上，香叶木素被报道具有抗氧化、抗炎、预防骨质疏松、保护视力和抗癌等功效，具有巨大的应用价值和潜力。香叶木素在自然界中主要分为游离型或糖苷型两种，其中主要以其糖苷型(地奥司明)存在于柠檬、柑橘、菊花、豆科以及橄榄等植物中。
现有关于制备香叶木素的方法主要有直接提取法、脱氢转化法和地奥司明水解法。直接提取法制备香叶木素设备要求高并且得率较低，难以达到满意的产量。例如中国发明专利申请CN102304113A公开香叶木素的分离纯化方法中，需要使用超临界CO2在20-30MPa压力下，萃取薄荷全草60-180分钟后才能得到香叶木素。由于香叶木素在植物中含量很少，在该方法中，经过纯化后香叶木素的得率也仅为0.023％，得率很低。
脱氢转化法主要是通过氧化反应使橙皮素脱氢转化来制备香叶木素。脱氢转化法虽然香叶木素得率高，但该方法步骤繁琐、能耗大、成本高且在反应过程中需要使用有毒试剂会污染环境。例如中国发明专利CN111100104B公开的橙皮素脱氢制备香叶木素的方法中，需要用到有毒的二甲基甲酰胺、甲苯磺酸、三甲基氯硅烷和二甲基亚砜使橙皮素脱氢，并且该反应还需要在80-120℃温度下反应7小时以上才能够完全进行。
由于香叶木素大多以其糖苷的形式(地奥司明)存在于植物中，所以目前制备香叶木素主要还是通过水解其糖苷地奥司明来制备。现有关于水解地奥司明制备香叶木素的方法主要有酸水解法和酶解法。采用酸水解法水解地奥司明需要长时间的高温处理，能耗成本高，同时反应过程中还会产生强酸性废液，增加企业后续无害化处理的成本。例如中国发明专利申请CN104119308A公开的一种香叶木素的半合成工艺，包括：向地奥司明中加入水和浓硫酸进行水解，抽滤，对滤饼进行水洗，得香叶木素粗品；在香叶木素粗品中加入浓度为50-60％的乙醇，加热回流，过滤，滤液减压浓缩，降温结晶，得香叶木素一次纯品；在香叶木素一次纯品中加入浓度为90-95％的乙醇，加热回流，过滤，滤液减压浓缩，降温结晶，得香叶木素。该技术酸水解地奥司明制备香叶木素的方法中需要加入浓硫酸提供酸解过程中所需的质子，并且该反应还需要在高温反应釜中100-120℃水解9-12小时后，才能使地奥司明水解生成香叶木素，能耗成本非常高，而且生产周期长；该技术用到的强酸也存在生产安全和环保的问题。
采用酶解法水解地奥司明，条件温和、产物纯度高并且该方法无有毒废液产生，较为绿色环保。但是酶解法所使用的糖苷酶需要经过微生物培养、发酵、提取纯化等多个步骤后获取，价格较为昂贵，也增加了水解地奥司明的成本。例如中国发明专利申请CN114317630A公开的香叶木素制备方法中所使用的橙皮苷酶、鼠李糖苷酶、地奥司明酶和葡萄糖苷酶在市场上价格都较为昂贵，且在该方法中，糖苷酶使用后也很难进行回收再利用，水解成本较高。
从上述现有技术可见，水解地奥司明制备香叶木素的过程中，酸水解法和生物转化法都存在效率低和成本高等问题。酸水解法需要长时间的高温处理(100-120℃，9-12小时)，能耗成本高；而生物转化法需要使用价格昂贵的糖苷酶(2770元/g，数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，酶解过程至少需要8小时以上才能使完全地奥司明完全水解，效率也较低。此外，在酸水解过程中还需要使用到强酸溶液，会产生酸性废液，对环境不友好。所以针对这些问题，本领域急需一种高效、绿色环保且成本低廉的方法来水解地奥司明制备香叶木素。
发明内容
为了克服现有技术上的不足及缺陷，本发明的目的在于提供一种利用微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，以实现低能耗，低成本、高效率且绿色环保无有机酸性废液的产生，并且实现生产周期短，目标产品得率高的目的。
本发明的目的通过以下步骤实现
微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，包括如下步骤：
1)氯化胆碱和草酸混合，搅拌至形成澄清透明的低共熔试剂，稀释；
2)将地奥司明溶解于稀释后的低共熔试剂中，混匀；
3)将溶解了地奥司明的低共熔试剂进行微波处理，控制微波功率为300-500W，微波处理时间为2-10分钟；
4)将微波处理过后的低共熔试剂中加入超纯水，冷藏；离心分离，洗涤冻干，得香叶木素。
为进一步实现本发明目的，优选地，步骤1)中，所述的氯化胆碱和草酸摩尔比为1.5:1-2:1。
优选地，步骤1)中，所述的搅拌在80-95℃水浴中进行。
优选地，步骤1)中，所述的稀释是用超纯水稀释。
优选地，所述的超纯水稀释后的低共熔试剂体积浓度为85％-95％。
优选地，步骤3)中，所述的微波处理时间为2-6分钟。
优选地，步骤4)中，所述的超纯水加入量为低共熔试剂体积的6-10倍。
优选地，步骤4)中，所述的冷藏的温度为2-6℃；冷藏的时间为3-5小时。
优选地，步骤4)中，所述的洗涤用超纯水洗涤，洗涤的次数为3-5次。
优选地，步骤4)中，所述的离心分离后的液体倒入旋转蒸发装置，40-60℃温度下旋转蒸发出水分；直至水分全部蒸干，收集的高黏度组分为回收成功的低共熔试剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果。
1)针对水解地奥司明制备香叶木素，本发明发现，氯化胆碱(Choline chloride，Ch)和草酸(Oxalic acid，Oxa)形成的低共熔试剂(Ch/Oxa)的溶解性明显优于传统有机溶剂甲醇和乙醇，能很好溶解地奥司明，尤其是该低共熔试剂质子提供能力要大于盐酸、硫酸等强酸，使该低共熔试剂具有在地奥司明水解反应中完全替代酸性有机溶剂的能力。
2)本发明的氯化胆碱和草酸形成的低共熔试剂可以有效克服现有酸水解地奥司明制备香叶木素技术措施存在的需要长时间的高温处理，能耗成本高，周期长，同时反应过程中还会产生强酸性废液，增加企业后续无害化处理的成本的问题；本发明利用微波结合低共熔试剂的方法水解地奥司明制备香叶木素，相较于传统酸水解法，不需要使用硫酸盐酸等强酸，所使用的低共熔试剂可回收，是一种绿色环保的制备工艺。而且其他的低共熔试剂都达不到本发明氯化胆碱和草酸形成的低共熔试剂的效果，如氯化胆碱和柠檬酸、氯化胆碱和乙酰丙酸、氯化胆碱和酒石酸等低共熔试剂经测试效果君不佳。
3)本发明氯化胆碱和草酸形成的低共熔试与微波处理协同配合作用，如实施例测试，微波与低共熔试剂协同处理地奥司明转化率超过98.65％；微波与酸水解法联用降解地奥司明的转化率仅为3.56％，水热联用Ch/Oxa的转化率较高，但耗时要显著高于微波协同Ch/Oxa处理，在降解同样体积浓度地奥司明时，微波与低共熔试剂协同处理时间最短，整个处理过程仅耗时2min，其处理时间要远低于水热联用Ch/Oxa的30min、酸水解法的9h和酶解法8h，其处理效率分别是这三种方法的15倍，270倍和240倍。
4)本发明微波协同Ch/Oxa处理过程中，相较于酶解法中所使用的糖苷酶2770元/g，本发明方法中使用的草酸和氯化胆碱价格低至0.212元/g和0.176元/g，成本优势非常明显。
5)本发明使用的低共熔溶剂还能够回收再利用，能够进一步降低制备成本，同时也不产生酸性有机废液，对环境较为友好。
附图说明
图1是微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同水解地奥司明的反应原理图。
图2是本发明中地奥司明的标准品液相色谱图。
图3是本发明中香叶木素的标准品液相色谱图。
图4是本发明实施例1中地奥司明未处理前的色谱峰图。
图5是本发明实施例1中地奥司明经过微波与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理后的色谱峰图。
图6是本发明实施例2中地奥司明未处理前的色谱峰图。
图7是本发明实施例2中地奥司明经过微波与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理后的色谱峰图。
图8是本发明实施例3中地奥司明未处理前的色谱峰图。
图9是本发明实施例3中地奥司明经过微波与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理后的色谱峰图。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方式不限如此。
实施例中，所用的微波设备为山东霍尔德公司的HD-WB6H高通量智能型微波设备。
如图1所示，本发明地奥司明在Ch/Oxa中其糖苷键首先会被质子攻击发生质子化使其糖苷键断裂，生成苷元和糖的阳碳离子中间体(过渡态)，随后阳碳离子中间体溶剂化脱去质子形成糖分子。将溶于地奥司明的Ch/Oxa放入微波中进行处理时，反应体系中粒子在微波作用下其扩散系数增加，增加了溶液中质子接触到地奥司明糖苷键的几率，使糖苷键更容易发生质子化断裂。在微波作用下，地奥司明分子发生振动能显著降低地奥司明脱糖苷以及形成过渡态产物所需的活化能，提高反应效率，实现地奥司明的高效水解。待反应后，往低共熔试剂中加入水，使香叶木素析出。由于水即是氢键的受体也是氢键的供体，水的加入会破坏低共熔试剂的稳定性使其溶解性下降。而香叶木素因其水溶性较差，在低共熔试剂稳定性被破坏的情况下会被析出沉淀。待收集分离沉淀后的香叶木素后，将溶液旋蒸使水分分离后即又可对低共熔试剂实现回收再利用，从而实现整个反应过程无废液产生。
实施例1
一种微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，包括如下步骤：
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和草酸按照摩尔比1.5:1混合，随后置于80℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Oxa，将Ch/Oxa配置成85％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)水解地奥司明：将20mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为微波功率300W，处理时间为2分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
分离样品与回收低共熔试剂：往微波处理过后的低共熔试剂样品中加入6倍体积的超纯水，随后在2℃低温下冷藏3小时。将沉淀离心分离，用超纯水洗涤三次后冻干得到香叶木素。收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，40℃温度下旋转蒸发分离混合液中水分。直至混合液中水分全部蒸干分离后，收集的高黏度组分即为回收成功的低共熔试剂组分。
对比例1
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和柠檬酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Cit，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Cit配置成85％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Cit)水解地奥司明：将20mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率300W，处理时间为2分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例2
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Lev，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Lev配置成85％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Lev)水解地奥司明：将20mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率300W，处理时间为2分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例3
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和酒石酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Tar，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Tar配置成85％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Lev)水解地奥司明：将20mg地奥司明标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率300W，处理时间为2分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例4
微波与酸水解法联用水解地奥司明：将20mg地奥司明标准品溶于20mL含有2％的硫酸水溶液，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率300W，处理时间为2分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例5
水热与低共熔试剂联用水解地奥司明：将20mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后置于反应釜中100℃加热处理30分钟后采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例6
酸水解法水解地奥司明：将20mg地奥司明标准品溶于20mL含有2％的硫酸水溶液，随后置于反应釜中100℃水解处理9小时，随后采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例7
酶解法水解地奥司明：将20mg地奥司明标准品和β-葡萄糖糖苷酶溶于磷酸缓冲液-甲醇混合溶液(pH 6.0)，于37℃孵育8小时后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
地奥司明的转化情况和香叶木素的生成情况采用高效液相色谱法进行检测。吸取样品100μL(与900μL色谱级甲醇混匀后，过0.45μm尼龙膜后备用。检测设备为安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，色谱柱型号为Thermo Accucore XL C18(250mm×4.6mm,4μm)，0.2％乙酸水和乙腈作为检测流动相。检测程序为：0.00-2.00min,B:5-5％,2.00-10.00min,B:5-30％,10.00-12.00min,B:30-100％,12.00-18.00min,B:100-100％,18.00-20.00min,B:100-5％,20.00-25.00min,B:5-5％。流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，检测温度为25℃。地奥司明水解为香叶木素的效率用转化率和转化比两个指标来评价。
地奥司明转化率(％)＝消耗的地奥司明质量/地奥司明总质量×100
地奥司明转化比＝消耗地奥司明的摩尔质量/生成香叶木素的摩尔质量
图4是本发明实施例1中地奥司明未处理前的色谱峰图。图5是本发明实施例1中地奥司明经过微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理后的色谱峰图。相对于图2地奥司明的标准品液相色谱图和图3的香叶木素的标准品液相色谱图，分别标定实施例中地奥司明样品在液相色谱中的出峰位置和香叶木素样品在液相色谱中的出峰位置。图4和图5显示了微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理前后样品中地奥司明和香叶木素的信号峰变化情况。由图4和图5可知，经过微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同水解后，样品中的地奥司明信号峰都变成了香叶木素信号峰，这说明经过处理后，溶液中的地奥司明都水解成了香叶木素。
实施例1与对比例1-3的转化率和转化比结果如表1所示。由表1可知四种方法的地奥司明转化比都接近1，这说明四种降解方法中，降解的地奥司明几乎都转化成了香叶木素。相较于其它三种酸基低共熔溶剂(Ch/Lev，Ch/Cit和Ch/Tar)，微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理地奥司明的转化率达到98.65％，远高于其他三种方法。这可能是由于Ch/Oxa相较于其它三种酸基低共熔溶剂其提供质子的能力更强所致。
实施例1与对比例4-7共五种地奥司明降解方法的转化率和转化比结果如表2所示。由表2可知五种方法的地奥司明转化比都接近1，这说明五种降解方法中降解的地奥司明几乎都转化成了香叶木素。五种方法中，微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理地奥司明转化率最高(98.65％)。微波与酸水解法联用降解地奥司明的效率较差，转化率仅为3.56％，而水热联用Ch/Oxa的转化率较高，但耗时要显著高于微波与Ch/Oxa协同处理，该结果说明微波与Ch/Oxa协同处理在水解地奥司明的效果上要显著强于微波联用酸水解和水热联用Ch/Oxa。在降解同样体积浓度地奥司明时，微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理时间最短，整个处理过程仅耗时2min，其处理时间要远低于水热联用Ch/Oxa(30min)、酸水解法(9h)和酶解法(8h)，其处理效率分别是这三种方法的15倍，270倍和240倍。与此同时，微波与Ch/Oxa协同处理过程中，相较于酶解法中所使用的糖苷酶(2770元/g，数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，本方法中使用的草酸和氯化胆碱价格低至0.212元/g和0.176元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，成本优势非常明显。并且该方法所使用的低共熔溶剂还能够回收再利用，能够进一步降低制备成本，同时也不产生酸性有机废液，对环境较为友好。
表1.不同低共熔溶剂对微波转化地奥司明的影响
表2.不同地奥司明水解方法的转化率和转化比结果
实施例2
一种微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，包括如下步骤：
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和草酸按照摩尔比1.75:1混合，随后置于90℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Oxa，将Ch/Oxa配置成90％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)水解地奥司明：将40mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理。处理条件为微波功率400W，处理时间为4分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
分离样品与回收低共熔试剂：往微波处理过后的低共熔试剂样品中加入8倍体积的超纯水，随后在4℃低温下冷藏4小时。将沉淀离心分离，用超纯水洗涤三次后冻干得到香叶木素。收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，50℃温度下旋转蒸发分离混合液中水分。直至混合液中水分全部蒸干分离后，收集的高黏度组分即为回收成功的低共熔试剂组分。
对比例8
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和柠檬酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Cit，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Cit配置成90％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Cit)水解地奥司明：将40mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率400W，处理时间为4分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例9
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Lev，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Lev配置成90％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Lev)水解地奥司明：将40mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率400W，处理时间为4分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例10
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和酒石酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Tar，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Tar配置成90％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Lev)水解地奥司明：将40mg地奥司明标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率400W，处理时间为4分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例11
微波与酸水解法联用水解地奥司明：将40mg地奥司明标准品溶于20mL含有2％的硫酸水溶液，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率400W，处理时间为4分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例12
水热联用低共熔试剂水解地奥司明：将40mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后置于反应釜中100℃加热处理30分钟后采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例13
酸水解法水解地奥司明：将40mg地奥司明标准品溶于20mL含有2％的硫酸水溶液，随后置于反应釜中100℃水解处理9小时，随后采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例14
酶解法水解地奥司明：将40mg地奥司明标准品和β-葡萄糖糖苷酶溶于磷酸缓冲液-甲醇混合溶液(pH 6.0)，于37℃孵育8小时后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
地奥司明的转化情况和香叶木素的生成情况采用高效液相色谱法进行检测。吸取样品100μL(与900μL色谱级甲醇混匀后，过0.45μm尼龙膜后备用。检测设备为安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，色谱柱型号为Thermo Accucore XL C18(250mm×4.6mm,4μm)，0.2％乙酸水和乙腈作为检测流动相。检测程序为：0.00-2.00min,B:5-5％,2.00-10.00min,B:5-30％,10.00-12.00min,B:30-100％,12.00-18.00min,B:100-100％,18.00-20.00min,B:100-5％,20.00-25.00min,B:5-5％。流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，检测温度为25℃。地奥司明水解为香叶木素的效率用转化率和转化比两个指标来评价。
地奥司明转化率(％)＝消耗的地奥司明质量/地奥司明总质量×100
地奥司明转化比＝消耗地奥司明的摩尔质量/生成香叶木素的摩尔质量
图6是本发明实施例2中地奥司明未处理前的色谱峰图。图7是本发明实施例2中地奥司明经过微波与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)处理后的色谱峰图。相对于图2地奥司明的标准品液相色谱图和图3的香叶木素的标准品液相色谱图，分别标定实施例中地奥司明样品在液相色谱中的出峰位置和香叶木素样品在液相色谱中的出峰位置。图6和图7显示了微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理前后的样品中地奥司明和香叶木素变化情况。由图6和图7可知，经过微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理后，样品中的地奥司明信号峰都变成了香叶木素信号峰，这说明经过处理后，溶液中的地奥司明都水解成了香叶木素。
实施例2与对比例8-10的转化率和转化比结果如表3所示。由表3可知，四种方法的地奥司明转化比都接近1，这说明四种降解方法中，降解的地奥司明几乎都转化成了香叶木素。相较于其它三种酸基低共熔溶剂(Ch/Lev，Ch/Cit和Ch/Tar)，微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理水解地奥司明转化率高达99.15％，远高于其他三种处理方法。这可能是由于Ch/Oxa相较于其它三种酸基低共熔溶剂其提供质子的能力更强所致。
表3.不同低共熔溶剂对微波转化地奥司明的影响
实施例2与对比例11-14共五种地奥司明降解方法的转化率和转化比结果如表4所示。由表4可知五种方法的地奥司明转化比都接近1，这说明五种降解方法中降解的地奥司明几乎都转化成了香叶木素。五种方法中，微波与低共熔试剂(Ch/Oxa协同处理水解地奥司明的转化率最高(98.65％)。微波与酸水解法联用降解地奥司明的效率较差，转化率仅为2.59％，而水热联用Ch/Oxa的转化率较高，但耗时要显著高于微波联用Ch/Oxa，该结果说明微波Ch/Oxa协同处理在水解地奥司明的效果上要显著强于微波联用酸水解和水热联用Ch/Oxa。在降解同样体积浓度地奥司明时，微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理水解的时间最短，整个处理过程仅耗时4min，其处理时间要远低于水热联用Ch/Oxa(30min)、酸水解法(9h)和酶解法(8h)，其处理效率分别是这三种方法的7.5倍，135倍和120倍。微波与低共熔试剂Ch/Oxa协同处理水解过程中，相较于酶解法中所使用的糖苷酶(2770元/g，数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，本方法中使用的草酸和氯化胆碱价格低至0.212元/g和0.176元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，成本优势非常明显。并且该方法所使用的低共熔溶剂还能够回收再利用，能够进一步降低制备成本，同时也不产生酸性有机废液，对环境较为友好。
表4.不同地奥司明水解方法的转化率和转化比结果
实施例3
一种微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，包括如下步骤：
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和草酸按照摩尔比2:1混合，随后置于95℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Oxa，将Ch/Oxa配置成95％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Oxa)水解地奥司明：将50mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入脉冲处理室中进行处理，处理条件为微波功率600W，处理时间为6分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
分离样品与回收低共熔试剂：往微波处理过后的低共熔试剂样品中加入10倍体积的超纯水，随后在6℃低温下冷藏5小时。将沉淀离心分离，用超纯水洗涤三次后冻干得到香叶木素。收集离心分离后的液体，倒入旋转蒸发装置，60℃温度下旋转蒸发分离混合液中水分。直至混合液中水分全部蒸干分离后，收集的高黏度组分即为回收成功的低共熔试剂组分。
对比例15
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和柠檬酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Cit，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Cit配置成95％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Cit)水解地奥司明：将50mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率600W，处理时间为6分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例16
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和乙酰丙酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Lev，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Lev配置成95％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Lev)水解地奥司明：将50mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率600W，处理时间为6分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例17
低共熔试剂的配制：氯化胆碱和酒石酸按照摩尔比1:1混合，随后置于85℃水浴中搅拌，直至形成澄清透明的低共熔试剂Ch/Tar，加入超纯水将低共熔试剂Ch/Tar配置成95％体积浓度的反应液备用。
微波与低共熔试剂联用(Ch/Lev)水解地奥司明：将50mg地奥司明标准品溶于60mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率600W，处理时间为6分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例18
微波与酸水解法联用水解地奥司明：将50mg地奥司明标准品溶于20mL含有2％的硫酸水溶液，随后将混匀的样品放入微波处理室中进行处理。处理条件为微波功率600W，处理时间为6分钟。处理完毕后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例19
水热联用低共熔试剂水解地奥司明：将50mg地奥司明标准品溶于20mL之前配制好的低共熔试剂中搅拌均匀，随后置于反应釜中100℃加热处理30分钟后采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例20
酸水解法水解地奥司明：将50mg地奥司明标准品溶于20mL含有2％的硫酸水溶液，随后置于反应釜中100℃水解处理9小时，随后采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
对比例21
酶解法水解地奥司明：将50mg地奥司明标准品和β-葡萄糖糖苷酶溶于磷酸缓冲液-甲醇混合溶液(pH 6.0)，于37℃孵育8小时后，采用高效液相色谱法测定地奥司明和香叶木素含量变化情况。
地奥司明的转化情况和香叶木素的生成情况采用高效液相色谱法进行检测。吸取样品100μL(与900μL色谱级甲醇混匀后，过0.45μm尼龙膜后备用。检测设备为安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，色谱柱型号为Thermo Accucore XL C18(250mm×4.6mm,4μm)，0.2％乙酸水和乙腈作为检测流动相。检测程序为：0.00-2.00min,B:5-5％,2.00-10.00min,B:5-30％,10.00-12.00min,B:30-100％，12.00-18.00min,B:100-100％,18.00-20.00min,B:100-5％,20.00-25.00min,B:5-5％。流速为0.8mL/min，检测波长为210nm，检测温度为25℃。地奥司明水解为香叶木素的效率用转化率和转化比两个指标来评价。
地奥司明转化率(％)＝消耗的地奥司明质量/地奥司明总质量×100
地奥司明转化比＝消耗地奥司明的摩尔质量/生成香叶木素的摩尔质量
图8是本发明实施例3中地奥司明未处理前的色谱峰图。图9是本发明实施例3中地奥司明经过微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理后的色谱峰图。相对于图2地奥司明的标准品液相色谱图和图3的香叶木素的标准品液相色谱图，分别标定实施例中地奥司明样品在液相色谱中的出峰位置和香叶木素样品在液相色谱中的出峰位置。图8和图9显示了微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同水解前后的样品中地奥司明和香叶木素变化情况。由图8和图9可知，经过微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同处理后，样品中的地奥司明信号峰都变成了香叶木素信号峰，这说明经过处理后，溶液中的地奥司明都水解成了香叶木素。
实施例3与对比例15-17的转化率和转化比结果如表5所示。由表5可知四种方法的地奥司明转化比都接近1，这说明四种降解方法中，降解的地奥司明几乎都转化成了香叶木素。相较于其它三种酸基低共熔溶剂(Ch/Lev，Ch/Cit和Ch/Tar)，微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同水解地奥司明转化率高达99.95％，远高于其他三种方法。这可能是由于Ch/Oxa相较于其它三种酸基低共熔溶剂其提供质子的能力更强所致。
实施例3与对比例18-21共五种地奥司明降解方法的转化率和转化比结果如表6所示。由表6可知五种方法的地奥司明转化比都接近1，这说明五种降解方法中降解的地奥司明几乎都转化成了香叶木素。五种方法中，微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同水解地奥司明转化率最高(99.95％)。微波与酸水解法联用降解地奥司明的效率较差，转化率仅为1.98％，而水热联用Ch/Oxa的转化率较高，但耗时要显著高于微波联用Ch/Oxa，该结果说明微波Ch/Oxa协同水解地奥司明的效果上要显著强于微波联用酸水解和水热联用Ch/Oxa。在降解同样体积浓度地奥司明时，微波与低共熔试剂(Ch/Oxa)协同水解时间最短，整个处理过程仅耗时6min，其处理时间要远低于水热联用Ch/Oxa(30min)、酸水解法(9h)和酶解法(8h)，其处理效率分别是这三种方法的5倍，90倍和80倍。还要说明的是，微波与Ch/Oxa协同水解过程中，相较于酶解法中所使用的糖苷酶(2770元/g，数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，本发明方法中使用的草酸和氯化胆碱价格低至0.212元/g和0.176元/g(数据来源于sigma试剂公司官网：https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh)，成本优势非常明显。并且该方法所使用的低共熔溶剂还能够回收再利用，能够进一步降低制备成本，同时也不产生酸性有机废液，对环境较为友好。
表5.不同低共熔溶剂对微波转化地奥司明的影响
表6.不同地奥司明水解方法的转化率和转化比结果
Claims (10)
1.微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)氯化胆碱和草酸混合，搅拌至形成澄清透明的低共熔试剂，稀释；
2)将地奥司明溶解于稀释后的低共熔试剂中，混匀；
3)将溶解了地奥司明的低共熔试剂进行微波处理，控制微波功率为300-500W，微波处理时间为2-10分钟；
4)将微波处理过后的低共熔试剂中加入超纯水，冷藏；离心分离，洗涤冻干，得香叶木素。
2.根据权利要求1所述微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的氯化胆碱和草酸摩尔比为1.5:1-2:1。
3.根据权利要求1所述微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的搅拌在80-95℃水浴中进行。
4.根据权利要求1所述微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的稀释是用超纯水稀释。
5.根据权利要求4所述微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，其特征在于，所述的超纯水稀释后的低共熔试剂体积浓度为85％-95％。
6.根据权利要求1所述微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的微波处理时间为2-6分钟。
7.根据权利要求1所述微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的超纯水加入量为低共熔试剂体积的6-10倍。
8.根据权利要求1所述微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的冷藏的温度为2-6℃；冷藏的时间为3-5小时。
9.根据权利要求1所述微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的洗涤用超纯水洗涤，洗涤的次数为3-5次。
10.根据权利要求1所述微波与低共熔试剂协同水解地奥司明制备香叶木素的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的离心分离后的液体倒入旋转蒸发装置，40-60℃温度下旋转蒸发出水分；直至水分全部蒸干，收集的高黏度组分为回收成功的低共熔试剂。
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