CN115998741A - 一种抗肿瘤药物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗肿瘤药物组合物及其制备方法和应用，该组合物的原料包括迷迭香酸与5‑氟尿嘧啶；实验结果表明迷迭香酸和5‑FU联合应用既能协同促进HepG2细胞凋亡，又能增强5‑氟尿嘧啶对HepG2细胞的化疗敏感性，共同发挥抑制肿瘤增长；本发明特定重量比的5‑FU与迷迭香酸可用于制备治疗肝癌的药物，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤医药技术领域，具体涉及一种抗肿瘤药物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
肝癌是目前世界公认死亡率较高的肿瘤之一，在我国死亡率居恶性肿瘤的第3位，我国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡总数的51％。肝癌具有起病隐匿、进展迅速、易转移、患者生存期短等特点，被发现时多数处于中晚期，因此临床肝癌治疗主要是化疗药物治疗和靶向药物治疗。
5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是尿嘧啶中的氢原子被氟原子取代所得。其分子式为C4H3N2O2F，重均分子量为130.8。5-FU是一种亲水性药物，略溶于水，在水中溶解度为17mg/mL，在稀酸或碱液中溶解。5-FU也是一种临床上广泛使用的抗肿瘤药物，它对多种肿瘤包括肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌都具有抗肿瘤活性。其抗肿瘤的主要机制为5-FU的代谢产物一磷酸氟代脱氧尿苷(Fd UMP)抑制胸苷酸合成酶而阻止DNA的合成，抑制肿瘤的生长。5-FU口服吸收不完全且难以预测，故临床上多采用注射的方式给药。但5-FU的半衰期较短，在体内很快被代谢掉，需要频繁给药，给药非常不方便。此外，5-FU也具有一系列副作用，主要包括消化道反应及骨髓抑制，同时还会发生脱发、指甲改变、皮炎、皮肤色素增加的现象。近年来肝癌细胞对5-FU的敏感性下降或连续治疗使肝癌细胞对5-FU产生耐药性等因素，大大限制了5-FU抗癌疗效的发挥。研究发现自噬在5-FU治疗肝癌过程中对肝癌细胞中起保护作用，从而导致肝癌细胞对5-FU的敏感性下降，因此，5-FU在临床上的使用也受到严重限制。
迷迭香酸(Rosrarinicacid，RA)是一种天然水溶性的多酚羟基化合物，在植物中分布广泛。医学研究表明，迷迭香酸具有抗炎、镇痛、免疫调节、抗肿瘤作用等多种药理作用，具有显著的抗肿瘤活性，能有效地作用于包括肝癌在内的多种肿瘤，改善患者生活质量，提高患者生存率，是一种非常有前景的抗肿瘤药物。研究还表明，迷迭香酸具有抑制HepG2细胞的增殖作用，呈现量效、时效关系，可能与其促进HepG2细胞凋亡有关，进一步研究发现其机制可能是增加cleaved caspase-3、Bcl-2、p62蛋白表达水平，促进HepG2细胞凋亡。进一步研究发现迷迭香酸可以通过抑制HepG2自噬而导致细胞凋亡增加，这可能是其抑制HepG2细胞增殖作用的重要机制之一。
综上，由于现有的化疗药物效果较差、毒副作用大、耐药性高，敏感性下降，因此寻找新的高效低毒的治疗肝癌的药物具有重要意义。本发明提供的一种抗肿瘤药物组合物，将迷迭香酸和5-氟尿嘧啶按一定浓度联合应用，但这些作用往往与药物之间的剂量比例、肿瘤细胞类型紧密相关。因此，找到迷迭香酸与5-氟尿嘧啶配伍剂量浓度，从而发挥协同作用具有重要意义，但目前尚无迷迭香酸与其它抗肿瘤活性成分联用的信息公开。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种抗肿瘤药物组合物，更进一步的，是将迷迭香酸和5-氟尿嘧啶，形成药物组合物，用于制备强效的抗肿瘤药物。
实现本发明的主要技术方案是：
一种抗肿瘤药物组合物，包括迷迭香酸和5-氟尿嘧啶。
进一步的，所述迷迭香酸与所述5-氟尿嘧啶的重量比为5:0.5～2。
进一步的，所述迷迭香酸与所述5-氟尿嘧啶的重量比为5:1。
进一步的，所述迷迭香酸的体外细胞杀伤剂量为50μmol/L。
在其中一个实施例中，所述抗肿瘤药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
进一步的，所述辅料包括：注射用水、增溶剂、助溶剂、抗氧剂、pH值调节剂、乳化剂、吸附剂、络合剂中的至少一种。
本发明还提供一种抗肿瘤药物组合物的制备方法，包括如上述任一所述的一种抗肿瘤药物组合物。
进一步的，将所述抗肿瘤药物组合物直接混合做成制剂；或者，将所述抗肿瘤药物组合物中的迷迭香酸和5-氟尿嘧啶分别与相应的辅料混合分别做成制剂，然后再分别进行包装；或者，将所述抗肿瘤药物组合物中的迷迭香酸和5-氟尿嘧啶分别与相应的辅料混合后，然后再混合做成制剂。
本发明还提供一种如上述任一所述的一种抗肿瘤药物组合物在下面的应用：
(1)制备抑制和/或治疗HepG2细胞的制剂中的应用；
(2)制备抑制和/或治疗肿瘤疾病的制剂中的应用。
进一步的，所述肿瘤为肝细胞癌。
本发明的有益效果为：
本发明研究发现迷迭香酸是通过提高cleaved caspase-3、Bcl-2、p62蛋白表达水平，促进HepG2细胞凋亡，同时还通过抑制HepG2自噬而导致细胞凋亡增加，从而抑制HepG2细胞的增殖作用；
进一步使用迷迭香酸与5-氟尿嘧啶联合使用处理肝细胞癌HepG2细胞株，结果发现在较低作用浓度，迷迭香酸对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性呈现明显的增效作用。在进一步的研究中，发现迷迭香酸是通过提高cleaved caspase-3、Bcl-2、p62蛋白表达水平，促进HepG2细胞凋亡，同时还通过抑制HepG2自噬从而促进HepG2细胞凋亡；
通过实验探讨迷迭香酸与5-氟尿嘧啶联合用药后，在细胞增殖、蛋白表达效应多个层次水平均能增强肝癌细胞对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性，两者存在协同效应，延长了生存周期，实现减毒增效作用，具有重要的应用前景；
本发明所提供的抗肿瘤药物组合物适用于多种肿瘤，包括肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌等，特别适用于肝细胞癌的治疗。
附图说明
图1为迷迭香酸+5-氟尿嘧啶联合用药抑制自噬泡的形成示意图；(白色箭头所指为自噬泡)
A:正常对照组B:12.5μmol/L迷迭香酸组C:25μmol/L迷迭香酸组D:50μmol/L迷迭香酸组E:10μmol/L 5-氟尿嘧啶组
F:50μmol/L迷迭香酸+10μmol/L5-氟尿嘧啶联合组
图2为迷迭香酸+5-氟尿嘧啶联合用药对凋亡及自噬相关蛋白的影响示意图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种抗肿瘤药物组合物，该组合物为迷迭香酸与5-氟尿嘧啶的组合物。
较优地，迷迭香酸与5-氟尿嘧啶的重量比为5:0.5-2，更优选为5:1。
或者，所述组合物的给药剂量能够根据给药对象、给药途径或药物的制剂形式进行变化，但以保证该组合物在哺乳动物体内能够达到有效的血药浓度为前提。
实施例1、迷迭香酸与5-氟尿嘧啶协同抑制HepG2细胞增殖作用1.细胞培养
HepG2细胞按常规方法复苏后，用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI 1640完全培养液在37℃、5％CO2和100％饱和湿度的培养箱中传代培养，取对数培养期细胞进行后续实验。
2.供试药液的配制
(1)5-FU药液的配制：
称取适量的5-氟尿嘧啶(5-FU)原料药，用RPMI-1640培养基进行溶解，配制成40μmol/L的母液，再利用RPMI-1640培养基将母液稀释成不同浓度的5-FU药液：2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、。
(2)迷迭香酸药液的配制：
称取适量的迷迭香酸原料药，先用PBS溶液充分溶解，配制成400μmol/L的母液，再利用RPMI-1640培养基将母液稀释成不同浓度的迷迭香酸药液：12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L。
(3)联合用药组：分别将不同浓度的5-FU药液与迷迭香酸药液混合，得到不同浓度的5-FU和迷迭香酸混合药液，见表1。
表1不同浓度的5-FU药液与迷迭香酸药液等体积混合
注：表中所示为两种药液等体积混合后5-FU药液(μmol/L)/迷迭香酸(μmol/L)浓度数据。
3.细胞增殖抑制实验(MTT法)
取处于对数生长期HepG2细胞，调整细胞密度为4×103/ml，接种于96孔板，每孔100μL，培养24h后，全部贴壁生长，吸弃上清，空白组及正常对照组加100μL完全培养基，5-FU药液组、迷迭香酸药液以及联合用药组(5-FU药液+迷迭香酸混合药液)分别加相应浓度药物100μL，每组设6个复孔，分别继续培养24h，观察细胞生长状态，MTT法测定HepG2细胞增殖情况，操作如下：每孔加入0.5g/L的MTT液20μL，37℃，5％CO2条件下孵育4h，吸出上清液，加入150μL的DMSO，振荡10min，490nm波长处测定OD值，计算细胞存活率。
4.结果
将对数生长期的HepG2细胞暴露于5-FU药液、迷迭香酸药液以及5-FU药液+迷迭香酸混合药液，分别孵育24h后，MTT法检测并计算细胞存活率，绘制存活率曲线。实验结果显示，联合用药组(5-FU药液+迷迭香酸混合药液)对HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用，效果均优于单独给药5-FU或给药迷迭香酸的效果，呈现量效、时效关系。结果见表2。
表2 5-FU与迷迭香酸混合药液对HepG2细胞存活率的影响(x±s，n＝6)
实施例2、不同浓度迷迭香酸与5-氟尿嘧啶协同作用的分析1.实验方法
(1)细胞培养
与实施例1中的“1.细胞培养”步骤相同
(2)供试药液的配制
与实施例1中的“2.供试药液的配制”步骤相同
(3)实验分组
①阴性对照组：细胞+RPMI-1640培养基；
②供试药液组：分别是：细胞+不同浓度5-FU和迷迭香酸混合药液，细胞+不同浓度5-FU药液，细胞+不同浓度迷迭香酸药液；
③空白组：不含细胞，只添加RPMI-1640培养基。
(4)给药方法
待细胞完全贴壁后，吸出孔板中原有的培养基，依照实验组别：阴性对照组加入100μL培养基；供试药液组分别加入不同浓度比的5-FU和迷迭香酸混合药液100μL(见表3)，或者分别加入不同浓度的5-FU药液100μL，或者分别加入不同浓度的迷迭香酸药液100μL；空白组加入100μL培养基。给药完成后置于37℃，5％CO2的恒温细胞培养箱中孵育24h。
表3不同浓度混合药液
(5)计算联合指数(CI)和剂量减少指数(DRI)
基于两种药物药理学相互作用，迷迭香酸和5-氟尿嘧啶以一定比例混合配液进行MTT实验，运用CalcuSyn软件，绘制细胞抑制率曲线，并计算联合指数(CI)和剂量减少指数(DRI)，同时计算单药使用剂量及联合使用剂量。CI＝1表明两者是相加作用，CI＜1表明两者有协同效应，CI＞1表明两者有拮抗效应。DRI反映的两种药物联用时的作用强度。
2.实验结果
统计学分析显示，迷迭香酸和5-氟尿嘧啶联合应用时，在不同剂量下，两种药物的CI值(联合指数)均小于1，DRI值(剂量减少指数)也明显增加，显示两者联合应用具有协同效应(如表4所示)，其中10μmol/L 5-FU药液+50μmol/L迷迭香酸时，协同效果最优。迷迭香酸或5-氟尿嘧啶单药应用如要获得两种联合应用的效果，必须加大单药的使用剂量，才能得到两种药物小剂量联用的效果，此时单药剂量过大，容易产生副作用。见表4。
表4迷迭香酸和5-氟尿嘧啶联合应用对HepG2的作用
实施例3、迷迭香酸抑制自噬增强5-氟尿嘧啶化疗敏感性作用1.实验方法
(1)细胞培养
HepG2细胞按常规方法复苏后，用含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI 1640完全培养液在37℃、5％CO2和100％饱和湿度的培养箱中传代培养，取对数培养期细胞进行后续实验。
(2)抑制细胞自噬实验
取对数生长期的HepG2细胞，以每孔2×105个细胞的密度接种于6孔培养板，待细胞贴壁后，弃去培养液，加含迷迭香酸(50μmol/L)培养液2mL和含5-氟尿嘧啶(10μmol/L)。对照组加不含迷迭香酸的培养液，同时另设迷迭香酸(50μmol/L)联合5-氟尿嘧啶处理组，培养48h后，0.25％胰酶消化，离心收集细胞，用2.5％戊二醛固定4h以上，无菌PBS液漂洗2次，然后用1％锇酸固定1h以上，环氧树脂包埋，经醋酸铀及枸橼酸铅染色，在透射电子显微镜下观察细胞内超微结构的形态学改变判断细胞自噬泡的情况，出现空泡状双层膜样结构，即为自噬泡，电镜下观察自噬泡积聚数量。
(3)细胞凋亡实验
取对数生长期的HepG2细胞，以每孔2×105个细胞的密度接种于6孔培养板，待细胞贴壁后，弃去培养液，加含迷迭香酸(50μmol/L)培养液2mL、含5-氟尿嘧啶(10μmol/L)2mL。对照组加不含迷迭香酸的培养液，同时另设迷迭香酸(50μmol/L)联合5-氟尿嘧啶处理组，培养48h后，射电镜观察。同时，取对数生长期的HepG2细胞，经过上述药物相同处理后，胰酶消化细胞，PBS洗3次，收集细胞(保证每组细胞计数＞1×106个/组)，4℃预冷PBS洗涤，离心并重复2次，按试剂盒说明书操作，上FACS420型流式细胞仪，测定细胞凋亡率。
(4)目的蛋白表达变化检测
取对数生长期的HepG2细胞，以每孔2×105个细胞的密度接种于6孔培养板，待细胞贴壁后，弃去培养液，加含迷迭香酸(50μmol/L)培养液2mL、含5-氟尿嘧啶(10μmol/L)2mL。对照组加不含迷迭香酸的培养液，同时另设迷迭香酸(50μmol/L)联合5-氟尿嘧啶(10μmol/L)处理组，培养48h后，终止药物处理，收集细胞。将其裂解于含蛋白酶抑制剂(Roche公司)的RIPA裂解液[20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1％NP40，150mmol/L NaCl，2mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1％SDS]中，冰上裂解40min，12000g离心10min后取上清，BCA法进行蛋白定量。取20μg蛋白与5×上样缓冲液混合，97℃煮沸变性5min，10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，电转移法转至PVDF膜上，以含5％脱脂奶粉的TBST溶液室温封1h，再分别与兔抗cleaved caspase-3一抗(1:800)、bcl-2一抗(1:800)、兔抗LC3一抗(1:1000)、鼠抗p62一抗(1:1000)、鼠抗β-actin一抗(1:5000)4℃孵育过夜，TBST溶液洗涤后和相应的二抗(HRP标记)室温孵育2h，ECL显色，X线压片曝光30s-3min，扫描胶片，Image J软件分析条带的密度值。
2.结果
(1)迷迭香酸抑制HepG2细胞内自噬泡的形成
射电镜观察到，可观察到对照组中HepG2细胞内有多个自噬泡存在，12.5μmol/L迷迭香酸也能找到自噬泡存在，但25μmol/L迷迭香酸组镜下自噬泡总体已减少，而在50μmol/L迷迭香酸作用下，典型双层膜结构自噬体不易被找到，表明50μmol/L迷迭香酸组比12.5μmol/L迷迭香酸组的镜下自噬泡更少，显示更强的抑制自噬作用。
实验发现，在5-氟尿嘧啶处理组中能找到多个自噬泡，而在迷迭香酸联合5-氟尿嘧啶处理组中，却没有发现自噬泡，说明迷迭香酸具有抑制细胞自噬作用。推测迷迭香酸能通过抑制自噬，使肿瘤细胞需面临快速增殖带来的缺氧和营养缺乏等困境，进而抑制肿瘤细胞生长，见图1。
(2)细胞凋亡
为了考察抑制自噬时，迷迭香酸+5-氟尿嘧啶联合用药对HepG2细胞凋亡的影响，实验中采用迷迭香酸(50μmol/L)、5-氟尿嘧啶(10μmol/L)及迷迭香酸(50μmol/L)联合5-氟尿嘧啶(10μmol/L)分别处理，实验发现迷迭香酸抑制自噬能增加5-氟尿嘧啶诱导的HepG2细胞凋亡，进一步证实迷迭香酸抑制自噬增强5-氟尿嘧啶化疗敏感性作用，结果见表5。
表5迷迭香酸抑制自噬影响5-氟尿嘧啶对HepG2细胞的凋亡作用
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
(3)对Cleaved Caspase-3、Bcl-2、p62蛋白表达水平及LC32/LC31比值的影响
结果发现，与对照组相比，3个药物处理组中HepG2中cleaved caspase-3的表达均增加，p62表达增加，而Bcl-2的表达减少；迷迭香酸组和迷迭香酸+5-氟尿嘧啶组中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P＜0.05)，而5-氟尿嘧啶组中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P＜0.05)，结果说明5-氟尿嘧啶能增强HepG2细胞自噬，迷迭香酸+5-氟尿嘧啶联合用药后通过上调促凋亡蛋白cleaved caspase-3、p62和下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平诱导HepG2细胞发生凋亡，降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值抑制自噬水平，增强5-氟尿嘧啶对HepG2细胞的化疗敏感性，从而抑制肿瘤细胞增殖，结果见表5和图2。
表6对凋亡及自噬相关蛋白的影响
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01
根据上述实施例1-3表明；
(1)迷迭香酸与5-FU以联合用药方式作用于HepG2细胞，抑制肿瘤细胞增殖的效果均优于单独给药5-FU或迷迭香酸的效果。运用CalcuSyn软件计算联合指数(CI)和剂量减少指数(DRI)，说明迷迭香酸与5-FU联用具有协同作用。
(2)迷迭香酸与5-氟尿嘧啶联合用药可以协同促进HepG2细胞凋亡，迷迭香酸通过抑制HepG2细胞自噬，增强5-氟尿嘧啶对HepG2细胞的化疗敏感性作用，联用可显著抑制肿瘤细胞增殖，说明迷迭香酸和5-氟尿嘧啶联用，既能协同促进HepG2细胞凋亡，又能增强5-氟尿嘧啶对HepG2细胞的化疗敏感性，共同发挥抑制肿瘤增长作用，其机制可能是上调促凋亡蛋白cleaved caspase-3、p62和下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平诱导HepG2细胞发生凋亡，降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值抑制自噬水平。
综上，本发明研究表明特定重量比的5-FU与迷迭香酸联合使用，在一定浓度范围内对于抑制HepG2细胞的增殖具有协同作用。实验说明迷迭香酸和5-FU联合应用既能协同促进HepG2细胞凋亡，又能增强5-氟尿嘧啶对HepG2细胞的化疗敏感性，共同发挥抑制肿瘤增长。本发明特定重量比的5-FU与迷迭香酸可用于制备治疗肝癌的药物，具有良好的应用前景。
Claims (10)
1.一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，包括迷迭香酸和5-氟尿嘧啶。
2.根据权利要求1所述的一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述迷迭香酸与所述5-氟尿嘧啶的重量比为5:0.5～2。
3.根据权利要求2所述的一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述迷迭香酸与所述5-氟尿嘧啶的重量比为5:1。
4.根据权利要求3所述的一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述迷迭香酸的体外细胞杀伤剂量为50μmol/L。
5.根据权利要求1-4任一所述的一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的一种抗肿瘤药物组合物，其特征在于，所述辅料包括：注射用水、增溶剂、助溶剂、抗氧剂、pH值调节剂、乳化剂、吸附剂、络合剂中的至少一种。
7.一种抗肿瘤药物组合物的制备方法，其特征在于，包括如权利要求1-4以及6其中任一所述的一种抗肿瘤药物组合物。
8.根据权利要求7所述的一种抗肿瘤药物组合物的制备方法，其特征在于，将所述抗肿瘤药物组合物直接混合做成制剂；或者，将所述抗肿瘤药物组合物中的迷迭香酸和5-氟尿嘧啶分别与相应的辅料混合分别做成制剂，然后再分别进行包装；或者，将所述抗肿瘤药物组合物中的迷迭香酸和5-氟尿嘧啶分别与相应的辅料混合后，然后再混合做成制剂。
9.根据权利要求1-4以及6其中任一所述的一种抗肿瘤药物组合物，在下面的应用：
(1)制备抑制和/或治疗HepG2细胞的制剂中的应用；
(2)制备抑制和/或治疗肿瘤疾病的制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的一种抗肿瘤药物组合物的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝细胞癌。
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