CN115997934A - 一种益生菌纳米颗粒缓释制备方法 - Google Patents

一种益生菌纳米颗粒缓释制备方法 Download PDF

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仇虎
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Abstract

本发明公开了一种纳米颗粒缓释释放技术及方法，以益生菌悬液与海藻酸盐溶液为原料，采用分散技术分散至氯化钙溶液中得到海藻酸钙凝胶纳米颗粒。然后再以海藻酸钙凝胶纳米颗粒、壳聚糖溶液为原料制备得到海藻酸钙‑壳聚糖双层纳米颗粒。最后以海藻酸钙‑壳聚糖双层纳米颗粒、阿拉伯胶溶液为原料制备得到海藻酸钙‑壳聚糖‑阿拉伯胶三层纳米颗粒。本发明制备方法成本低、过程简单、易于实现，制得的益生菌纳米颗粒具有粒径小的优点。

Description

一种益生菌纳米颗粒缓释制备方法
技术领域
本发明涉及益生菌纳米颗粒缓释领域，具体是一种益生菌纳米颗粒缓释制备方法。
背景技术
人体肠道中栖息着大量微生物，这些肠道微生物常被认为是“忽略的器官”。它们可以合成维生素和必需氨基酸，代谢异生物质，在抵抗肠道病原菌和促进免疫系统发育等方面发挥着重要作用。此外，肠道微生物还与许多健康问题，如昼夜节律失常、神经系统失调、恶性肿瘤和代谢疾病等存在密切联系。研究表明，补充益生菌制剂可有效调节肠道菌群，改善人体健康，缓解多种疾病。
为了获得理想的改善效果，在摄入时，益生菌的活菌数应大于106-107CFU/g。然而，摄食过程中的益生菌暴露在低pH值、消化酶和胆汁环境下，到达肠道时的存活率极。为了维持菌体活性，实现益生菌的有效肠道输送，纳米颗粒缓释技术应运而生。
常用的益生菌纳米颗粒缓释技术有挤压法、乳化法和喷雾干燥法。乳化法生产成本较高，产生的颗粒大小不均一，同时乳化剂和表面活性剂的使用也不利于保持益生菌的活力。喷雾干燥过程中的高温环境和脱水作用极易导致益生菌失活。相比而言，挤压法操作简单，对益生菌的活性影响小。但传统挤压法生产的纳米颗粒粒径较大，且产量较低，难以实现工业化大规模生产。因此，探寻一种绿色高效的益生菌胶囊化技术具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种益生菌纳米颗粒制备方法，以解决现有技术挤压法制备益生菌纳米颗粒存在的产品粒径大、产量低的问题。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种益生菌纳米颗粒制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将益生菌悬液与海藻酸盐溶液混合均匀形成混合液，其中益生菌悬液与海藻酸盐溶液的体积比为1:6-1:12，海藻酸盐溶液的质量浓度为1.4～1.6％；
步骤2、采用质量浓度为1.7～2.3％的氯化钙溶液，使步骤1得到的混合液分散进入所述氧化钙溶液中，然后固化28～32min，其中步骤1的混合液与氯化钙溶液的体积比为1:3-1:7；
步骤3、对步骤2固化后的溶液进行过滤，得到的颗粒物为益生菌的海藻酸钙凝胶纳米颗粒。
进一步的步骤1中，所述海藻酸盐采用海藻酸钠。
进一步的步骤2中，采用单分散液滴发生器使步骤1得到的混合液分散后进入所述氧化钙溶液中。
进一步的，所述单分散液滴发生器的载气压力设置为0.7kg/cm2～0.9kg/cm2，单分散液滴发生器的脉冲发生器频率设置为11kHz～13kHz，单分散液滴发生器的分散风流量设置为7L/min～10L/min。
一种益生菌纳米颗粒制备方法，包括以下步骤：
步骤S1、将壳聚糖添加到浓度为0.08mol/L～0.13mol/L的乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液；其中壳聚糖与乙酸溶液的重量比为1:4000-1:1000。
步骤S2、将步骤S1得到的壳聚糖溶液的pH值调节至5.8；
步骤S3、将权利要求1-5中任意一项所述制备方法制得的海藻酸钙凝胶纳米颗粒，浸于步骤S2调节pH值后的壳聚糖溶液中，其中海藻酸钙凝胶纳米颗粒与壳聚糖溶液的体积比为1:3-1:7，然后磁力搅拌28～32min，得到益生菌的海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒。
进一步的，步骤S2中，采用浓度为0.8mol/L～1.1mol/L的氢氧化钠溶液调节壳聚糖溶液的pH值。
一种益生菌纳米颗粒制备方法，过程如下：
将权利要求5-6中任意一项所述制备方法制得的海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒，浸于质量浓度为0.8％～1.1％(w/v)的阿拉伯胶溶液中，其中海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒与阿拉伯胶溶液的体积比为1:3-1:7；然后再搅拌28～32min，最后进行过滤，得到的颗粒物为益生菌的海藻酸钙-壳聚糖-阿拉伯胶三层纳米颗粒。
本发明以海藻酸盐为原料，利用单分散液滴发生器MDDG可制备单层的益生菌的海藻酸钙凝胶纳米颗粒。然后基于海藻酸钙凝胶纳米颗粒以及壳聚糖原料、阿拉伯胶原料，结合静电引导的逐层自组装可制备得到益生菌的海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒、益生菌的海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒。
本发明制备方法原料成本低、易于获得，方法过程操作简单、易于实现，能够大批量生产益生菌纳米颗粒，并且制得的益生菌纳米颗粒具有粒径小的优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例一
本实施例公开了益生菌的单层、双层、三层纳米颗粒制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将益生菌悬液与海藻酸盐溶液混合均匀形成混合液，其中益生菌悬液与海藻酸盐溶液的体积比为1:6-1:12，海藻酸盐溶液的质量浓度为1.4～1.6％；本实施例中海藻酸盐溶液采用海藻酸钠溶液。
步骤2、采用单分散液滴发生器，使步骤1得到的混合液分散进入质量浓度为1.7～2.3％的氯化钙溶液，然后固化28～32min，其中步骤1的混合液与氯化钙溶液的体积比为1:3-1:7。
本实施例采用的单分散液滴发生器MDDG，它利用气体挤压获得微流体柱，辅以压电陶瓷的规律振动产生均匀的单个液滴，此方法可以实现微胶囊的连续生产，得到的微胶囊颗粒粒径均一，大小可控。
具体的，为了保证连续生产并获得较为理想的纳米颗粒尺寸，单分散液滴发生器MDDG的喷嘴选用直径为150um的喷嘴，设置单分散液滴发生器MDDG的载气压力设置为0.7kg/cm2～0.9kg/cm2，单分散液滴发生器的脉冲发生器频率设置为11kHz～13kHz，单分散液滴发生器的分散风流量设置为7L/min～10L/min。通过单分散液滴发生器MDDG的压缩气体将步骤1得到的混合液从喷嘴中挤出；在脉冲发生器产生的高频正弦的驱动下，喷嘴上的压电陶瓷收缩振动产生单个液滴；液滴在分散风的作用下均匀分散并落入氯化钙溶液中固化定型。
步骤3、对步骤2固化后的溶液进行过滤，得到的颗粒物为益生菌的海藻酸钙凝胶纳米颗粒。
步骤4、制备益生菌的双层纳米颗粒，过程如下：
步骤S1、将壳聚糖添加到浓度为0.08mol/L～0.13mol/L的乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液；其中壳聚糖与乙酸溶液的重量比为1:4000-1:1000。
步骤S2、采用浓度为0.8mol/L～1.1mol/L的氢氧化钠溶液，将步骤S1得到的壳聚糖溶液的pH值调节至5.8。
步骤S3、将步骤3得到的海藻酸钙凝胶纳米颗粒，浸于步骤S2调节pH值后的壳聚糖溶液中，其中海藻酸钙凝胶纳米颗粒与壳聚糖溶液的体积比为1:3-1:7，然后磁力搅拌28～32min，得到益生菌的海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒。
步骤5、制备益生菌的三层纳米颗粒，过程如下：
将步骤4得到的海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒，浸于质量浓度为0.8％～1.1％(w/v)的阿拉伯胶溶液中，其中海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒与阿拉伯胶溶液的体积比为1:3-1:7；然后再搅拌28～32min，最后进行过滤，得到的颗粒物为益生菌的海藻酸钙-壳聚糖-阿拉伯胶三层纳米颗粒。
实施例二
本实施例为实施例一公开的益生菌的单层、双层、三层纳米颗粒制备方法的最优例，包括以下步骤：
步骤1、将益生菌悬液与海藻酸盐溶液混合均匀形成混合液，其中益生菌悬液与海藻酸盐溶液的体积比为1:9，海藻酸盐溶液的质量浓度为1.5％；本实施例中海藻酸盐溶液采用海藻酸钠溶液。
步骤2、采用单分散液滴发生器，使步骤1得到的混合液分散进入浓度为2％的氯化钙溶液，然后固化30min，其中步骤1的混合液与氯化钙溶液的体积比为1:5单分散液滴发生器MDDG的喷嘴选用直径为150um的喷嘴，设置单分散液滴发生器MDDG的载气压力设置为0.8kg/cm2，单分散液滴发生器的脉冲发生器频率设置为10kHz，单分散液滴发生器的分散风流量设置为9L/min。
步骤3、对步骤2固化后的溶液进行过滤，得到的颗粒物为益生菌的海藻酸钙凝胶纳米颗粒。
步骤4、制备益生菌的双层纳米颗粒，过程如下：
步骤S1、将壳聚糖添加到浓度为0.08mol/L～0.13mol/L的乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液；其中壳聚糖与乙酸溶液的重量比为1:1000。
步骤S2、采用浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液，将步骤S1得到的壳聚糖溶液的pH值调节至5.8。
步骤S3、将步骤3得到的海藻酸钙凝胶纳米颗粒，浸于步骤S2调节pH值后的壳聚糖溶液中，其中海藻酸钙凝胶纳米颗粒与壳聚糖溶液的体积比为1:5，然后磁力搅拌30min，得到益生菌的海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒。
步骤5、制备益生菌的三层纳米颗粒，过程如下：
将步骤4得到的海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒，浸于质量浓度为1％(w/v)的阿拉伯胶溶液中，其中海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒与阿拉伯胶溶液的体积比为1:5；然后再搅拌30min，最后进行过滤，得到的颗粒物为益生菌的海藻酸钙-壳聚糖-阿拉伯胶三层纳米颗粒。
实施例三
本实施例为实施例二制得的益生菌的单层、双层、三层纳米颗粒的粒径实验例，如下：
利用单分散液滴发生器(MDDG)生产的益生菌微胶囊尺寸主要受气体压力、喷嘴尺寸和正弦波频率的影响。通过Mastersizer 3000激光粒度仪，采用d43，即体积平均直径(Volume mean diameter)表征微胶囊的平均粒径大小。
微生物细胞的大小通常为1-4μm，合适的微胶囊尺寸对于益生菌的包埋和输送效果至关重要。若微胶囊尺寸太大，可能会影响其感官特性。传统挤压法所得的益生菌微胶囊的尺寸多大于1mm，相比之下，本发明制备得到的益生菌胶囊处在较为理想的尺寸范围内。
通过本实施例可以看出，本实施例制得的益生菌的单层、双层、三层纳米颗粒，粒径可达到346μm，380μm和444μm，因此均具有粒径小的优点。结果表明，随着包封层数的增加，微胶囊的尺寸逐渐增大，其粒径的分布范围也更广。
实施例四
本实施例为实施例二制得的益生菌的单层、双层、三层纳米颗粒在模拟胃肠液中存活与释放的行为实验例，具体实验过程如下：
在模拟消化环境条件下研究不同层数纳米颗粒内益生菌的存活和释放特性。模拟消化液组成如下所示：
人工模拟胃液(SGF)：9g/L NaCl，3g/L胃蛋白酶，pH值1.8；人工模拟肠液(SIF)：6.8g/L KH2PO4，5g/L胰蛋白酶，1g/L胰凝乳蛋白酶，pH值6.5。
为了方便说明，设益生菌的海藻酸钙凝胶纳米颗粒为颗粒1，海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒为颗粒2，海藻酸钙-壳聚糖-阿拉伯胶三层纳米颗粒为颗粒3。分别取颗粒1、颗粒1、颗粒3各1g，或益生菌发酵液1mL，置于30mL SGF中，37℃消化1h后从中分离纳米颗粒，对颗粒内的益生菌进行活菌计数。消化2h后，将部分纳米颗粒转移至37℃的SIF中，在1h，2h和3h时分别取样对释放的益生菌进行平板菌落计数。
实验结果如下：
益生菌在模拟胃液中的存活和在模拟肠液中的释放情况如表1所示，表1如下：
表1纳米颗粒中益生菌在模拟肠胃液中的存活与释放
Figure BDA0003977659320000061
通过表1可以看出，经模拟胃液消化2h后，菌悬液组的菌落数下降。然而在1h内，不同涂层益生菌纳米颗粒内的益生菌数量均无显著下降，表明颗粒化为益生菌提供了较好的保护；2h后，颗粒1、2和3内的益生菌数分别下降，表明多层包埋可提升益生菌在低pH值模拟胃液中的存活率。在本实施例中，单层益生菌纳米颗粒与多层纳米颗粒的益生菌存活率无显著性差异，也可归因于纳米颗粒的持续溶胀和结构交联密度降低所致。
模拟肠液中益生菌的释放情况延长了益生菌在肠液中的释放时间。海藻酸钙纳米颗粒在低pH值环境下维持稳定的结构，故单层的海藻酸钙凝胶纳米颗粒(颗粒1)在移入肠液后快速崩解，且在之后的消化时间内趋于稳定。而海藻酸钙-壳聚糖双层颗粒(颗粒2)和海藻酸钙-壳聚糖-阿拉伯胶三层颗粒(颗粒3)的多糖涂层延缓了颗粒的崩解时间，使得颗粒中益生菌在肠道内缓慢释放，3h后才达到同一数量级。这些实验结果表明，多层包埋有助于纳米颗粒中益生菌到达肠道远端，发挥其益生作用。
通过本实施例可以看出，实施例二制得的益生菌的单层、双层、三层纳米颗粒，均能够在人体肠胃环境中稳定释放，因此实施例二制得的纳米颗粒可用于调节人体肠胃功能。
本发明所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行的描述，并非对本发明构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域中工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围，本发明请求保护的技术内容，已经全部记载在权利要求书中。

Claims (7)

1.一种益生菌纳米颗粒缓释制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将益生菌悬液与海藻酸盐溶液混合均匀形成混合液，其中益生菌悬液与海藻酸盐溶液的体积比为1:6-1:12，海藻酸盐溶液的质量浓度为1.4～1.6％；
步骤2、采用质量浓度为1.7～2.3％的氯化钙溶液，使步骤1得到的混合液分散进入所述氧化钙溶液中，然后固化28～32min，其中步骤1的混合液与氯化钙溶液的体积比为1:3-1:7；
步骤3、对步骤2固化后的溶液进行过滤，得到的颗粒物为益生菌的海藻酸钙凝胶纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种益生菌纳米颗粒制备方法，其特征在于，步骤1中，所述海藻酸盐采用海藻酸钠。
3.根据权利要求1所述的一种益生菌纳米颗粒制备方法，其特征在于，步骤2中，采用单分散液滴发生器使步骤1得到的混合液分散后进入所述氧化钙溶液中。
4.根据权利要求3所述的一种益生菌纳米颗粒制备方法，其特征在于，所述单分散液滴发生器的载气压力设置为0.7kg/cm2～0.9kg/cm2，单分散液滴发生器的脉冲发生器频率设置为11kHz～13kHz，单分散液滴发生器的分散风流量设置为7L/min～10L/min。
5.一种益生菌纳米颗粒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1、将壳聚糖添加到浓度为0.08mol/L～0.13mol/L的乙酸溶液中，得到壳聚糖溶液；其中壳聚糖与乙酸溶液的重量比为1:4000-1:1000。
步骤S2、将步骤S1得到的壳聚糖溶液的pH值调节至5.8；
步骤S3、将权利要求1-5中任意一项所述制备方法制得的海藻酸钙凝胶纳米颗粒，浸于步骤S2调节pH值后的壳聚糖溶液中，其中海藻酸钙凝胶纳米颗粒与壳聚糖溶液的体积比为1:3-1:7，然后磁力搅拌28～32min，得到益生菌的海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的益生菌纳米颗粒制备方法，其特征在于，步骤S2中，采用浓度为0.8mol/L～1.1mol/L的氢氧化钠溶液调节壳聚糖溶液的pH值。
7.一种益生菌纳米颗粒制备方法，其特征在于，过程如下：
将权利要求5-6中任意一项所述制备方法制得的海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒，浸于质量浓度为0.8％～1.1％(w/v)的阿拉伯胶溶液中，其中海藻酸钙-壳聚糖双层纳米颗粒与阿拉伯胶溶液的体积比为1:3-1:7；然后再搅拌28～32min，最后进行过滤，得到的颗粒物为益生菌的海藻酸钙-壳聚糖-阿拉伯胶三层纳米颗粒。
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