CN109288819B - 一种含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜及其制备方法和应用 - Google Patents

一种含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜及制备方法和应用。所述的方法包括如下步骤：(1)采用离子交联法利制备含槲皮素的壳聚糖纳米粒子；(2)将海藻酸钠、聚氧化乙烯和泊洛沙姆F127溶于蒸馏水中，得到壳层纺丝溶液；将含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液、益生因子与聚乙烯醇溶液混合均匀，得到核层纺丝溶液；在室温下进行同轴静电纺丝，得到含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜。本发明制备的纤维膜可实现槲皮素在结肠靶向释放，促进肠道益生菌的增殖生长。此外，槲皮素和益生因子二者的协同作用对Caco‑2及HCT116结肠癌细胞具有明显的抑制作用，可用于功能性食品领域。

Description

一种含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于天然多糖基纳米材料和生物活性物质的控制释放领域，特别涉及一种利用同轴静电纺丝技术制备含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜的方法及其应用。
背景技术
结直肠癌是一种常见肿瘤，研究表明高达80％的结肠癌的发生可归结于饮食，多吃水果和蔬菜可以预防结肠癌。而槲皮素是一种广泛存在于多种植物中的天然黄酮类化合物，具有能够预防结肠癌的作用。但其口服后也易受上消化道影响(如胃酸及小肠中的蛋白酶)而失活或者发生首过效应被肝脏代谢消除，导致其生物利用度低。因此，亟需构建一个有效的运输体系实现结肠靶向运输，提高槲皮素的稳定性和生物利用度。
结肠靶向运输载体口服后在消化道上部不能被吸收而在结肠内释放负载的活性物质，因此可用于结肠癌的预防和治疗。由于pH依赖型释药系统和时滞型释药系统存在许多不确定的因素，即由于消化道的pH值不同以及药物转运时间受食物特别是疾病个体因素影响较大，进而定位性较差，难以达到实际的结肠靶向，故菌群触发型给药系统正开始受到关注。它是利用结肠菌群产生的酶作用于包埋材料，使得包埋材料降解，从而引起负载物质释放。目前用于制备菌群触发型给药系统的常用材料包括偶氮化合物和多糖类。但由于偶氮类化合物为合成的化合物，其毒性尚需进一步评价，因此应用受到一定限制。而多糖类化合物来源天然，具有毒性小、价格低廉、易被结肠菌群分泌的酶降解等，因此可作为靶向材料应用于结肠缓控释体系中。
目前构建结肠靶向控释体系的方法主要有喷雾干燥法、冷冻干燥法、流化床包衣法、微胶囊法等，但喷雾干燥法对壁材要求高且不适用于热敏性物质，冷冻干燥法成本高且效率低，流化床包衣法对包衣内核要求较高。因此，负载活性物质的结肠靶向控释体系的研究具有广阔的发展前景。近年来，将纳米技术应用于靶向传输系统的构建受到了广泛关注。与其他方法构建的材料相比，纳米材料比表面积大，负载率高，具有更好的控缓释性能，因此是一种极具发展潜力的构建结肠靶向运输体系的方法。特别地，静电纺丝技术是一种简单通用、操作方式温和的纳米纤维制备方法，能对活性物质实现简单高效的包埋，并可以通过改变纺丝溶液的组成、浓度及纺丝条件等调整纤维的形貌、孔隙率和聚合物组成实现物质的控制释放，近年来已成为食品领域的研究热点。
发明内容
为了克服上述现有技术在槲皮素的应用中存在稳定性差和生物利用度低的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜。
本发明另一目的在于提供上述方法制备的一种含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜的制备方法
本发明再一目的在于提供上述含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜在预防结肠癌中的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
一种含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜的制备方法，其特征在包括如下步骤：
(1)采用离子交联法制备含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液；
(2)将步骤(1)制备的含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液、益生因子和聚乙烯醇溶液混合均匀，得到核层纺丝溶液；
(3)将海藻酸钠、聚氧化乙烯和泊洛沙姆F127溶于蒸馏水/乙醇混合体系中，搅拌均匀，得到壳层纺丝溶液；
(4)将壳层纺丝液和核层纺丝液分别注入含有同轴针头的静电纺丝装置中，在室温下进行同轴静电纺丝，得到含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜。
步骤(1)所述含槲皮素的壳聚糖纳米粒子采用离子交联法制备，其制备方法为：
首先将壳聚糖溶于0.5～1.5％，v/v的乙酸溶液，调节pH值到5～5.5，得到1～6mg/mL的壳聚糖溶液；然后加入0.5-2mg/ml含槲皮素的乙醇水溶液和泊洛沙姆F127，最终溶液中槲皮素的浓度为0.5～1.5mg/mL，泊洛沙姆F127的质量分数为1-3％；搅拌均匀后将0.5～4mg/mL的三聚磷酸钠溶液以300～800μl/min的速率滴加到上述溶液中，实现壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为4:1～7:1，得到有乳光淡黄色d含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液。
步骤(1)中所述壳聚糖纳米粒子对槲皮素的包埋率≥80％，单个含有槲皮素的壳聚糖纳米粒子的直径为20～40nm。
步骤(2)所述益生因子包括低聚半乳糖、低聚果糖和低聚异麦芽糖中的一种或几种。
步骤(2)中所述含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液与聚乙烯醇溶液的体积比为1:1～3:1，聚乙烯醇溶液的质量分数为6％～14％，核层纺丝溶液中益生因子的质量分数为0.5％～5％；；
步骤(3)中所述壳层纺丝溶液中海藻酸钠的质量分数为6％～13％，聚氧化乙烯的质量分数为2％～4％，泊洛沙姆F127的质量分数为1～3％，蒸馏水/乙醇的体积比为60:40～90:10。
优选的，步骤(3)所述海藻酸钠与聚氧化乙烯的质量比为4:1～3:1。
步骤(4)所述含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜通过同轴静电纺丝法制备，其制备方法为：
将壳层纺丝液和核层纺丝液分别注入含有同轴针头的静电纺丝装置中，在室温下进行同轴静电纺丝，纺丝过程中溶剂挥发，得到含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜。
步骤(4)所述同轴纺丝的工艺参数为：纺丝温度为25-28℃，壳层纺丝液的流速为0.15～0.40ml/h，核层纺丝液的流速为0.15～0.35ml/h，内层针头直径0.4～0.6mm，外层针头直径0.85～1.26mm，施中加电压为15～30kv，接收距离为8～18cm。
本发明中所述的室温均指25℃。
上述方法制备的含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜可作为结肠靶向运输载体应用于促进益生菌的增殖。
上述方法制备的含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜可作为结肠靶向运输载体应用于抑制结肠癌细胞的增殖。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明首次利用同轴静电纺丝技术制备了含槲皮素和益生因子双重活性物质的结肠靶向控释体系，益生因子的存在提高了槲皮素在结肠部位的释放速率、扩散系数及生物利用度，在另一方面其对结肠癌细胞也有显著的抑制作用。
(2)本发明所制备的含槲皮素和益生因子双重活性物质的结肠靶向控释体系对双歧杆菌和乳酸杆菌两种类型的益生菌具有显著的增殖作用，而且产生的短链脂肪酸利于结肠健康。
(3)本发明所制备的含槲皮素和益生因子的结肠靶向控释体系，以天然多糖为主要材料，具有良好的生物相容性、可降解性及酶解响应性，能保证控释体系结肠的靶向释放。
(4)本发明将静电纺丝的应用拓展到制备结肠靶向控释体系的构建中，静电纺丝技术工艺简单、绿色环保且生产成本低，与其它方法制备活性物质结肠靶向运输体系相比，静电纺丝温和的操作方式保证了活性物质的生理活性，且所得的纳米纤维膜比表面积大、孔隙率高，纤维直径可控，提高了槲皮素的包埋率与释放率。
附图说明
图1为实施例1制备的含槲皮素的壳聚糖纳米粒子透射电镜图。
图2为实施例1制备的含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜的透射电镜图。
图3为实施例2制备的含槲皮素的壳聚糖纳米粒子的X射线衍射图。
图4为实施例3制备的含槲皮素的壳聚糖纳米粒子对Caco-2细胞增殖的作用情况。
图5为实施例4制备的含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜促进青春双歧杆菌(Bifidobacteria adolescentis)(a)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)(b)增殖图。
图6为实施例4制备的含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜促进青春双歧杆菌(Bifidobacteria adolescentis)(a)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)(b)产短链脂肪酸图。
图7为实施例5制备的含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜的抗氧化性能图。
图8为实施例6制备的含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜对Caco-2细胞增殖的作用情况。
图9为实施例7制备的含槲皮素的纳米纤维膜对Caco-2细胞增殖的作用情况。
图10为实施例8制备的含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜对HCT116细胞增殖的作用情况。
图11为实施例9制备的含槲皮素的纳米纤维膜对HCT116细胞增殖的作用情况。
图12为实施例10制备的含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜在模拟结肠液中的的释放曲线(a)及扩散系数图(b)。
图13为实施例11制备的含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜在第1天(a)、第3天(b)、第5天(c)的生物相容性图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。青春双歧杆菌(Bifidobacteria adolescentis)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)由合肥工业大学孙汉巨老师提供；Caco-2和HCT116细胞购自中科院上海细胞库；CCC-HIE-2细胞由广东省农科院蚕桑研究所提供。
实施例1
一种基于静电纺丝法制备的含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜的制备方法，具体步骤如下：
(1)采用离子交联法制备含活性物质的壳聚糖纳米粒子溶液：首先将壳聚糖(160kDa,脱乙酰度87％)溶于(1％，v/v)的乙酸溶液，搅拌得到9mL浓度为4mg/ml的壳聚糖溶液，然后调pH为5.3并用0.45μm膜过滤；然后向其中加入0.2g泊洛沙姆F127和1mL的1mg/ml含槲皮素乙醇水溶液；最后将1mg/ml的三聚磷酸钠溶液以400μl/min的速率滴加到上述溶液中实现壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为5:1，得到有乳光的淡黄色溶液，此为含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液。
(2)纺丝液的制备方法为：以蒸馏水/乙醇溶液为溶剂，配制海藻酸钠(1％水溶液的粘度为15～25cps)和聚氧化乙烯(Mw：100kDa)的混合溶液，然后加入泊洛沙姆F127，常温下搅拌24h，此为壳层溶液，最终壳层溶液中海藻酸钠的质量分数为8％，聚氧化乙烯的质量分数为2％，泊洛沙姆F127的质量分数为2％；再将8g聚乙烯醇(Mw:85000-124000)溶于100mL蒸馏水中，80℃下搅拌3h得到质量分数为8％聚乙烯醇溶液，然后冷却至室温；然后将(1)中所得含活性物质的壳聚糖纳米粒子溶液与聚乙烯醇溶液以2:1的体积比进行混合，然后添加低聚半乳糖，搅拌均匀，此为核层溶液，核层溶液中低聚半乳糖的质量分数为3％；
(3)将壳层纺丝液和核层纺丝液分别注入含有同轴针头的静电纺丝装置中，在室温下进行同轴静电纺丝，纺丝液的流速为0.3ml/h，内层针头直径0.5mm，外层针头直径1mm，施中加电压为17kv，接收距离为15cm。纺丝过程中溶剂挥发，得到含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜。
图1为实施例1中步骤(1)制备的含槲皮素的壳聚糖纳米粒子透射电镜图，由透射电镜结果可知单个纳米粒子的直径为20-40nm。上述工艺条件下制备的纳米纤维膜的透射电镜图见图2。
实施例2
含槲皮素的纳米粒子的X射线衍射图，具体步骤如下：
(1)按照实施例1中步骤(1)的方法制备含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液；
(2)采用高速离心机对所得的含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液进行离心(20000rpm，10oC，20min)，移除上清液，冷冻干燥下层沉淀，即为含槲皮素的纳米粒子。
(3)将壳聚糖、槲皮素粉末及(2)所得的含槲皮素的纳米粒子进行X射线衍射扫描。
图3是含槲皮素的纳米粒子的X射线衍射图，由图可知，槲皮素在2θ＝10.56，12.45，15.78，23.94，27.48处和壳聚糖在2θ＝10.13，20.14的吸收峰分别表明了二者的晶体结构。然而在含槲皮素的纳米粒子中，其衍射图谱无明显的峰型结构，说明槲皮素已被壳聚糖纳米粒子包埋。
实施例3
(1)细胞培养：Caco-2细胞用10％胎牛血清的DMEM培养液培养，培养液中含2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素和链霉素。细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养，隔2～3天换一次液，3～5天细胞长到80％左右传代。
(2)按照实施例2的方法制备含槲皮素的壳聚糖纳米粒子，然后采用CCK-8法研究其对结肠癌细胞的抑制作用。具体操作方法为：取对数生长期的Caco-2细胞制成单细胞悬液，按每孔1*104个细胞接种于96孔板中(每孔100μL)，置于37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁生长融合至80％时，分别加入不同浓度的含槲皮素的壳聚糖纳米粒子，每一浓度设5个复孔，以空白培养基的细胞作为阴性对照，调零。继续培养48h后拿出96孔板在酶标仪470nm处测定吸光值，计算抑制率。
图4是含槲皮素的壳聚糖纳米粒子对Caco-2细胞增值的作用情况。由图可知，所得纳米粒子能显著抑制Caco-2细胞的增殖。
实施例4
(1)按照实施例1中的方法，制备含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜，不同之处在于添加了不同的益生因子(低聚果糖、低聚半乳糖及低聚异麦芽糖)，其在核层溶液中的质量分数分别为0％～4％；
(2)菌种的活化：先制备液体活化培养基100mL，在121℃下灭菌20min，冷却。开启青春双歧杆菌和发酵乳杆菌菌种冻干粉，接种于液体活化培养基，放入厌氧培养箱中在37℃下培养48h，反复活化两次。最后，取少量培养液，通过平板菌落计数法测得菌体浓度约为2×106CFU/mL。
按照5％的比例接种已活化的青春双歧杆菌和发酵乳杆菌，向其中加入含不同益生因子的结肠靶向纳米纤维膜，在37℃下厌氧培养48h。测定培养液在600nm处的吸光度值，并测定培养液的pH值。同时在8h、16h、24h和48h取发酵液，采用高效液相色谱测定发酵液中短链脂肪酸的含量。
由图5可见，含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜可以促进青春双歧杆菌(a)和发酵乳杆菌(b)的增殖，具有益生效应。
此外由图6可知，在青春双歧杆菌(a)和发酵乳杆菌(b)的作用下，所得的含益生因子的纳米纤维膜能够有效的产短链脂肪酸，其对结肠癌的预防也具有潜在的作用。其中以低聚半乳糖效果最佳。因此后续实验选用低聚半乳糖作为益生因子的代表。
实施例5
(1)按照实施例1中的方法，制备含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜；
(2)按照实施例1中的方法，不同之处在于制备只含槲皮素的纳米纤维膜；
(3)配制一系列浓度梯度的(1)(2)纤维膜溶液，使用70％乙醇溶解。然后取0.4mL一定浓度的样品溶液于1.5mL离心管中，加入0.4mL无水乙醇，随后加入0.4mL DPPH溶液，混合均匀，室温下避光反应30min。空白溶液的测定方法为：取0.4mL无水乙醇于1.5mL离心管中，加入0.4mL水，混合均匀，再加入0.4mL DPPH溶液，室温下避光反应30min。待反应结束后，在520nm波长下测定溶液吸光度。
图7是含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜的抗氧化性能图。由图可知，含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜具有较好的抗氧化性。而且与纯槲皮素粉末相比，含同等质量的纤维膜的抗氧化性更高。
实施例6
与实施例5的不同之处在于，本实施例是按照实施例1的方法制备含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜。
图8是含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜对Caco-2细胞增值的作用情况。由图可知，所得含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜能显著抑制Caco-2细胞的增殖，其在24，48，和72h下的IC50值分别为3.52，2.08和1.51mg/mL。
实施例7
(1)按照实施例1中的方法，制备只含槲皮素的纳米纤维膜。即与实施例1的不同之处在于，核层溶液中不添加益生因子。
(2)按照(1)方法制备含槲皮素的纤维膜，采用实施例3的方法研究其对Caco-2的抑制活性。
图9是含槲皮素的纳米纤维膜对Caco-2细胞增殖的作用情况。由图可知，所得含槲皮素的纳米纤维膜能显著抑制Caco-2细胞的增殖，其在24，48，和72h下的IC50值分别为4.36,2.81and 2.01mg/mL。但实施例6中含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜相对Caco-2细胞的增殖的抑制效果更好，说明低聚半乳糖的添加对Caco-2细胞的增殖有促进作用。
实施例8
本实施例与实施例4的不同之处在于细胞为HCT116细胞。
图10是含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜对HCT116细胞增值的作用情况。由图可知，含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜能显著抑制HCT116细胞的增殖，其在24，48，和72h下的IC50值分别为2.83，1.84和1.47mg/mL。
实施例9
本实施例与实施例5的不同之处在于细胞为HCT116细胞。
图11是含槲皮素的纳米纤维膜对HCT116细胞增值的作用情况。由图可知，所得含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜能显著抑制HCT116细胞的增殖，其在24，48，和72h下的IC50值分别为3.57，2.31和1.74mg/mL。由此可见，低聚半乳糖的添加对HCT116细胞的增殖有促进作用。
实施例10
含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜在体外模拟胃肠道环境下释放速率的考察，具体步骤如下：
(1)按照实施例1中的方法，制备含槲皮素和低聚半乳糖的纳米纤维膜；
(2)按照实施例1中的方法，不同之处在于制备只含槲皮素的纳米纤维膜；
(3)参考中国药典2010版二部附录体外释放度测定法第二法(浆法)并作适当修改，条件温度为37±0.5oC，释放介质为模拟人工胃液750ml，人工肠液1000ml，人工结肠液900ml，将纤维膜分别置于胃液2h，随后放入小肠液中4h，最后放入结肠液16h，于设定的时间点取样，同时补加等量等温的溶出介质，取出样品用0.45μm微孔滤膜滤过，利用高效液相色谱法测定槲皮素的浓度，平行做三组，计算累积溶出率。
部分溶液的配制如下：
A人工胃液：量取浓盐酸适量，利用pH计，加水稀释至pH1.2，然后加入10mg/ml胃蛋白酶即得。
B人工肠液:配置pH6.8的磷酸缓冲液，然后加入10mg/ml胰蛋白酶即得。
C人工结肠液：配置pH7.4的磷酸缓冲液，然后加入5U/mlβ-葡萄糖苷酶即得。
参考药典规定的释放度模拟试验，模拟胃、小肠及结肠部位的环境，并根据食物在各段胃肠道内的转运时间，研究槲皮素的释放。
图12是含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜在模拟结肠液中的的释放曲线(a)及扩散系数(b)图。由图12(a)可知，纳米纤维膜在模拟结肠液中实现73％的释放。结果表明制备的纳米纤维膜有良好的结肠靶向性。特别地，添加了低聚半乳糖的纤维膜中，槲皮素的释放速率更快。图12(b)可以看出，含有低聚半乳糖和槲皮素的纤维膜中槲皮素的扩散系数较只含有槲皮素的纤维膜提高了38.7％，也说明低聚半乳糖对槲皮素的释放有促进作用。
实施例11
(1)细胞培养：CCC-HIE-2细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养，培养液中含2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素和链霉素。细胞置于37oC、5％CO2培养箱中培养，隔2～3天换一次液，3～5天细胞长到80％左右传代。
(2)按照实施例(1)制备不含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜。然后用戊二醛对纤维膜进行固定，然后用磷酸缓冲盐(PBS)去除多余的戊二醛。将纤维膜裁剪成1cm*1cm大小的并用75％的乙醇溶液消毒4h，然后用PBS冲洗。此后，为了促进细胞附着在纤维膜表面，将纤维膜浸泡在细胞培养液中12h。然后，CCC-HIE-2细胞植入到含纤维膜的24孔板中(1*105个细胞/孔)。在特定的时间收集纤维膜，用PBS冲洗除去非附着的细胞，然后在室温下固定3％的戊二醛，通过一系列的分级酒精溶液(30％，50％，70％，80％，90％，95％，100％)脱水，然后晾干并通过扫描电镜观察纤维膜上的细胞数量。
图13是不含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜的生物相容性图。由图可知，培养1d后，有少量的细胞附着在纤维表面上。培养3d后，扫描电镜图像显示CCC-HIE-2细胞在纳米纤维的表面上很好地扩散，显示了与相邻细胞间的细胞紧密连接，并与周围的纤维相结合。在第5天，细胞被观察到形成一个连续的单层膜覆盖纤维膜表面并沿着纳米纤维的孔生长，这表明了一种极好的相互作用。该结果表明，所得的纤维膜载体具有良好的生物相容性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）采用离子交联法制备含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液；
（2）将步骤（1）制备的含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液、益生因子和聚乙烯醇溶液混合均匀，得到核层纺丝溶液；
（3）将海藻酸钠、聚氧化乙烯和泊洛沙姆F127溶于蒸馏水/乙醇混合体系中，搅拌均匀，得到壳层纺丝溶液；
（4）将壳层纺丝液和核层纺丝液分别注入含有同轴针头的静电纺丝装置中，进行同轴静电纺丝，得到含槲皮素和益生因子的纳米纤维膜；
步骤（2）所述益生因子为低聚半乳糖；
步骤（1）所述含槲皮素的壳聚糖纳米粒子的制备步骤为：首先将壳聚糖溶于0.5~1.5%，v/v的乙酸溶液，调节pH值为5~5.5，得到1~6mg/mL的壳聚糖溶液；然后向其中加入0.5~2mg/mL的含槲皮素的乙醇水溶液和泊洛沙姆F127，最终溶液中槲皮素的浓度为0.5~1.5mg/mL，泊洛沙姆F127的质量分数为1-3%；搅拌后，再将0.5~4mg/mL的三聚磷酸钠溶液以300~800μL/min的速率滴加到上述溶液中，壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为4:1~7:1，得到有乳光淡黄色的含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液；
步骤（2）所述含槲皮素的壳聚糖纳米粒子溶液与聚乙烯醇溶液的体积比为1:1~3:1，聚乙烯醇溶液的质量分数为6%~14%，核层溶液中益生因子的质量分数为0.5%~5%；
步骤（3）中所述壳层纺丝溶液中海藻酸钠的质量分数为6%~13%，聚氧化乙烯的质量分数为2%~4%，泊洛沙姆F127的质量分数为1~3%，蒸馏水/乙醇的体积比为60:40~90:10；
步骤（3）中所述海藻酸钠与聚氧化乙烯的质量比为4:1~3:1。
2.根据权利要求1所述的含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜制备方法，其特征在于，步骤（4）所述同轴纺丝的工艺参数为：纺丝温度为25~28℃，壳层纺丝液的流速为0.15~0.40ml/h，核层纺丝液的流速为0.15~0.35ml/h，内层针头直径0.4~0.6mm，外层针头直径0.85~1.26mm，施中加电压为15~30kv，接收距离为8~18cm。
3.根据权利要求1或2所述的含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜制备方法，其特征在于，步骤（1）所述壳聚糖纳米粒子对槲皮素的包埋率≥80%，单个含有槲皮素的壳聚糖纳米粒子的直径为20~40nm。
4.一种根据权利要求1-3任一项所述方法制备的含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜。
5.根据权利要求4所述的含槲皮素和益生因子的结肠靶向纳米纤维膜在制备结肠靶向运输体系材料及预防结肠癌药物中的应用。
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