CN114452908A - 一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法 - Google Patents

一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法，该制备方法包括将预设配比的活性微生物与生物染色剂混合获得染色后活性微生物液；将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后乳酸菌液混合进行一次包埋获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒；将获得的染色海藻酸钙微胶囊颗粒加入至壳聚糖溶液获得二次包埋的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊；相较于现有方法所制备的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊对样品形态及设备要求较高的现状，该制备方法所制备的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊具有一定显色效果，在光学显微镜下即可被清晰地观察到，镜检样品形态要求低，镜检设备成本低，镜检过程快速便捷，镜检结果准确。

Description

一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法
技术领域
本发明涉及微胶囊技术领域，特别涉及一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法。
背景技术
目前壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的方法有多种，如采用海藻酸钠和碳酸钙制作，或者将壳聚糖和氯化钙的混合溶液直接滴入海藻酸钠溶液中反应形成微胶囊等，然而采用现有方法所制备的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊都需要冷冻干燥后使用扫描电镜观察，没有简单的办法观察微胶囊使用壳聚糖二次包埋后的状态。因此，现有的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊制样要求高，观察方法耗费时间较长，且设备成本较高。
故需要寻找一种耗时短、成本低、便于镜检的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊制备方法。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法，制备获得的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊可通过普通的光学显微镜进行形态观察，耗时短、成本低。
第一方面，提供一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法，所述制备方法包括：
将预设配比的活性微生物与生物染色剂混合获得染色后活性微生物液；
将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后乳酸菌液混合进行一次包埋获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒；
将获得的所述染色海藻酸钙微胶囊颗粒加入至壳聚糖溶液获得二次包埋的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊。
在一种较佳的实施方式中，所述活性微生物为食用菌种，所述生物染色剂为番红染液或结晶紫染液；
所述将预设配比的活性微生物与生物染色剂混合获得染色后活性微生物液，包括：
将活性微生物与质量百分数为20～30％的番红染液或2.5％结晶紫染液等体积混合，染色15～30min获得染色后活性微生物液。
在一种较佳的实施方式中，所述将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后乳酸菌液混合进行一次包埋获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒，包括：
将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后乳酸菌液混合获得染色悬浮液；
将所述染色悬浮液加入至乳化剂中形成染色乳状液；
在所述染色乳状液中加入酸性乳化剂获得第一反应液；
在所述第一反应液中加入洗涤介质洗涤并分离获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒。
在一种较佳的实施方式中，所述将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后乳酸菌液混合获得染色悬浮液，包括：
将质量比为8-12：1.8-2.2：1.8-2.2：250的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水与等体积染色后乳酸菌液搅拌混合均匀，在3～6°温度下静置反应1～2小时后脱气，获得染色悬浮液。
在一种较佳的实施方式中，所述将所述染色悬浮液加入至乳化剂中形成染色乳状液，包括：
在搅拌下将所述染色悬浮液加入乳化剂中形成油包水形态的染色乳状液，所述染色悬浮液与所述乳化剂的体积比为20～30:70～80。
在一种较佳的实施方式中，所述在所述第一反应液中加入洗涤介质洗涤并分离获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒，包括：
搅拌下在所述第一反应液中加入洗涤介质；
通过分液漏斗分出染色海藻酸钙微胶囊层；
用生理盐水冲洗所述染色海藻酸钙微胶囊层至无油相残留，获得第二反应液；
将所述第二反应液离心分离获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒。
在一种较佳的实施方式中，所述可溶性海藻酸盐包括海藻酸钠、海藻酸钾中的至少一种；
所述可溶性碳酸盐包括碳酸钠、碳酸钾中的至少一种；
所述可溶性钙盐包括氯化钙、硝酸钙中的至少一种；
所述乳化剂包括至少一种植物油。
在一种较佳的实施方式中，所述酸性乳化剂中酸与所述染色乳状液中CaCO3的物质的量之比为2～4:1。
在一种较佳的实施方式中，所述将获得的所述染色海藻酸钙微胶囊颗粒加入至壳聚糖溶液获得二次包埋的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊，包括：
在搅拌下将所述染色海藻酸钙微胶囊颗粒缓慢加入至壳聚糖溶液中反应30～50min获得二次包埋的所述壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液；
使用生理盐水清洗所述壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液获得清洗后的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊。
第二方面，提供一种基于第一方面所述制备方法制备的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的镜检方法，其特征在于，所述镜检方法包括：
将所述壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶于生理盐水获得待检壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液；
将所述待检壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液滴至载玻片上并放置于摄像显微镜下进行镜检。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
本发明提供一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法，该制备方法包括将预设配比的活性微生物与生物染色剂混合获得染色后活性微生物液；将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后乳酸菌液混合进行一次包埋获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒；将获得的染色海藻酸钙微胶囊颗粒加入至壳聚糖溶液获得二次包埋的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊；相较于现有方法所制备的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊对样品形态及设备要求较高的现状，该制备方法所制备的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊具有一定显色效果，在光学显微镜下即可被清晰地观察到，镜检样品形态要求低，镜检设备成本低，镜检过程快速便捷，镜检结果准确；
本发明提供一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法，该镜检方法包括：将壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶于生理盐水获得待检壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液；将待检壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液滴至载玻片上并放置于摄像显微镜下进行镜检，该镜检方法是基于染色后的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊进行的，壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊因具有显色效果，通过摄像显微镜即可进行形态观察；进一步，本发明中进行镜检时，采用生理盐水稀释能有效分散微胶囊，防止微胶囊之间因为静电力而重合、重叠而造成重影导致无法观察其形态。
附图说明
图1为本实施例中壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法流程图；
图2为本实施例中壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的镜检方法流程图；
图3为本实施例乳酸菌液一次包埋后的摄像显微镜影像；
图4为本实施例乳酸菌二次包埋后的摄像显微镜影像。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
鉴于当前壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊需要在冻干态下使用电镜扫描进行形态观察，对于样品形态、制样时间及设备要求较高，并不是每个研发团队都能负担或达到该镜检要求，严重影响研发进度。为了改变上述现状，本实施例提供一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法，所制备的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊通过简单的镜检方法即可观察。
下面将结合附图1～4对该壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法作进一步详细描述。
如图1所示，本实施例中壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法包括如下步骤：
S10、将预设配比的活性微生物与生物染色剂混合获得染色后活性微生物液。
在一种优选地实施方式中，活性微生物为浓缩的食用菌种，优选为浓缩的乳酸菌，且乳酸菌浓度为2.0-4.0×1011CFU/mL。
所述生物染色剂为革兰氏染色剂，优选为番红染液、结晶紫染液。番红是碱性染料，能溶于水，可以与细胞核中的核酸结合并把核染成红色；结晶紫也是一种碱性染料，能溶于水，可以与细胞核中的核酸结合并把核染成蓝色。本实施例采用番红染液/结晶紫染液将乳酸菌核染成红色或蓝色。
具体地，步骤S1为：
将活性微生物与质量百分数为20～30％的番红染液或2.5％的结晶紫染液等体积混合，反应15～30min获得染色后活性微生物液。
S20、将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后活性微生物液混合进行一次包埋获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒。具体地，步骤S20包括：
S21、将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后活性微生物液混合获得染色悬浮液。
更具体地，步骤S21包括：
将质量比为8-12：1.8-2.2：1.8-2.2：250的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水与等体积染色后活性微生物液搅拌混合均匀，并在3～6°温度下静置反应1～2小时后脱气，获得染色悬浮液。
其中，可溶性海藻酸盐包括海藻酸钠、海藻酸钾中的至少一种，优选质量百分数为4％的海藻酸钠溶液。可溶性碳酸盐包括碳酸钠、碳酸钾中的至少一种，优选质量百分数为5％的碳酸钠溶液。可溶性钙盐包括氯化钙、硝酸钙中的至少一种，优选为质量百分数为10％的氯化钙溶液。
S22、将染色悬浮液加入至乳化剂中形成染色乳状液。更具体的，步骤S22具体包括：
在搅拌下将染色悬浮液加入乳化剂中形成油包水状(w/o)的染色乳状液，染色悬浮液与乳化剂的体积比为20～30:70～100，优选为30：100。
其中，乳化剂包括至少一种植物油，优选为大豆油、橄榄油、玉米油中的一种或多种的混合物。本实施例采用大豆油，其含1.0％的span80，为一种乳化性能优良且易得的乳化剂。
进一步优选地，该步骤S22中搅拌速度为300r/min，搅拌时间为30min。
S23、在染色乳状液中加入酸性乳化剂获得第一反应液。
其中，酸性乳化剂中酸与染色乳状液中CaCO3的物质的量之比为2～4:1。作为一种优选，酸性乳化剂优选为添加有冰醋酸的大豆油，且酸性乳化剂中冰醋酸的质量百分数为25％。
具体地，在染色乳状液中逐滴加入酸性乳化剂中，滴加完毕后继续搅拌30min，获得第一反应液。
S24、在第一反应液中加入洗涤介质洗涤并分离获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒。更具体的，步骤S24包括：
S24a、搅拌下在第一反应液中加入洗涤介质。
具体地，洗涤介质可采用含1.0％吐温的生理盐水，且作为一种优选，洗涤介质的体积为0.5～2L，洗涤过程中保持持续搅拌，且搅拌时间为10min。
S24b、通过分液漏斗分出染色海藻酸钙微胶囊层。
具体地，当洗涤介质采用含1.0％吐温的生理盐水时，染色海藻酸钙微胶囊层为下层溶液。
S24c、用生理盐水冲洗染色海藻酸钙微胶囊层至无油相残留，获得第二反应液。
具体地，同样采用分液漏斗分液的方式，采用多次洗涤的方式(至少两次)用生理盐水冲洗染色海藻酸钙微胶囊层至无油相分出，则获得的溶液即为第二反应液。
S24d、将第二反应液离心分离获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒。
具体地，离心分离机的转速优选1500rpm，离心时间优选10min。
需要说明的是，该步骤S20中，染色悬浮液、染色海藻酸钙微胶囊颗粒、染色乳状液、第一反应液、染色海藻酸钙微胶囊颗粒均具因乳酸菌核被染色而有一定显色效果。
在完成步骤S20获得离心后的固态的染色海藻酸钙微胶囊颗粒后，可将固态的染色海藻酸钙微胶囊颗粒与生理盐水1:1混合，并于4℃下进行保存。
S30、将获得的染色海藻酸钙微胶囊颗粒加入至壳聚糖溶液获得二次包埋的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊。
具体地，步骤S30包括
S31、在搅拌下将步骤S20获得的染色海藻酸钙微胶囊颗粒缓慢加入至壳聚糖溶液中反应30～50min获得二次包埋的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液，该步骤中壳聚糖的物质的量远大于染色海藻酸钙微胶囊颗粒的物质的量。
在一种实施方式中，壳聚糖溶液中壳聚糖的质量百分数为0.2～1.0％，优选为0.4％。以及，该步骤将壳聚糖溶液置于烧杯中，在加入染色海藻酸钙微胶囊颗粒时采用直立四浆搅拌器在100～200rpm转速下进行。
作为一种优选，生理盐水保存下的染色海藻酸钙微胶囊颗粒溶液与壳聚糖溶液的体积比优选为1:6。
S32、使用生理盐水清洗壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液以除去溶液中多余的壳聚糖分子，获得清洗后的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊。
如图2所示，本实施例还提供一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的镜检方法，该镜检方法的对象为上述步骤S10～S30制备获得的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊。具体地，该镜检方法包括：
S40、将壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶于生理盐水获得待检壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液。
将壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊采用生理盐水稀释，能有效分散微胶囊，防止微胶囊之间因为静电力而重合、重叠，造成重影而无法观察其形态。
示例性的，将0.05g壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶于1ml生理盐水进行稀释获得待检壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液。
S50、将待检壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液滴至载玻片上并放置于摄像显微镜下进行镜检。
用滴管吸取待检壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液并向载玻片上滴一滴该微胶囊溶液，轻轻摇动载玻片使该滴微胶囊溶液均匀分散，放置于摄像显微镜10倍目镜4倍物镜下进行观察。在此放大倍数下，微胶囊的形态、大小等不会因放大倍数小无法观察，可以通过放大图片观察。
为对壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法及镜检方法作进一步的示例性说明，下面将结合具体实施例作进一步描述。
实施例1
首先将87.5ml浓度为2.4×1011CFU/ml的乳酸菌液与87.5ml 25％番红染液混合染色20min获得染色后乳酸菌液，染色后乳酸菌液浓度为1.2×1011CFU/ml
然后将染色后乳酸菌液、4％海藻酸钠溶液、5％碳酸钠溶液、10％氯化钙溶液按照体积比为175ml：225ml：36ml：19ml搅拌均匀混合，然后在4℃条件下静置1h后脱气，获得染色悬浮液。接着，按照水油体积比30:100将上述染色悬浮液加入到大豆油(含1.0％span80)中，在转速300r/min下搅拌30min，形成油包水(w/o)染色乳状液。在获得的染色乳状液中逐滴加入含25％冰醋酸的大豆油，且HAC和染色乳状液中CaCO3的摩尔比为3:1，继续搅拌30min获得第一反应液。在获得的第一反应液中加入1L洗涤介质(含1.0％吐温的生理盐水)，继续搅拌10min，用分液漏斗分出染色海藻酸钙微胶囊层。接着，将分液漏斗分出的染色海藻酸钙微胶囊用生理盐水冲洗微胶囊2次至无油相残留获得第二反应液，采用离心机在转速1500rpm下离心10min，收集获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒，并将收集得到的微胶染色海藻酸钙微胶囊颗粒以体积比1：1置于生理盐水中于4℃下保存。同时，将0.05g染色海藻酸钙微胶囊颗粒溶于1ml生理盐水混合制备染色海藻酸钙微胶囊溶液，用滴管吸取染色海藻酸钙微胶囊溶液并向载玻片上滴一滴该微胶囊溶液，轻轻摇动载玻片使该滴微胶囊溶液均匀分散，放置于摄像显微镜10倍目镜4倍物镜下进行观察，可观察到如图片3所示图像。可见，由于染色海藻酸钙微胶囊中的活性微生物是经过染色的，故在摄像显微镜下能清晰地观察到该微胶囊颗粒。
然后，取600ml质量百分数为0.4％的壳聚糖溶液加入1L的烧杯中，使用直立四浆搅拌器在转速100-200rpm下进行搅拌，缓慢向烧杯中流加100ml生理盐水保存的染色海藻酸钙微胶囊溶液，流加完成后包埋反应40min。最后使用生理盐水清洗壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液以除去溶液中多余的壳聚糖分子，获得清洗后的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊。
在制备获得壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊后，对该微胶囊进行镜检。向1.5ml离心管中加0.05g壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊，使用生理盐水稀释至1ml左右混匀，使用滴管吸1ml左右的混合液，向载玻片滴一滴混合液，轻轻摇动载玻片使液体均匀分散，放置于摄像显微镜10倍目镜4倍物镜下观察并获得如图4所示的图像。可见该图像基本无重影或重叠，可清晰地观察到壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊。
综上，相较于现有方法所制备的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊对样品形态及设备要求较高的现状，本实施例提供的制备方法所制备的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊具有一定显色效果，在摄像显微镜下即可被清晰地观察到，镜检样品形态要求低，镜检设备成本低，镜检过程快速便捷，镜检结果准确；以及，本实施例在采用摄像显微镜进行镜检时，采用生理盐水稀释能有效分散微胶囊，所观察的微胶囊之间无重合、重叠，能清晰地观察到微胶囊的形态。
上述所有可选技术方案，可以采用任意结合形成本发明的可选实施例，即可将任意多个实施例进行组合，从而获得应对不同应用场景的需求，均在本申请的保护范围内，在此不再一一赘述。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将预设配比的活性微生物与生物染色剂混合获得染色后活性微生物液；
将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后活性微生物液混合进行一次包埋获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒；
将获得的所述染色海藻酸钙微胶囊颗粒加入至壳聚糖溶液获得二次包埋的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述活性微生物为食用菌种，所述生物染色剂为番红染液或结晶紫染液；
所述将预设配比的活性微生物与生物染色剂混合获得染色后活性微生物液，包括：
将活性微生物与质量百分数为20～30％的番红染液或2.5％结晶紫染液等体积混合，染色15～30min获得染色后活性微生物液。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后活性微生物液混合进行一次包埋获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒，包括：
将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后活性微生物液混合获得染色悬浮液；
将所述染色悬浮液加入至乳化剂中形成染色乳状液；
在所述染色乳状液中加入酸性乳化剂获得第一反应液；
在所述第一反应液中加入洗涤介质洗涤并分离获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述将预设配比的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水及染色后活性微生物液混合获得染色悬浮液，包括：
将质量比为8-12：1.8-2.2：1.8-2.2：250的可溶性海藻酸盐、可溶性碳酸盐、可溶性钙盐、水与等体积染色后活性微生物液搅拌混合均匀，在3～6°温度下静置反应1～2小时后脱气，获得染色悬浮液。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述将所述染色悬浮液加入至乳化剂中形成染色乳状液，包括：
在搅拌下将所述染色悬浮液加入乳化剂中形成油包水形态的染色乳状液，所述染色悬浮液与所述乳化剂的体积比为20～30:70～80。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述在所述第一反应液中加入洗涤介质洗涤并分离获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒，包括：
搅拌下在所述第一反应液中加入洗涤介质；
通过分液漏斗分出染色海藻酸钙微胶囊层；
用生理盐水冲洗所述染色海藻酸钙微胶囊层至无油相残留，获得第二反应液；
将所述第二反应液离心分离获得染色海藻酸钙微胶囊颗粒。
7.如权利要求3～6任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述可溶性海藻酸盐包括海藻酸钠、海藻酸钾中的至少一种；
所述可溶性碳酸盐包括碳酸钠、碳酸钾中的至少一种；
所述可溶性钙盐包括氯化钙、硝酸钙中的至少一种；
所述乳化剂包括至少一种植物油。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述酸性乳化剂中酸与所述染色乳状液中CaCO3的物质的量之比为2～4:1。
9.如权利要求1～6、8任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述将获得的所述染色海藻酸钙微胶囊颗粒加入至壳聚糖溶液获得二次包埋的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊，包括：
在搅拌下将所述染色海藻酸钙微胶囊颗粒缓慢加入至壳聚糖溶液中反应30～50min获得二次包埋的所述壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液；
使用生理盐水清洗所述壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液获得清洗后的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊。
10.一种基于权利要求1～9任意一项所述制备方法制备的壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊的镜检方法，其特征在于，所述镜检方法包括：
将所述壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶于生理盐水获得待检壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液；
将所述待检壳聚糖包埋海藻酸钙微胶囊溶液滴至载玻片上并放置于摄像显微镜下进行镜检。
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