CN115992230A

CN115992230A - 神经母细胞瘤危险度分级标志物及其应用

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Publication number: CN115992230A
Application number: CN202210881503.9A
Authority: CN
Inventors: 张万存; 杜邦; 张现伟; 侯立功; 张飞; 张耀东; 李利锋; 于志丹; 梁莹; 张孟欣; 郜晶; 孙萌; 秦雪怡
Original assignee: Henan Childrens Hospital Zhengzhou Childrens Hospital
Current assignee: Henan Childrens Hospital Zhengzhou Childrens Hospital
Priority date: 2022-07-26
Filing date: 2022-07-26
Publication date: 2023-04-21
Anticipated expiration: 2042-07-26
Also published as: CN115992230B

Abstract

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一组神经母细胞瘤危险度分级标志物及其应用。本发明提供了一组标志物在制备神经母细胞瘤危险度分级药剂中的应用，所述标志物为基因标志物，所述标志物为FABP4、HBB、MGST1、S100A9、 CXCL9、SERPINE1、MFAP4、HMOX1、CD36、CIP2A、 UBE2C、KNTC1、ALK、IL10、ALPL、IGF2、NXN、ITGA1、 CDK2、CHL1、TCF7L2、UNC5D、ERBB3、CGA中的一种或两种以上的标志物组合。本发明还包括采用荧光定量检测所述标志物的引物组合，以及所述标志物的获取方法。本发明采用基于逆转录链式反应（RT‑PCR）的方法建立了一个基于非侵入性血浆的HR‑NB风险分类诊断模型。本发明基于候选生物标志物的早期诊断模型对HR‑NB的稳健风险评级和未来的靶向治疗具有重要意义。

Description

神经母细胞瘤危险度分级标志物及其应用

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一组神经母细胞瘤危险度分级标志物及其应用。

背景技术

神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤，起源于胚胎神经脊，起病隐匿，进展迅速，占儿童癌症发病率的8％，却占儿童肿瘤死亡率的15％。神经母细胞瘤的特征是具有显著异质疾病谱性，包括广泛肿瘤患者在未经治疗的情况下自发退化或分化，以及尽管采用了强化多模式方法治疗，但耐药肿瘤但仍有转移扩散的现象，因此，个体差异显著。

基于诊断时的年龄、国际神经母细胞瘤分期系统(International NeuroblastomaStaging Syste，INSS)阶段、肿瘤组织MYCN状态、国际神经母细胞瘤病理委员会(International Neuroblastoma Pathology Committee，INPC)的分类和染色体倍体等，临床上，儿童肿瘤学组(Children's Oncology Group，COG)将NB分为低危、中危和高危。低危NB、中危NB和高危NB患儿的5年无事件生存率和5年总生存率分别为91.3％和97.5％、85.1％和96.7％、37.7％和48.9％，可以看出高危NB患儿的生存率较低，迫切需要进一步提升。

研究表明，缺乏高危神经母细胞瘤(HR-NB)风险分类诊断模型和有效的治疗靶点是导致患儿生存率显著低于中低风险NB(LIR-NB)的主要原因(van Heerden,J.andM.Kruger,Management of neuroblastoma in limited-resource settings.World JClin Oncol,2020.11(8):p.629-643.)。因此，对HR-NB进行系统研究，寻找其诊断生物标志物和异常代谢途径，有望提高HR-NB患儿的生存率。

现有技术中，主要依靠血、尿生物标志物，并进行CT、核磁、组织活检等系列检测后才能对NB进行危险度分级，且组织活检需要穿刺或者手术获得肿瘤组织才能进行，操作难度大，存在一定的风险，且检测成本高。

利用代谢组学能够表征样本中的所有小分子，以准确反映疾病状态的生物代谢特征，为疾病诊断和预后寻找新的生物标志物。转录组学通过高通量测序的方式从整体水平研究在特定时间和状态下在特定细胞、组织或个体中转录的所有mRNA，揭示不同功能状态下基因表达和结构的差异。所以，采用代谢组学和转录组学的联合分析的方法有望发掘HR-NB中改变的代谢途径和诊断生物标志物，建立HR-NB早期诊断模型，寻找新的治疗靶点。

基于此，本发明通过筛选得到HR-NB分类诊断标志物，作为一种诊断工具，研究其在建立非侵入性、高特异性和高敏感性的NB危险度分级模型中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一组神经母细胞瘤危险度分级标志物及其应用，为高危神经母细胞瘤的分级提供一种有效的诊断工具。

本发明还包括采用荧光定量检测所述标志物的引物组合，以及所述标志物的获取方法。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一组标志物在制备神经母细胞瘤危险度分级药剂中的应用，所述标志物为基因标志物，所述标志物为FABP4、HBB、MGST1、S100A9、CXCL9、SERPINE1、MFAP4、HMOX1、CD36、CIP2A、UBE2C、KNTC1、ALK、IL10、ALPL、IGF2、NXN、ITGA1、CDK2、CHL1、TCF7L2、UNC5D、ERBB3、CGA中的一种或两种以上的标志物组合

优选的，所述标志物为UNC5D、S100A9、CDK2中的一种或两种以上的标志物组合。

进一步优选的，所述标志物为UNC5D、S100A9、CDK2或三者的组合。

基于一个总的发明构思，本发明还包括检测所述标志物表达量的物质在制备神经母细胞瘤危险度分级产品中的应用。

具体的，检测所述标志物表达量的物质为引物或探针。

具体的，采用荧光定量检测所述标志物表达量，检测所述标志物的引物组合如下表所示：

具体的，采用荧光定量检测UNC5D所用的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，检测UNC5D所用的下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。

具体的，采用荧光定量检测S100A9所用的上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，检测S100A9所用的下游引物序列如SEQ ID NO.4所示。

具体的，采用荧光定量检测CDK2所用的上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，检测CDK2所用的下游引物序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步的，本发明还提供了一种包括所述标志物的神经母细胞瘤危险度分级产品。

具体的，所述产品为试剂、试剂盒或生物芯片。

与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：

1、本发明对从临床神经母细胞瘤(Neuroblastoma，NB)组织样本中对高危NB与中低危NB危险度分级潜在生物标志物进行筛选，并对临床NB组织样本进行转录组学分析，从24个潜在标志物中筛选获得3个NB危险度分级生物标志物(S100A9，CDK2，UNC5D)。然后基于logistic回归分析建立了S100A9，CDK2，UNC5D三个生物标志物用于对NB危险度进行分级的诊断模型，试验验证该模型对NB危险度分级诊断的灵敏度及特异性均为80％。本发明通过验证基于NB危险度分级的S100A9，CDK2，UNC5D三个生物标志物在应用过程中具有无创、检测方便、灵敏度及特异性高等优势。

2、本发明采用基于逆转录链式反应(RT-PCR)的方法建立了一个基于非侵入性血浆的HR-NB风险分类诊断模型。本发明基于候选生物标志物的早期诊断模型对HR-NB的稳健风险评级和未来的靶向治疗具有重要意义。

3、本发明所述标志物可以用于制备神经母细胞瘤危险度分级试剂、试剂盒或生物芯片，通过检测受试者血浆中标志物的表达量，对NB进行快速分级诊断和判定，具有重要的临床应用价值。

附图说明

图1为高危NB组与中低危NB组差异基因表达热图；

图2为显示高危NB组与中低危NB组在肿瘤组织中的差异表达基因的火山图；

图3为高危组与中低危组在肿瘤组织中的差异表达基因；

图4为RT-PCR中基因的表达趋势与转录组学结果一致性柱状图；

图5为将建立的NB危险度分级模型通过受试者工作特征曲线进行分析的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。

临床上，基于诊断时的年龄、国际神经母细胞瘤分期系统(InternationalNeuroblastoma Staging Syste，INSS)阶段、肿瘤组织MYCN状态、国际神经母细胞瘤病理委员会(International Neuroblastoma Pathology Committee，INPC)的分类和染色体倍体等，儿童肿瘤学组(Children'sOncology Group，COG)将NB分为低危、中危和高危(儿童神经母细胞瘤诊疗专家共识[J].中华小儿外科杂志,2015,36(01):3-7.)。

以下实施例中，使用的96份血浆(包括58例高危HR-NB，以及38例中低危LIR-NB)样本和55份NB组织样本(包括32例高危HR-NB，以及23例中低危LIR-NB)均来自于河南省儿童医院。

实施例1转录组学筛选NB危险度分级潜在生物标志物

1.1入组患儿临床资料

发明人前期对32例高危NB与23例中低危NB进行转录组分析，并使用偏最小二乘分析法(PLS-DA)进行分析。结果如表1所示。

表1转录组学分析NB组织一般临床诊疗基线特征

从表1中可以看出，高危NB组与中低危NB组在年龄、性别、肿瘤体积三个方面没有显著性差异。但两组患儿肿瘤转移情况、MYCN是否扩增、有无影像学定义危险因子三个方面具有显著差异。

1.2采用转录组学的方法筛选NB危险度分级潜在生物标志物

1.2.1整体实施策略包括以下几个方面：

1)总RNA的提取采用TRIzol试剂。

2)使用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Science，美国)评估RNA纯度和定量。

3)使用Agilent 2100生物分析仪(美国加利福尼亚州圣克拉拉的AgilentTechnologies)对RNA完整性进行评估；然后使用TruSeq Stranded mRNA L T Sample PrepKit(Illumina，San Diego，CA，USA)构建文库。

4)转录组测序和分析由OE生物技术有限公司(中国上海)进行；在Illumina HiSeqX Ten平台上对文库进行测序，并产生150bp的成对末端读数；每个样本产生了大约48.349M的原始读数；FASTQ格式的原始数据(原始读取)首先使用Trimomatic进行处理，并去除低质量的读取以获得干净的读取。然后为每个样本保留约47.459M清洁读数，以供后续分析。

5)使用HISAT2将干净的读数映射到人类基因组(GRCh38)；使用Cufflinks计算每个基因的每千碱基每百万个映射片段的外显子模型片段数(FPKM)，并通过HTSeq-count获得每个基因的读取计数。

6)使用DESeq(2012)R程序包进行差异表达分析；P值<0.05和|log₂(倍数变化)|>1作为差异表达的阈值；对差异表达基因进行系统聚类分析，结果如图1所示，图1为高危NB组与中低危NB组差异基因表达热图，从图1中可以得出高危NB组与中低危NB组差异基因表达情况，揭示不同组、不同样本中基因的表达模式，筛选获得NB危险度分级潜在生物标志物。1.2.2试剂及仪器

试剂盒：mirVana^TM miRNA ISOlation Kit，Ambion-1561仪器：冷冻离心机：ST16R，Thermo凝胶成像系统：Tanon 2500，天能公司紫外分光光度计：NanoDrop 2000，Thermo。

表2转录组测序使用的主要试剂

表3转录组测序使用的主要仪器及耗材

1.2.3具体试验步骤(1)NB组织总RNA的提取

a.取50mg的NB组织样品，加入600μL Lysis/Binding Buffer，均质化得到匀浆；加30μL miRNA Homogenate Additive，混匀；冰浴10min；

b.加入650μL酸酚-氯仿混合液；于13000rpm转速室温离心5min，取上清；在上清液中加1.25倍体积的100％乙醇；

c.将上述混合液加入到离心柱(上限为700μL)中，室温下，在13000rpm转速，离心30s，弃上清；

d.加350μL miRNA Wash Solution 1到离心柱中，在13000rpm转速，离心30s，弃上清，将离心柱放置到收集管中；

e.将10μL DNase I和70μL Buffer RDD QIAGEN(型号#79254)混合得到总体积80μL的混合液，并加入到离心柱中的膜上，室温放置15min；

f.加350μL miRNA Wash Solution 1到离心柱中，在13000rpm转速，离心30s，弃上清，将离心柱重新放置到收集管中；

g.使用500μL Wash Solution 2/3过柱两次，在13000rpm转速，离心30s，弃上清，将离心柱重新放置到收集管中；

h.然后再将空柱离心1min，将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加100μL于95℃预热过的5Elution Solution，并放置2min；室温下13000rpm转速离心20-30秒，收集管中的液体即为提取的总RNA，置于-70℃保存。

通过上述步骤得到的，NB组织提取总RNA结果如表4所示。

表4提取NB组织总RNA 提取质控结果

表4的结果表明，本发明提取的总RNA纯度高，完整度好，质量可靠。

(2)转录组建库

1)mRNA的纯化和片段化

a.取3μg总RNA和50μL RNA Purification Beads混匀；

b.在PCR仪上于65℃，反应5min，温度降至4℃时取出，室温放置5min；然后在磁力架上放置5min至上清澄清，弃上清；

c.从磁力架上取下，并加入200μL Beads Washing Buffer，混匀；再于磁力架上放置5min至上清澄清，弃上清；

d.再加入50μL Elution Buffer，混匀；

e.在PCR仪上于80℃，反应2min，温度降至25℃时取出；加入50μL Beads BindingBuffer，吹打6次，混匀，室温放置5min；再于磁力架上放置5min至上清澄清，弃上清；

f.从磁力架上取下，并加入200μL Beads Washing Buffer，吹打6次，混匀；再于磁力架上放置5min至上清澄清，弃上清；

g.从磁力架上取下，加入19.5μL Elute,Primer,Fragment Mix，吹打6次，混匀；

h.在PCR仪上于94℃，反应8min，温度降至4℃时取出，离心；

2)cDNA 1链的合成

a.在步骤1)得到的产物中加入8μL First Strand Synthesis Act D Mix和SuperScript II Reverse Transcriptase，吹打6次，混匀；

b.在PCR仪上于25℃，反应10min，再于42℃，反应15min，再于70℃，反应15min，降温至4℃时取出；

3)cDNA 2链的合成

a.在步骤1)得到的产物中加入5μL End Repair Control(End Repair Control是由2μL End Repair Control+98μL Resuspension Buffer得到的)；然后加入20μL SecondStrand Marking Master Mix，吹打6次，混匀；

b.在PCR仪上于16℃，反应60min，降温至4℃时取出；

4)一次纯化

a.在步骤2)或步骤3)得到的产物中加入90μL充分混匀的AMPure XP beads，吹打10次，混匀，室温放置15min；于磁力架上放置5min至上清透明；

b.用200μL吸头吸取135μL上清，弃去沉淀，置于PCR平板上；

c.将PCR平板一直置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％的乙醇，于室温反应30s，弃上清；并重复一次；然后室温放置15min，气干；

d.从磁力架上取下平板，加入17.5μL Resuspension Buffer，吹打10次，充分混匀；于室温放置2min，置于磁力架上5min至上清透明；

e.转移15μL上清至一块新的PCR平板中；

5)3’末端加A

a.在步骤4)得到的产物中加入2.5μL稀释的A-Tailing Control(通过1μL A-Tailing Control+99μL Resuspension Buffer进行稀释)；再加入12.5μL A-Tailing Mix，吹打10次，混匀；

b.在PCR仪上于37℃，反应30min，再于70℃，反应5min，降温至4℃时取出；

6)接头序列的连接

a.在步骤5)得到的产物中加入2.5μL稀释的Ligation Control(通过1μLLigation Control+99μL Resuspension Buffer进行稀释)；再加入2.5μL Ligation Mix；再加入2.5μL RNA Adapter Index，吹打10次，混匀；

b.在PCR仪上于30℃，反应10min后；从PCR仪上取下，加入5μL Stop LigationBuffer，吹打10次，混匀；

7)二次纯化

a.在步骤6)得到的产物中加入42μL充分混匀的AMPure XP beads，吹打10次，混匀，室温放置15min；于磁力架上放置15min至上清透明；

b.吸取79.5μL上清，弃去沉淀，置于PCR平板上；

c.将PCR平板一直置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％的乙醇，于室温反应30s，弃上清；重复一次；室温放置15min，气干；

d.，从磁力架上取下平板，加入52.5μL Resuspension Buffer，吹打10次，充分混匀；于室温反应2min，置于磁力架上5min至上清透明；

e.转移50μL上清至一块新的PCR板中，加入50μL充分混匀的AMPure XP beads，吹打10次，混匀，室温放置15min；置于磁力架上放置15min至上清透明；

f.吸取95μL上清，弃去沉淀，置于PCR平板上；

g.将PCR平板一直置于磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％的乙醇，于室温反应30s，弃上清；重复一次；室温放置15min，气干；

h.从磁力架上取下平板，加入22.5μL Resuspension Buffer，吹打10次，充分混匀；于室温反应2min，置于磁力架上5min至上清透明；

i.转移20μL上清至一块新的PCR板中；

8)DNA片段的富集

a.在步骤7)得到的产物中加入5μL PCR Primer Cocktail；再加入25μL PCRMaster Mix，混匀，离心；

b.然后PCR反应，PCR反应条件为：于98℃反应30s；反应循环数15cycles；再于98℃反应10s；再于60℃反应30s；再于72℃反应30s；再于72℃反应5min

9)三次纯化

a.在步骤8)得到的产物中加入50μL充分混匀的AMPure XP beads，吹打10次，混匀，室温放置15min；于磁力架上放置15min至上清透明；

b.吸取95μL上清，弃去沉淀，置于PCR平板上；

d.从磁力架上取下平板，加入32.5μL Resuspension Buffer，吹打10次，充分混匀；于室温反应2min，置于磁力架上5min至上清透明；

e.转移30μL上清至一块新的PCR板中；

10)文库质检

a.将样品加入Agilent 2100生物分析仪；根据结果确认文库的长度及质量。

将转录组学结果采用MetaboAnalyst分析后得到测试结果，包含热图、火山图、富集分析、路径分析和生物标记物。测试结果如图2、图3所示。图2为显示高危NB组与中低危NB组在肿瘤组织中的差异表达基因的火山图；图3为高危组与中低危组在肿瘤组织中的差异表达基因。

从图2、图3中可以得出，高危NB组与中低危NB组存在多个差异表达基因，其中高危NB组上调基因有1116个，下调基因有292个，说明高危NB与中低危NB转录组存在较大的差异，且多个基因显著上调或者下调。

本发明筛选获得24个潜在NB危险度分级标志物，结果如表5所示。

表5 24个候选生物标志物转录组学结果

实施例2基于RT-PCR验证转录组数据的可行性

2.1引物设计

根据表5中24个NB危险度分级潜在生物标志物，进行相应上游引物及下游引物设计，具体引物序列参见表6。

表6 NB危险度分级24个潜在生物标志物引物序列

2.2 RT-PCR反应

1)试剂盒仪器：使用HiScrip III All-in-One RT SuperMix试剂盒和AceQ qPCRSYBR Green Master Mix试剂盒(Vazyme，南京)分别进行逆转录(Reverse transcription，RT)及荧光定量PCR(qPCR)检测。

2)逆转录反应体系：5×qRT SuperMix 4μL，模板RNA 1pg-1μg，RNase-free ddH₂O补足20μL；反应条件：于50℃反应15min，再于85℃反应2min；

3)荧光定量PCR体系：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，0.4μL上游引物(10μM)、0.4μL下游引物(10μM)，模板1μL，RNase-free ddH₂O补足20μL；反应条件：预变性95℃反应5min，退火60℃反应30s，延伸95℃反应10s；样品重复扩增40个循环；以NAGK作为内参基因，基于公式2^-ΔΔCt测定靶基因mRNAs水平的倍增变化(测试方法参见Huang,R.,Liu,X.,Li,H.et al.Integrated analysis of transcriptomic and metabolomic profilingreveal the p53 associated pathways underlying the response to ionizingradiation in HBE cells.Cell and Bioscience 10,56(2020))，根据计算出来的结果与转录组学的结果进行比较，验证转录组学结果的正确性。

结果如图4所示，图4为RT-PCR中基因的表达趋势与转录组学结果一致性柱状图，图4中的数字编号从1至11分别代表FABP4、CXCL9、MFAP4、CD3、IL-10、CDK2、CIP2A、CHL1、TCF7L2、UNC5D、ERBB3。

从图4中的结果可以看出，经过与原始转录组学结果比对，RT-PCR检测的11种代表性差异表达基因相对于内参基因NAGK的相对表达量与转录组中这11种代表性差异表达基因相对于NAGK表达量的变化趋势一致，说明了本发明中RT-PCR检测结果与转库组检测结果一致，证明转录组结果的准确性。

实施例3基于logistic回归分析的NB血浆无创危险度分级方法

3.1基于logistic回归分析建立NB血浆无创危险度分级模型

采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)进行血浆循环DNA提取。具体步骤如下：

(1)取200μL NB血浆加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；加入200μl缓冲液GB(天根试剂盒DP304配套试剂)，充分混匀，于70℃放置10min，溶液变清亮，离心，以去除管盖内壁的水珠；

(2)加人200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，离心，以去除管盖内壁的水珠；

(3)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，于12000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(4)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(天根试剂盒DP304配套试剂，使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，于12000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(5)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(天根试剂盒DP304配套试剂，使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，于12,000rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复此步骤；将吸附柱CB3放回收集管中，于12000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液；将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(6)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μlddH₂O进行洗脱，室温放置2-5min，于12000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

3.2 qPCR检测血浆游离的24种NB危险度分级潜在生物标志物

基于AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(Vazyme，南京)对NB血浆游离的24种潜在生物标志物进行检测。

所使用的引物序列如表6所示。

荧光定量PCR体系为：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，0.4μL上游引物(10μM)、0.4μL下游引物(10μM)，模板1μL，RNase-free ddH₂O补足20μL；反应条件为：预变性95℃反应5min，退火60℃反应30s，延伸95℃反应10s；样品重复扩增40个循环；以NAGK作为内参基因，基于公式2-ΔΔCt测定24种潜在生物标志物水平相对含量。根据NB血浆中24个潜在生物标志物血浆游离DNA水平基于SPSS计算各个基因的受试者工作特征曲线(ROC)曲线下面积，结果如表7所示。

表7 24种潜在生物标志物曲线下面积、灵敏度、特异度

从表7中的结果得知，S100A9，CDK2，UNC5D三个基因的曲线下面积最优，但仍不够理想，因此我们联合这三个基因进行下一步的分析。

在SPSS软件中采用Logistic逐步回归分析法基于这三个基因建立NB血浆危险度分级模型：Y＝1.495-0.510X1(S100A9)-0.713X2(CDK2)+0.647X3(UNC5D)，其中Y代表诊断效能，[S100A9]、[CDK2]和[UNC5D]分别代表血浆中S100A9，CDK2，UNC5D的相对表达量(内参基因为NAGK)。

将建立的NB危险度分级模型通过受试者工作特征曲线进行分析，结果如图5所示。图5A为建立的NB危险度分级模型对NB高危、中低危的危险度分级灵敏度及特异性结果，可以看出，当Y的截断值为0.025时，灵敏度为0.80，特异度为0.80，即建立的NB危险度分级模型NB危险度分级的灵敏度及特异性均为80％。图5B为基于三个血浆基因(S100A9、CDK2、UNC5D)预测高危NB的受试者工作特征曲线的AUC值，可以看出，联合后受试者工作特征曲线AUC＝0.836。

上述实施例为本发明实施方式的举例说明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一组标志物在制备神经母细胞瘤危险度分级药剂中的应用，其特征在于，所述标志物为FABP4、HBB、MGST1、S100A9、CXCL9、SERPINE1、MFAP4、HMOX1、CD36、CIP2A、UBE2C、KNTC1、ALK、IL10、ALPL、IGF2、NXN、ITGA1、CDK2、CHL1、TCF7L2、UNC5D、ERBB3、CGA中的一种或两种以上的标志物组合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述标志物为UNC5D、S100A9、CDK2中的一种或两种以上的标志物组合。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测所述标志物表达量的物质在制备神经母细胞瘤危险度分级产品中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，检测所述标志物表达量的物质为引物或探针。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用荧光定量检测所述标志物的引物组合如下表所示：

标志物上游引物下游引物 FABP4 AACCTTAGATGGGGGTGTCC GTAGCTAGAAGATACTCACCACC HBB CTGCTGGTGGTCTACCCTTG AGGCCATCACTAAAGGCACC MGST1 TATGCCATCGTTTGGCACAG TCCAAAATGAAAGAAAGTTTCCGTG S100A9 CCAAGACGCAGCGAGTGTC TTTACTGTGTGTCTCCCTCCACTG CXCL9 GCAGTGCTACACTGAAGAATGG TTGATCTTCCTTTTCACCAACCTG SERPINE1 AATGCCCTCTACTTCAACGG AGGGGCTCTTGGACTTACTATAG MFAP4 CAGGTATAACCCGCTGTTAGC TTGTTTGGAGCCAGCTGTGG HMOX1 TTTTAGCTCTTTGAGGAGTTGCAG GAGATACTACAGTCAGACAGCC CD36 GCTATGCCGTGGAAATCCTG AAAAGCATTCTGCTCACCAAC UBE2C ACCTTCAAAGGCTCCCTCAAAC GGGCAGAAACAGAAGTGGGTTG IL10 AATAAGGTGAGCTTGGATGGTGG AAGAATGGGGCCTATTGAGTCC ALPL ACGGATGCTTTCCTCTTGGG ATTTTACCCTCGGTGGCTGG IGF2 GCTTCCCCCTAACACACCAAG GGGGACCAATTTGTGAGGAGG NXN ACTCAGGCTCTGGTGCATTC GTCCCGTGGGTATTTCCCTG CDK2 GTCTTGGCCAGCCAACTCTG AAAGGGTGGTGGAGGCTAAC CGA TCAACCGCCCTGAACACATC TGAGTAAAAGCCTGTCTCAGTTC CIP2A GGTGAGCATGAATAAGGGGAC TGGCTCATCCCAGATGGTTG KNTC1 GGTTTAGTGTTCTCCCGCC GCTACTTCGTCCTGAACCC ALK AGAAGAAGGCGTCGGAAGTG TAAATCCCGGCACACTCAGG ITGA1 TCTCTGGAAAGCATATACAGTAGTC TGCAAGCACATGATAGGAAATGG CHL1 GTTTGGTACATTTAGGGTGGG AAGAAACCCTGGTCAAAGC TCF7L2 TTCGCCACGTTCTTGCTTTC ACGCAAAGGAAAGTTCTTCGG UNC5D TGCCTTACTATAGCTTTTTATCCC TGACAGCAGATGGGCTACTTTG ERBB3 TCAAAGGTGCCTGACTCTTCC CCTGGGGGTTGAGAAGAAAGG

6.一种包括权利要求1所述标志物的神经母细胞瘤危险度分级产品。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品具体为试剂、试剂盒或生物芯片。