CN115975862B

CN115975862B - 韩国芽孢八叠球菌jz-2及其应用

Info

Publication number: CN115975862B
Application number: CN202211322405.8A
Authority: CN
Inventors: 张鹏; 樊霆; 郭苏影; 张伟; 刘小强; 杨利源; 盛花泽宇; 徐文艳; 马萌遥; 鲁洪娟; 司友斌; 张震; 陈海燕; 叶文玲
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2022-10-26
Filing date: 2022-10-26
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2042-10-26
Also published as: CN115975862A

Abstract

本发明提供一株韩国芽孢八叠球菌JZ‑2及其应用。本发明菌株JZ‑2具有较高的脲酶活性，水解尿素的同时能够提高体系pH并产生大量CO₃ ^2‑，对重金属具有一定的固定效果。通过将菌株制备成菌剂，能够增强菌株对恶劣环境的抵抗能力，菌剂与尿素等营养物质按比例投加到重金属污染土壤中，可有效降低可交换态重金属的含量，提高土壤重金属修复效果。该方法成本低，效率高，无二次污染，在土壤重金属稳定化修复方面具有广阔的应用前景。

Description

韩国芽孢八叠球菌JZ-2及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及固化重金属技术领域，具体地说，涉及一株韩国芽孢八叠球菌JZ-2及其应用。

背景技术

由于人类活动导致重金属通过各种途径进入环境，造成土壤、水体重金属污染日益严重。研究显示，1972-2017年，世界5大洲168条河流和71个湖泊中12种重金属浓度普遍提高，超出世界卫生组织制定的阈值标准。土壤重金属污染不仅破坏生态环境，还会导致种植的农副产品重金属超标。因此，修复重金属污染土壤迫在眉睫。

传统的土壤重金属污染修复主要有物理和化学法，但因其高成本、高能耗、低效率、会影响土壤原有结构和功能，易造成二次污染等缺点不适合大面积应用。植物修复能安全有效去除土壤重金属，但植物自身生长受自然环境因素影响较大，且深层污染难修复。与上述方法相比，微生物修复具有环境友好、适应快且可边生产边修复等优点，其中以微生物诱导碳酸盐沉淀（microbial induced carbonate precipitation，MICP）为核心的生物矿化技术，因其环境友好性已成为当前国内外研究的热点。

微生物诱导碳酸盐沉淀主要通过微生物分泌脲酶水解尿素，产生CO₃ ^2-并提高pH，碳酸根能够与重金属离子结合形成碳酸盐，从而降低重金属有效性，另一方面pH的升高也有利于重金属的稳定。在矿化过程中，微生物的脲酶活性对重金属的修复效果起到决定性作用。然而在实际土壤修复过程中，重金属的毒性以及土壤复杂环境对微生物的生长存活产生了严重的危害，如果菌株迅速失活，重金属往往不能得到有效固定。为此，筛选出重金属耐受性高的菌株，同时找到一种能够保护菌株免受环境胁迫的固定化方法，将极大的推进MICP在重金属污染土壤修复中的应用。。

发明内容

本发明的目的是提供一株韩国芽孢八叠球菌JZ-2及其应用。

本发明的另一目的是提供重金属污染土壤修复的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株碳酸盐矿化菌株-韩国芽孢八叠球菌(Sporosarcina koreensis)JZ-2，菌株JZ-2现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No. 25437，保藏日期2022年8月3日。

第二方面，本发明提供含有所述韩国芽孢八叠球菌JZ-2菌剂。

第三方面，本发明提供所述韩国芽孢八叠球菌JZ-2或含有所述韩国芽孢八叠球菌JZ-2菌剂在重金属污染环境修复中的应用。

第四方面，本发明提供重金属污染土壤修复的方法，包括以下步骤：

（1）在液体培养基中培养权利要求1所述韩国芽孢八叠球菌JZ-2，培养完成后离心收集菌体，菌体经清洗重悬于0.8%-1.0%氯化钠溶液中，得到菌悬液；

（2）将步骤（1）所得菌悬液与海藻酸钠溶液混合，用注射器将混合液滴加到氯化钙溶液中，置于4℃冰箱固定化后，用PBS缓冲液冲洗并干燥得到固定化菌剂；

（3）将步骤（2）所得固定化菌剂与营养液同时施用于重金属污染土壤。

进一步地，步骤（1）中，所述液体培养基的成分为：10 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5g/L氯化钠和20 g/L尿素，pH7.0。

进一步地，步骤（2）中，将所述菌悬液与所述海藻酸钠溶液混合后，所得混合液中海藻酸钠的浓度为2%-4%，细菌浓度为OD₆₀₀= 0.8-1.2。

所述氯化钙溶液的浓度为1%-3%。

进一步地，步骤（3）中，所述营养液的成分为：10 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L氯化钠、20 g/L尿素和5 g/L氯化钙。

进一步地，步骤（3）中，所述固定化菌剂的施用量为土壤质量的1.5%-2.5%，所述营养液的施用量为土壤质量的15%-20%。

本发明中，所述重金属包括但不限于Cd、Pb。

进一步地，所述重金属污染土壤中Cd含量不高于10 mg/kg，和/或Pb含量不高于500 mg/kg。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（一）本发明从污染土壤中筛选出对重金属Cd和Pb具有耐受性，脲酶活性高的碳酸盐矿化菌，能够水解尿素并产生大量CO₃ ^2-，为重金属污染土壤的修复提供一种很好的微生物菌株资源。

（二）使用3%海藻酸钠和2%氯化钙制备的固定化菌剂能够大大提高菌株的存活率，抵抗污染土壤复杂环境的影响，增强了重金属的修复效果，同时固定化菌剂方便保存，相比于菌悬液能够存放更久。

（三）经过21天的修复，土壤可交换态Cd含量由61.9%降低至5.9%，可交换态Pb含量由46.7%降低至2.8%，碳酸盐结合态Cd含量由16.2%升高至65.1%，碳酸盐结合态Pb含量由21.3%提高至62%，土壤Cd和Pb的含量大幅降低，同时不会产生二次污染，菌株JZ-2在土壤重金属修复中的应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明韩国芽孢八叠球菌JZ-2的电镜图（A）和革兰氏染色（B）结果。

图2为本发明较佳实施例中韩国芽孢八叠球菌JZ-2的生长代谢特性。

图3为本发明韩国芽孢八叠球菌JZ-2在平板中的Cd和Pb抗性。

图4为本发明较佳实施例中制备的海藻酸钠菌剂的尺寸（A和B）和电镜图（C和D）。

图5为本发明较佳实施例中不同处理下韩国芽孢八叠球菌JZ-2修复21天后土壤各形态Cd和Pb含量。

实施方式

本发明提供一种对Cd和Pb具有耐受性的菌株，并利用该菌株进行重金属Cd和Pb污染土壤的修复。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一株碳酸盐矿化菌株，韩国芽孢八叠球菌Sporosarcina koreensisJZ-2，保藏编号CGMCC No. 25437。

进一步地，所述碳酸盐矿化菌菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，本发明提供所述碳酸盐矿化菌在修复土壤重金属中的应用，包括如下步骤:

(1)将所述韩国芽孢八叠球菌Sporosarcina koreensisJZ-2，在液体培养基中培养24小时，培养完成后离心冲洗并重新悬于0.9%的氯化钠溶液中，得到高浓度菌悬液。

(2)将步骤(1)中的高浓度菌悬液加入海藻酸钠溶液中混合均匀，使用无菌注射器缓慢滴入氯化钙溶液中，处理后得到固定化菌剂。

(3)将步骤(2)中固定化菌剂与营养液同时施用于重金属污染土壤，搅拌均匀，在室温下修复21天。

进一步地，步骤(1)中，液体培养基的成分为：10 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L氯化钠和20 g/L尿素，pH 7.0。

进一步地，步骤(2)中，混合后海藻酸钠溶液的浓度为3%，细菌浓度为OD₆₀₀= 1。

进一步地，步骤(2)中，氯化钙浓度为2%。

进一步地，步骤(2)中，处理是指将海藻酸钠菌剂置于氯化钙溶液中在4℃冰箱稳定2小时，随后用PBS缓冲液冲洗并干燥。

进一步地，步骤(3)中，营养液的成分为：10 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L氯化钠、20 g/L尿素和5 g/L氯化钙。

进一步地，步骤(3)中，重金属污染土壤为Cd含量不高于10 mg/kg或Pb含量不高于500 mg/kg的污染土。

进一步地，步骤(3)中，固定化菌剂的施用量为土壤质量的2%，加入营养液的施用量为土壤质量的20%。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

土壤样品来源于河南济源一处受Cd污染的农田(N 35°5′2″, E 112°31′8″)。

取1 g土壤样品添加到10 ml无菌水中充分震荡，30分钟后取土壤浸出液进行梯度稀释，涂布于选择培养基上，30℃恒温培养，挑选周围培养基变红的单个菌落并多次纯化，直至菌落的形态稳定。

选择培养基的成分为：10 g/L蛋白胨、5 g/L氯化钠、3 g/L牛肉膏、15 g/L琼脂、20g/L尿素和0.01 g/L酚酞。

将筛选到的JZ-2菌株在选择培养基上培养2天后进行革兰氏染色，通过显微镜观察到细胞为短杆状，革兰氏阳性菌，扫描电镜显示其直径约为0.4μm。如图1（A和B）所示。

使用16s rDNA测序技术获得分离菌株的16s rDNA碱基序列，如SEQ ID NO:1所示。将获得的序列通过NCBI数据库进行比对，最终确定该菌株与韩国芽孢八叠球菌(Sporosarcina koreensis)的同源性超过99%，命名为Sporosarcina koreensisJZ-2。

配制50 ml液体培养基，于超净工作台中接种菌株后，置于30℃、120 r/min的摇床中培养48小时，期间每6小时取一次样。使用对二甲氨基苯甲醛显色法测定尿素浓度，使用酸碱滴定法测定碳酸根浓度，使用纳氏试剂测定氨浓度，结果如图2所示。

结果显示，尿素浓度在前18小时内迅速降低，在初始添加20 g/L尿素的情况下，48小时后菌株JZ-2水解了93.6 %的尿素。同时碳酸根和氨浓度则快速升高，最高可达16 g/L和8.3 g/L，表明分离菌JZ-2具有较强的尿素水解能力。

使用Cd(NO₃)₂和Pb(NO₃)₂配置Cd浓度为0、5、10、15 mg/L，Pb浓度为0、200、400、600mg/L的NBU琼脂培养基，将浓度为OD₆₀₀= 1的菌悬液稀释10⁵倍后，吸取100μL使用玻璃涂布棒均匀涂布在NUB琼脂培养基上，1-2天后观察细菌能否正常生长。

结果如图3所示，重金属显著抑制细菌的生长，在平板中韩国芽孢八叠球菌JZ-2的最大Cd抗性为10 mg/L，最大Pb抗性为400 mg/L。

以1%的接菌量在50 mL高温灭菌的液体培养基中接种JZ-2，并调节温度为20、30、40℃，使用0.1 mol/L的NaOH和HCl调节初始pH为5、6、7、8、9、10，在120 r/min的摇床中培养48小时，观察细菌生长情况。结果表明JZ-2在20-40℃和pH6-10条件下均能正常生长(表1)。

表1 不同温度和pH下JZ-2的生长情况

pH	5	6	7	8	9	10
							能否正常生长	-	+	+	+	+	+
温度（℃）	20	30	40
							能否正常生长	+	+	+

将筛选的韩国芽孢八叠球菌JZ-2接种到液体培养基，培养24小时后取出置于5000r/min的离心机中离心并弃去上清液，菌株用去离子水冲洗后，重新悬浮于0.9%氯化钠溶液中得到高浓度菌悬液。

配制海藻酸钠溶液和1%、2%、3%氯化钙溶液加热煮沸，灭菌后置于超净工作台中冷却至室温，向海藻酸钠溶液中加入高浓度菌悬液混合均匀，使最终溶液的海藻酸钠含量为2%、3%和4%，细菌浓度为OD₆₀₀= 1。随后使用灭菌注射器吸取制得的海藻酸钠溶液，逐滴缓慢滴入氯化钙溶液中形成海藻酸钠微球，完成后，将氯化钙连同制得的海藻酸钠微球放在4℃冰箱中稳定2小时。随后将海藻酸钠微球取出，使用PBS缓冲液冲洗3遍，用滤纸吸干表面残留液体即可得到海藻酸钠固定化菌剂。

分别将不同浓度的两种溶液混合，通过形成微球的形态来判断制备菌剂最适的海藻酸钠和氯化钙浓度。结果见表2。

表2 海藻酸钠和氯化钙浓度对微球形态的影响

海藻酸钠浓度/ (%)	氯化钙浓度/ (%)	微球形态	稳定性
				2	1	球形，直径2.7mm	易破碎
3	1	球形，直径3.2mm	易破碎
				4	1	不规则球状	不易破碎
2	2	球形，直径3mm	不易破碎
				3	2	球形，直径3.5mm	不易破碎
4	2	不规则球状	不易破碎
				2	3	球形，直径3mm	不易破碎
3	3	球形，直径3.4mm	不易破碎
				4	3	不规则球状	不易破碎

通过优化实验可知，当海藻酸钠浓度≥4%时，溶液粘性较大，所得菌剂不能形成规则球形；而当氯化钙浓度≤1%时，菌剂的稳定性较差，容易形变破碎。因此，制备菌剂最适的海藻酸钠浓度为2%-3%，氯化钙浓度也为2%-3%。

测量制得的海藻酸钠菌剂的尺寸并使用扫描电镜观察其形态，结果如图4所示，海藻酸钠菌剂为乳白色球形，直径约为3.5 mm (图4，A和B)，表面被海藻酸钙覆盖，微观下存在大量褶皱(图4C)。其内部为多孔结构，可以观察到分离菌菌株被包裹其中(图4D)。

从安徽农业大学农萃园获得实验用土，使用Cd(NO₃)₂和Pb(NO₃)₂分别配制Cd浓度为10 mg/kg和Pb浓度为500 mg/kg的污染土，置于室温下陈化直至土壤干燥。

取50g干燥土壤于烧杯中，121℃高压灭菌备用。两种重金属污染土壤分别设置对照组、无菌的海藻酸钠、菌悬液和海藻酸钠菌剂4个实验组，以2%的接菌量等量加入菌悬液和海藻酸钠菌剂。随后向每个烧杯中添加10 ml营养液搅拌均匀，使土壤的含水率为20%，每天称重计算液体损耗，添加等量的无菌水使整个实验周期中水土比恒定。将土样置于室温条件下修复21天。

21天后取样，使用五步提取法提取不同形态重金属，具体方法如下：

（1）可交换态Cd和Pb：1g土中添加8 ml 1 mol/L的氯化镁，室温下震荡(200 r/min)1小时，4000 r/min离心10min取上清液。

（2）碳酸盐结合态Cd和Pb：在(1)剩余土样中添加1 mol/L乙酸钠，醋酸调节pH为5，室温下震荡8小时，4000 r/min离心10min取上清液。

（3）铁锰氧化物结合态Cd和Pb：在(2)中剩余土样中添加20 ml 0.04 mol/L的盐酸羟胺溶液，在96±3℃水浴中震荡4小时，4000 r/min离心10min取上清液。盐酸羟胺溶液为0.04 mol盐酸羟胺溶于25%醋酸溶液中制得。

（4）有机质结合态Cd和Pb：在(3)中剩余土样中添加3 ml 0.02 mol/L硝酸和5 ml30%过氧化氢，调节pH为2，85±2℃水浴震荡3小时。取出后冷却至25±1℃，加入5 ml 3.2mol/L乙酸铵的20%硝酸溶液，稀释至20 ml，震荡30分钟后4000 r/min离心10min取上清液。

（5）残渣态Cd和Pb：使用王水对(4)中残渣进行消解，消解后的残渣经针头过滤器过滤后定容至25ml。

修复21d后土壤重金属形态如图5所示，添加海藻酸钠菌剂后土壤可交换态Cd含量由初始的61.9%降低到5.9%，降低了56%，可交换态Pb含量由初始的46.7%降低到2.8%，降低了43.9%。而添加菌悬液的修复组，可交换态Cd和可交换态Pb分别降低43.9%和36.7%，表明固定化菌剂对土壤Cd和Pb的修复效果优于菌悬液。同时，修复后土壤碳酸盐结合态Cd和Pb含量显著增加，表明Sporosarcina koreensisJZ-2通过将重金属诱导矿化为碳酸盐形态（图5），从而大大降低重金属的有效性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.韩国芽孢八叠球菌(Sporosarcina koreensis) JZ-2，其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 25437。

2.含有权利要求1所述韩国芽孢八叠球菌JZ-2的菌剂。

3.权利要求1所述韩国芽孢八叠球菌JZ-2或权利要求2所述JZ-2菌剂在重金属污染环境修复中的应用，所述重金属为Cd和/或Pb。

4.重金属污染土壤修复的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）将步骤（2）所得固定化菌剂与营养液同时施用于重金属污染土壤，

所述重金属为Cd和/或Pb。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述液体培养基的成分为：10g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L氯化钠和20 g/L尿素，pH7.0。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，将所述菌悬液与所述海藻酸钠溶液混合后，所得混合液中海藻酸钠的浓度为2%-4%，细菌浓度为OD₆₀₀ = 0.8-1.2；

所述氯化钙溶液的浓度为1%-3%。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述营养液的成分为：10 g/L蛋白胨、3 g/L牛肉膏、5 g/L氯化钠、20 g/L尿素和5 g/L氯化钙。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述固定化菌剂的施用量为土壤质量的1.5%-2.5%，所述营养液的施用量为土壤质量的15%-25%。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重金属污染土壤中Cd含量为不高于10mg/kg，和/或Pb含量不高于500 mg/kg。