CN103173376A

CN103173376A - 利用产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法

Info

Publication number: CN103173376A
Application number: CN2012104644808A
Authority: CN
Inventors: 程晓辉; 化彬
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2012-11-16
Filing date: 2012-11-16
Publication date: 2013-06-26
Anticipated expiration: 2032-11-16
Also published as: CN103173376B

Abstract

产脲酶微生物：Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31以及Bacillus lentus UR41已于2012年3月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.5916、CGMCC No.5915、CGMCC No.5913、CGMCC No.5914，利用产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法，将上述四种微生物及微生物Sporosarcina pasteurii和Terrabacter tumescens发酵培养基中发酵培养得到菌液，向砂颗粒体系多批次灌入菌液、固定液、胶凝液，形成强度最高可达55MPa的微生物砂浆，该材料力学性能优于水泥基材料：劈裂抗拉强度较同等强度水泥石灰材料高，刚度和水泥石灰混合砂浆相近，但远小于混凝土的刚度，耐受疲劳荷载和循环荷载能力高于水泥基材料；人工砂岩为无机材料，不会像环氧树脂等有机材料一样容易老化。

Description

利用产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法

技术领域

本发明属于高强微生物砂浆制备领域，具体涉及利用产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法。

背景技术

灌浆法是加固砌体结构，特别是历史久远的文物建筑结构加固常用的方法，而石灰、水泥和环氧树脂是三种常用的灌浆材料。其中石灰基灌浆材料作为传统砌体结构的勾缝材料，其与被加固结构的兼容性最好，但是由于石灰基灌浆材料的硬化时间长，硬化后强度较低，所以也无法起到很好的加固效果。对于普通的水泥基灌浆材料，由于需要保证灌浆密实，需要尽可能提高灌浆料的流动性，所以浆液中砂的含量往往远低于普通砌筑砂浆，这使得硬化过程不可避免地会产生收缩开裂现象。同时，水泥基灌浆材料硬化后其刚度、强度与被加固结构往往不匹配，容易产生未加固区域的二次破坏。再者，水泥基灌浆材料的高碱性也会使原始砌体结构产生更容易产生酥碱破坏。以上种种不足使水泥基灌浆材料加固砌体结构的使用受到限制。而环氧树脂等有机胶，虽然有出色的力学性能和较高可灌性，但是由于有机材料应力、应变性能和导热系数等基本材料性质都与原结构相差较大，同时加固后材料体本身透水、透气性较低，而且有机材料容易老化，正如威尼斯条约里所陈述的观点一样：现代化学材料不属于珍贵的历史建筑，环氧树脂等有机材料不适用于大规模的砌体结构加固。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供利用产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法，采用本发明的微生物砂浆，可以在1-2个星期内到达需要的强度，同时结构延性较好，透水、透气性保持较高。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

产脲酶微生物：圆孢芽孢八叠球菌Sporosarcina antarctica UR53、韩国芽孢八叠球菌Sporosarcina koreensis UR47、芽孢八叠球菌Sporosarcina sp.UR31以及延缓芽孢杆菌Bacillus lentus UR41已于2012年3月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.5916、CGMCC No.5915、CGMCC No.5913、CGMCC No.5914，该保藏中心简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

所述的产脲酶微生物：Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31以及Bacillus lentus UR41均呈椭圆杆状，有芽孢，无荚膜，革兰氏阳性。在NH₄-YE即酵母提取物20g/L，硫酸铵10g/L平板上，菌落呈圆形，表面湿润光滑，边缘整齐，菌落大小为1-2mm，菌落呈淡黄色，该菌在4℃-37℃的培养基温度及pH7-9.5的范围下均能生长。

利用产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法，包括如下步骤：

步骤1：将微生物Sporosarcina pasteurii、Terrabacter tumescens、Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcinakoreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31以及Bacillus lentus UR41单个菌落分别在25℃-37℃条件下在发酵培养基中发酵培养12-60小时得到六种菌液；

步骤2：对结构空鼓进行闭水处理，灌入粒径为300-450微米粒径的砂粒，封闭整个空腔，预留进出浆口；

步骤3：以每立方米空鼓体积每分钟灌入29L菌液的速度把步骤1所得六种菌液由进浆口灌入空鼓，直至出浆口流出呈黄色的菌液；

步骤4：以每立方米空鼓体积每分钟灌入29L的速度灌入0.05mol/L氯化钙固定液，所需体积为空腔体积的1/10；

步骤5：以每立方米空鼓体积每分钟灌入4L反应溶液的速度灌入等摩尔浓度的尿素和氯化钙混合溶液48h,反应液浓度为0.5-1mol/L；

步骤6：以每立方米空鼓体积每分钟灌入29L的速度灌入0.05mol/L氯化钙固定液，所需体积为空腔体积的1/10；

步骤7：重复步骤3至步骤6过程1-5个循环。

步骤1所述微生物Sporosarcina pasteurii来自于美国模式培养物集存库（American type culture collection），编号为ATCC 11859；所述微生物Terrabacter tumescens来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为AS.1.2690。

步骤1所述发酵培养基包括酵母提取物20g/L，硫酸铵10g/L，pH为9。

本发明和现有技术相比，具有如下优点：

1、从已有产脲酶菌株、土样和水样中筛选产脲酶的微生物，并对未知细菌进行分子鉴定，为获得产脲酶能力强，原位保持脲酶活性高微生物菌株提供候选资源；

2、反应溶液中尿素在先期灌入的微生物所产生的脲酶的作用下，分解为铵根和二氧化碳，同时使细菌周围pH升高，促使生成碳酸钙沉淀，胶凝空鼓中填充的砂粒，形成整体强度，随着灌浆循环次数的增加，砂粒体系内的碳酸钙含量增加，强度随之增加，并且强度是可以控制的；

3、经过微生物灌浆加固后的结构空鼓内形成的人工砂岩材料力学性能优于水泥基材料：劈裂抗拉强度较同等强度水泥石灰材料高，刚度和水泥石灰混合砂浆相近，但远小于混凝土的刚度，耐受疲劳荷载和循环荷载能力高于水泥基材料；人工砂岩为无机材料，不会像环氧树脂等有机材料一样容易老化；

3、所用的营养液的成本低；

4、本发明中所利用微生物为自然环境（土壤）中本身存在的微生物或其中某种微生物的培养物，营养物质也为天然物质，不会对环境造成二次污染。

附图说明

图1为依据16S rDNA序列构建的产脲酶菌株系统发育树。

图2为培养菌株的生物量（用OD₆₀₀值表示）及脲酶活性，横坐标为不同种类的产脲酶菌株，纵坐标为生物量及脲酶活性。

图3为微生物灌浆装置示意图。

图4为材料干密度与单轴抗压强度、劈裂抗拉强度的关系图。

图5为单轴抗压应力应变全曲线。

图6为微生物砂浆在重复荷载下的应力-应变关系、破坏形态示意图，其中图6a和6b达到峰值前分别进过了12和10个周期，图6c则是8个周期。

图7为微生物砂浆压汞实验结果示意图。

图8为微生物砂浆形成的胶凝体系样品SEM扫描图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。实施例：

产脲酶具有诱导生成人工砂岩能力菌株的分离筛选

1、样品采集

Sporosarcina pasteurii来自于美国模式培养物集存库（American type culture collection），编号为ATCC11859，Terrabacter tumescens来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为AS.1.2690。

2、产脲酶菌株的分离和筛选

产脲酶菌株分离自清华大学花圃采集土壤样品。

细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性，显红色。本实验利用这一特性，将试验样品先在37°C、5M高浓度尿素条件下富集培养24h后，杀死不能耐受和利用高浓度尿素的各种微生物营养体细胞，再将处理后的培养液进行梯度稀释，涂布脲酶筛选培养平板，37°C下培养，挑取使培养基颜色变红的菌株，划线分离单菌落，获得的微生物为产脲酶微生物，并利用16S rDNA方法进行鉴定，分别命名为Sporosarcina antarctica UR53，Sporosarcina koreensis UR47,Sporosarcina sp.UR31，Bacilluslentus UR41；参照图1，图1为依据16S rDNA序列构建的产脲酶菌株系统发育树。

步骤1：配制发酵培养基：酵母提取物20g/L，硫酸铵10g/L，pH为7-9.5，将100ml发酵培养基装入500ml培养瓶中灭菌，分别从平板中挑取单个菌落Sporosarcina pasteurii、Terrabactertumescens、Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensisUR47、Sporosarcina sp.UR31以及Bacillus lentus UR41分别接种于发酵培养基中，在30℃温度下培养，转速为150rpm-250rpm。培养16小时后收集菌液，检测六种菌液的生物量（用OD₆₀₀值表示）和脲酶活性，检测结果如图2所示；

步骤2：对结构空鼓进行闭水处理，灌入粒径为300-450微米粒径的砂粒，封闭整个空腔，预留进出浆口，如图3所示:；

步骤3：以每立方米空鼓体积每分钟灌入29L菌液的速度把步骤1所得六种菌液从进浆口:灌入空鼓，直至从出浆口流出黄色的菌液；

步骤4：以每立方米空鼓体积每分钟灌入29L的速度灌入0.05mol/L氯化钙固定液，所需体积为空腔体积的1/10:；

步骤5：以每立方米空鼓体积每分钟灌入4L反应溶液的速度灌入等摩尔浓度尿素和氯化钙混合溶液48h,反应液浓度根据不同强度等级选择0.5-1mol/L不等:；

步骤7：根据加固强度等级要求不同，重复步骤3至步骤6过程1-5个循环。

微生物加固强度等级

利用灌浆循环次数和营养盐浓度，控制生成微生物砂浆的强度从单轴抗压强度2MPa到55MPa不等，如图4所示。

对所形成微生物砂浆的分析

1、力学性能分析

对这些试样进行单轴抗压测试和劈裂抗拉测试。正如水泥砂浆强度和其水灰比密切相关一样，微生物灌浆形成材料的强度与体系内碳酸钙的含量有关，我们在灌浆开始前准备的砂岩，其初始密度是相同的，所以用灌浆结束后的去除其中可溶物烘干的干密度值，可以表示各样品的碳酸钙含量，其与单轴抗压强度和劈裂抗拉的关系如图4所示。可以看到，材料的单轴抗压强度和劈裂抗拉强度都是随其干密度提高而增大，而其干密度可以由灌浆配方与次数控制。

对其中部分样品的单轴抗压应力应变全曲线进行分析（如图5所示），可知除UCS强度较低的HSS1B外，微生物灌浆材料的弹性段刚度相差不大，表现在图5中各应力应变全曲线初始段基本重合，且与水泥石灰混合砂浆也基本重合。材料在破坏前，一般都会出现一个小峰，此时对应材料的可见裂缝的出现，此时的应力值为强度的65％-90％不等。然而，可见裂缝的出现并没有显著降低材料的刚度和抗载荷能力，随着加载的继续，材料应力、应变继续增加，直至到达峰值。峰后段表现为强度越大的材料，强度退化越快，表现为这种材料高强时脆性越明显。这种材料如果应用于结构灌浆加固，峰前开裂而不显著降低材料强度、刚度，可根据开裂强度确定正常使用应力，而开裂后的强度储备，则是必要的安全冗余。

为研究微生物砂浆在重复荷载下的应力-应变关系、破坏形态，并与混合砂浆在相同条件下的性能做比较，其结果如图6所示。对于强度相近的微生物砂浆和混合砂浆在相同过程的重复荷载作用下，存在以下主要区别：

1.达到峰值前，微生物砂浆较混合砂浆能耐受的循环荷载周期数较多（如图6a和6b达到峰值前分别进过了12和10个周期，如图6c则是8个周期），这表明微生物灌浆材料抵抗重复荷载能力较混合砂浆高；

2.到达峰值后，微生物砂浆在峰后3-4个荷载周期内仍然能有一定承载能力，在这个阶段的加载段，应力随应变增加而增加，而此时混合砂浆加载段部分与包络线重合，表现为加载段部分时间应变增加时应力持续下降。这说明微生物材料较混合砂浆在峰后残余强度方面优于混合砂浆；

3.在样品破坏形貌上，微生物砂浆峰值后圆柱体试样逐渐开裂成一个个分开的短柱，如图6a和6b，短柱在很长时间内并不断裂，而混合砂浆峰值后开裂成薄片如图6c，且很快薄片从中间折断。这可以解释微生物材料能在峰值后继续耐受3-4个循环的荷载，而混合砂浆直接进入不可逆的劣化阶段，即在峰值后的每个应力-应变循环中，在应变控制段，应力达到包络线后，应变仍然增加，而此次应力快速降低。

4.进行测试的微生物砂浆样品重复荷载抗压极限强度较混和砂浆的低。

2、孔隙结构和微观形貌分析

压汞实验结果如图7所示。微生物灌浆过程使原来松散堆积的砂颗粒间的孔隙慢慢变小，孔隙率急剧降低。2个批次的微生物灌浆后，材料中孔隙直径基本都小于100μm。随着灌浆批次的进一步增加，材料中孔隙直径进一步减小，但是孔径减小幅度降低，经过7个批次灌浆后，仍存在不少孔径在7μm左右的孔隙，总的来讲，微生物灌浆材料的孔径主要分布在10-100μm范围内，而混合砂浆微孔主要分布0.01-1μm范围内，相对于微生物灌浆材料的孔径要小得多。微生物砂浆中这种相对较大孔隙给砌体结构内外水汽平衡提供了必要的通道，同时却能有效阻断毛细水入侵，有利于加固后砌体结构耐久性的提高。

对微生物灌浆形成的胶凝体系样品进行SEM扫描，其结果如图8所示。其中图8a、8b是样品HSS9B中提取的，可以看出除了少量孔隙，砂颗粒周围均被碳酸钙包裹、填充，在放大的碳酸钙表面上可以清楚的看到许多直径1μm左右，长约3-4μm的孔洞，这些空洞大小与S.pasteurii相近，应该是微生物体留下的痕迹。

Claims

1.产脲酶微生物：Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31以及Bacillus lentus UR41已于2012年3月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.5916、CGMCC No.5915、CGMCC No.5913、CGMCC No.5914，该保藏中心简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

2.根据权利要求1所述的产脲酶微生物：Sporosarcinaantarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcinasp.UR31以及Bacillus lentus UR41均呈椭圆杆状，有芽孢，无荚膜，革兰氏阳性，在NH4-YE即酵母提取物20g/L，硫酸铵10g/L平板上，菌落呈圆形，表面湿润光滑，边缘整齐，菌落大小为1-2mm，菌落呈淡黄色，该菌在4℃-37℃的培养基温度及pH7-9.5的范围下均能生长。

3.利用权利要求1或2所述的产脲酶微生物制备高强度微生物砂浆的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将微生物Sporosarcina pasteurii、Terrabactertumescens、Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcinakoreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31以及Bacills lentus UR41单个菌落分别在25℃-37℃条件下在发酵培养基中发酵培养12-60小时得到六种菌液；

步骤5：以每立方米空鼓体积每分钟灌入4L反应溶液的速度灌入等摩尔浓度尿素和氯化钙混合溶液48h，反应液浓度为0.5-1mol/L；

步骤7：重复步骤3至步骤6过程1-5个循环。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1所述微生物Sporosarcina pasteurii来自于美国模式培养物集存库（Americantype culture collection），编号为ATCC11859；所述微生物Terrabacter tumescens来自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为AS.1.2690。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1所述发酵培养基包括酵母提取物10-20g/L，硫酸铵或氯化铵10g/L，pH为7-9.5。