CN115974695A

CN115974695A - 珊瑚树中降vibsane二萜类化合物的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN115974695A
Application number: CN202211595061.8A
Authority: CN
Inventors: 宋少江; 黄肖霄; 姚国栋; 吕天铭; 白明
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2022-12-13
Filing date: 2022-12-13
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2042-12-13

Abstract

珊瑚树中降vibsane二萜类化合物的制备方法及其应用，属于医药技术领域，涉及从五福花科荚蒾属植物珊瑚树(Viburnum odoratissimum Ker‑Gawl.var.awabuki(K.Koch)Zabel ex Rumpl.)叶中提取分离的具有新颖骨架的降vibsane二萜类化合物，通过反复的硅胶、ODS柱层析、HPLC柱色谱分离得到，其中化合物5对HepG2细胞显示出了较强的抑制作用，能够用于制备治疗肝癌药物中。

Description

珊瑚树中降vibsane二萜类化合物的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及五个具有新颖骨架的降vibsane二萜类化合物及其制备方法和所述化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。

背景技术

珊瑚树(Viburnum odoratissimum Ker-Gawl.var.awabuki(K.Koch)Zabel exRumpl.)：为五福花科(Adoxaceae)，荚蒾属植物。珊瑚树是一种很理想的园林绿化树种，因对煤烟和有毒气体具有较强的抗性和吸收能力，尤其适合于城市作绿篱或园景丛植。

肝癌(Liver cancer)是指发生于肝脏或从肝脏开始的恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝癌起源于肝脏的上皮或间叶组织，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。肝癌的治疗包括手术、放化疗、介入、靶向药物、免疫治疗等多种手段，根据肝癌的不同阶段酌情进行个体化综合治疗，是提高疗效的关键。手术是治疗肝癌的首选，也是最有效的方法，中医中药治疗肝癌也多有应用，采取辨证施治、攻补兼施的方法，常与其他疗法配合应用。以提高机体抗病力，改善全身状况和症状，减轻化疗、放疗不良反应。因此，在天然产物中寻找具有抗肝癌潜力的药物具有重要意义。

发明内容

本发明提供五个新颖骨架vibsane二萜类化合物或其在药学上可接受的盐：

所述的化合物是从忍冬科荚蒾属植物珊瑚树(Viburnum odoratissimum Ker-Gawl.var.awabuki(K.Koch)Zabel ex Rumpl.)叶中分离得到的。

本发明的制备技术方案包括如下步骤：

(1)取干燥的日本珊瑚树叶以70-80％工业乙醇回流提取2-3次，每次提取2-3小时，浓缩提取液得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取；

(2)将乙酸乙酯萃取液浓缩所得浸膏经硅胶柱色谱，以二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，共收集到2个馏分Fr.A-Fr.B；

(3)馏分Fr.B经HP-20柱色谱以乙醇-水系统梯度洗脱得两个组分B₁、B₂；

(4)将组分B₁经ODS柱色谱以乙醇-水系统梯度洗脱，得到10个组分B_1.1-B_1.10；

(5)将B_1.7进一步经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统50:1-1:1进行梯度洗脱得到8个组分B_1.7.1-B_1.7.8；

(6)组分B_1.7.4经制备HPLC柱以甲醇-水等度洗脱获得亚流分B_1.7.4.1-B_1.7.4.10；

(7)对B_1.7.4.6使用半制备C18及C8 HPLC柱以乙腈-水(40:60-45:55)及甲醇-水(55:45-60:40)反复分离获得化合物1-2；

(8)对B_1.7.4.8使用半制备C18及C8 HPLC柱以乙腈-水(40:60-55:55)及甲醇-水(55:45-65:35)反复分离获得化合物3-4；

(9)化合物2在酸性条件下不稳定，会部分转成化合物5，用弱酸处理化合物2能够实现化合物5的制备；

(10)由化合物2经酸性条件制备的化合物5经半制备C18 HPLC柱经乙腈-水(50:50-55:45)纯化。

所述步骤(2)中，二氯甲烷/甲醇以100:1-1:1的比例进行梯度洗脱，收集到2个馏分Fr.A-Fr.B。

所述步骤(3)中，馏分Fr.B经HP-20柱色谱以乙醇-水系统30％-90％(乙醇浓度)梯度洗脱得两个组分B₁、B₂。

所述步骤(4)中，组分B₁经ODS柱色谱以乙醇-水系统60％-100％(乙醇浓度)梯度洗脱，得到10个组分B_1.1-B_1.10。

所述步骤(6)中，组分B_1.7.4经制备HPLC柱以甲醇-水(60:40-65:35)等度洗脱获得亚流分B_1.7.4.1-B_1.7.4.10。

所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：

利用高分辨质谱，一维NMR、二维NMR及计算ECD对化合物1-7进行结构鉴定，如图1-32。

Cyclovibsanone A(1):无色油状物(甲醇)，HRESIMS给出准分子离子峰m/z439.2104[M+Na]⁺(calcd for 439.2091)，结合¹H,¹³C NMR数据确定其分子式为C₂₄H₃₂O₆，计算不饱和度为9，在¹H-NMR(600MHz,CD₃OD)谱中，δ_H 6.43-6.46(m,H-2),5.02(dd,J＝12.1,11.1Hz,H-8),7.23(d,J＝12.2Hz,H-9),5.68(br s,H-2′)为四个芳香氢质子信号，δ_H 4.17(d,J＝12.5Hz,H-17a)和4.28(d,J＝12.5Hz,H-17b)为一组连氧亚甲基质子，δ_H 2.18(s,H₃-16),1.41(s,H₃-18),1.08(s,H₃-19),1.94(br s,H₃-4′),2.19(br s,H₃-4′)提示为五个甲基质子信号。¹³C-NMR(150MHz,CD₃OD)谱中共显示24个碳，其中δ_C 202.5(C-4),210.5(C-15)提示为酮羰基碳信号，δ_C 163.3(C-15)提示存在酯基结构片段，δ_C 136.0(C-2),139.1(C-3),108.8(C-8),137.6(C-9),113.9(C-2′)and 160.6(C-3′)为三组双键碳信号。以上碳氢数据表明该化合物为具有三环体系的七元环类vibsane型二萜化合物，与典型的七元环类vibsane型二萜相比缺少一个甲基和一个具有代表性的H-5信号(δ_H 3.00(H_5β)or 3.50(H_5α))，这提示化合物1是一个新颖骨架的vibsane型二萜。

¹H-¹H COSY中，可观察到H2-1/H-2,H-8/H-10和H2-12/H-14三个自旋片段存在。在HMBC谱中，可观察到H-9与C-10/C-1′,H-10与C-4,H-17与C-2/C-3/C-4和H-19与C-1/C-10/C-11存在相关，表明化合物具有七元环骨架。H-13与C-4/C-5/C-6/C-7，H-19与C-12，H-6与C-4和H-18与C-6/C-7/C-14存在相关，表明以C-5、C-13为桥头碳的三环[5.4.1.0^5,13]十二烷骨架的存在以及C-18部分连接在C-7上。根据H-16与C-14的关键HMBC相关确定了乙酰基连接在C-14上。因此，化合物1的平面结构得到了确定，具有独特三环[5.4.1.0^5,13]十二烷骨架的vibsane型二萜类化合物。

化合物的相对构型通过NOESY谱确定。NOESY中，可观察到19-CH₃/H-10,H-10/H-6β,18-CH₃/H-14,H-14/H-12β和H-12β/H-10的相关，说明H-10,H-14,18-CH₃和19-CH₃为β朝向；H-13与H-16存在相关，说明H-13为α朝向；根据耦合常数J_8,9＝12.1Hz确定了C-8/C-9位双键构型为E构型。由此确定化合物的相对构型为5S*,7R*,10R*,11R*,13S*,16S*，化合物的绝对构型是通过比较计算和实测ECD确定的。化合物实测ECD曲线与计算的5S,7R,10R,11R,13S,16S构型ECD曲线能够较好的吻合，因此确定化合物的绝对构型为5S,7R,10R,11R,13S,16S。

Cyclovibsanone B(2):无色油状物(甲醇)，HRESIMS给出准分子离子峰m/z439.2104[M+Na]⁺(calcd for 439.2091)，结合¹H,¹³C NMR数据确定其分子式为C₂₄H₃₂O₆，计算不饱和度为9。由于¹H,¹³C NMR数据的相似性以及COSY和HMBC谱的相关性，表明该化合物的大体结构与1相同。此外，由于16-CH₃和18-CH₃之间的空间压缩效应，18-CH₃、C-16和C-18的化学位移的向低场移动，表明化合物2可能是化合物1的7位差向异构体。根据H-13/18-CH₃、H-13/18-CH₃、H-4/H-12β、H-12β/H-14的NOE相关，进一步证实了这一猜想，表明乙酰基和CH₃-18的α取向。通过对比实测和计算ECD谱图确定了化合物的绝对构型为5S,7S,10R,11R,13S,16S。

化合物1-2的核磁数据归属如表1所示。

表1化合物1-2(a：CDCl₃及b：CD₃OD)的¹H(600MHz)和¹³C(150MHz)NMR数据

Cyclovibsanone C(3):无色油状物(甲醇)，HRESIMS给出准分子离子峰m/z439.2097[M+Na]⁺(calcd for 439.2091)，结合¹H,¹³C NMR数据确定其分子式为C₂₄H₃₂O₆，计算不饱和度为9。由于¹H,¹³C NMR数据的相似性以及COSY和HMBC谱的相关性，表明该化合物的大体结构与化合物1相同。化合物3的区别在于耦合常数J_8,9＝6.9Hz确定了C-8/C-9位双键构型为Z构型。根据19-CH₃/H-10,H-10/H-6β,18-CH₃/H-14,H-14/H-12β和H-12β/H-10的相关，说明H-10,H-14,18-CH₃和19-CH₃为β朝向；H-13与H-16存在相关，说明H-13为α朝向，进一步验证了化合物的结构。通过对比实测和计算ECD谱图确定了化合物的绝对构型为8Z,5S,7R,10R,11R,13S,16S。

Cyclovibsanone D(4):无色油状物(甲醇)，HRESIMS给出准分子离子峰m/z439.2132[M+Na]⁺,calcd 439.2091，结合¹H,¹³C NMR数据确定其分子式为C₂₄H₃₂O₆，计算不饱和度为9，在¹H-NMR(600MHz,CD₃OD)谱中，δ_H 7.14(d,H-9),6.53(t,H-1),5.68,(brs,H-2′),5.30(d,H-8)为四个烯烃氢质子信号，δ_H 4.29/4.17(d,H₂-17)为一组连氧亚甲基质子，δ_H2.09(s,16-CH₃),2.11(s,16-CH₃),2.17(brs,5′-CH₃),1.94(brs,4′-CH₃),1.10(s,18-CH₃)提示为五个甲基质子信号，¹³C-NMR(150MHz,CD₃OD)谱中共显示24个碳。以上碳氢数据与已知化合物vibsanolide A相似，这表明该化合物为七元环类vibsane型二萜化合物，与典型的七元环类vibsane型二萜相比拥有一个额外的环体系和缺少一个具有代表性的H-5信号(δ_H 3.00(H_5β)or 3.50(H_5α))，这提示化合物4是一个新颖骨架的vibsane型二萜。

¹H-¹H COSY中，可观察到CH(9)-CH(8)-CH(10),CH(2)-CH₂(1)和CH(12)-CH(6)-CH(7)三个自旋片段存在。在HMBC谱中，可观察到19-CH₃与C-1,C-11,C-2，18-CH₃与C-6,C-7和H₂-17与C-2,C-3,C-4存在相关，表明化合物具有七元环骨架。根据H-6/H-10与C-13的关键HMBC相关确定了C-5与C-13相连。因此，化合物4的平面结构得到了确定。化合物的相对构型通过NOESY谱确定。NOESY中，可观察到H-10/H-13,H-13/H₂-6和H₂-6/H-10的相关，说明H-10,H-13和C-6为β朝向；根据耦合常数J_12α,13＝9.6Hz确定了H-13为β朝向。由此确定化合物的相对构型为。化合物的绝对构型是通过比较计算和实测ECD确定的。化合物实测ECD曲线与计算的5S,10R,11R,13R构型ECD曲线能够较好的吻合，因此确定化合物的绝对构型为5S,10R,11R,13R。

化合物5:无色油状物(甲醇)，HRESIMS给出准分子离子峰m/z 421.1963[M+Na]⁺(calcd for 421.1991)，结合¹H,¹³C NMR数据确定其分子式为C₂₄H₃₀O₅，计算不饱和度为10。由于¹H,¹³C NMR数据的相似性，表明该化合物的大体结构与1相同。由于化合物5多了两个双键碳信号，结合分子量缺少了18多了一个不饱和度，推测化合物5可能是由于化合物2分子内脱水形成的，该推测进一步通过关键HMBC相关18-CH₃与C-6/C-7/C-14证明。化合物的相对构型通过NOESY谱确定。NOESY中，可观察到19-CH₃/H-10,H-10/H-6β和H-12β/H-10的相关，说明H-10,和19-CH₃为β朝向；H-13与H-16存在相关，说明H-13为α朝向；根据耦合常数J_8,9＝12.1Hz确定了C-8/C-9位双键构型为E构型。由此确定化合物的相对构型为5S*,10R*,11R*,13S*，化合物的绝对构型是通过比较计算和实测ECD确定的。化合物实测ECD曲线与计算的5S,10R,11R,13S构型ECD曲线能够较好的吻合，因此确定化合物的绝对构型为5S,10R,11R,13S。

化合物3-5的核磁数据归属如表2所示：

表2化合物3-5(a：CD₃OD及b：CDCl₃)的¹H(600MHz)和¹³C(150MHz)NMR数据

所述的五个vibsane型二萜类化合物对肿瘤细胞MCF-7，A549和HepG2的细胞毒活性考察，体外细胞实验结果表明，本发明的化合物5对HepG2具有中等强度的细胞毒活性，IC₅₀值为18.24μM。因此本发明所述的vibsane型二萜具有进一步开发治疗肝癌药物的前景。

一种药物组合物，以所述的降vibsane二萜类化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，与药学上可接受的赋形剂混合制备成的组合物，并制备成临床上可接受的剂型，所述赋形剂是指能够用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体，所述剂型为注射剂、片剂或胶囊剂。

本发明所述的降vibsane二萜类化合物或其药学上可接受的盐或所述的药物组合物在制备治疗肝癌药物中应用。

本发明的优点在于，所述化合物均为立体构型确定的光学纯化合物，同时其抗肝癌活性，具有进一步开发的价值。

附图说明

图1化合物1的¹H NMR谱(600MHz,CD₃OD)；

图2化合物1的¹³C NMR谱(150MHz,CD₃OD)；

图3化合物1的DEPT谱(150MHz,CD₃OD)；

图4化合物1的HMBC谱(600MHz,CD₃OD)；

图5化合物1的HSQC谱(600MHz,CD₃OD)；

图6化合物1的NOESY谱(600MHz,CD₃OD)；

图7化合物2的¹H NMR谱(600MHz,CD₃OD)；

图8化合物2的¹³C NMR谱(150MHz,CD₃OD)；

图9化合物2的DEPT谱(150MHz,CD₃OD)；

图10化合物2的HMBC谱(600MHz,CD₃OD)；

图11化合物2的HSQC谱(600MHz,CD₃OD)；

图12化合物2的NOESY谱(600MHz,CD₃OD)；

图13化合物3的¹H NMR谱(600MHz,CD₃OD)；

图14化合物3的¹³C NMR谱(150MHz,CD₃OD)；

图15化合物3的DEPT谱(150MHz,CD₃OD)；

图16化合物3的HMBC谱(600MHz,CD₃OD)；

图17化合物3的HSQC谱(600MHz,CD₃OD)；

图18化合物3的NOESY谱(600MHz,CD₃OD)；

图19化合物4的¹H NMR谱(600MHz,CD₃OD)；

图20化合物4的¹³C NMR谱(150MHz,CD₃OD)；

图21化合物4的DEPT谱(150MHz,CD₃OD)；

图22化合物4的HMBC谱(600MHz,CD₃OD)；

图23化合物4的HSQC谱(600MHz,CD₃OD)；

图24化合物4的NOESY谱(600MHz,CD₃OD)；

图25化合物1的HRESIMS谱；

图26化合物2的HRESIMS谱；

图27化合物3的HRESIMS谱；

图28化合物4的HRESIMS谱；

图29化合物1的UV谱；

图30化合物2的UV谱；

图31化合物3的UV谱；

图32化合物4的UV谱。

具体实施方式

下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

所述vibsane二萜类化合物1-5的制备。

(1)取干燥的日本珊瑚树叶40Kg以75％工业乙醇回流提取3次，每次提取3小时，浓缩提取液得浸膏，浸膏采用乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取；

(2)将乙酸乙酯萃取液浓缩所得浸膏经硅胶柱色谱，以100:1-1:1二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，共收集到2个馏分Fr.A-Fr.B；

(3)馏分Fr.B(200g)经HP-20柱色谱以乙醇-水系统30％-90％(30％,60％,90％)梯度洗脱得两个组分B₁(69g)、B₂(50g)；

(4)将组分B₁(69g)经ODS柱色谱以乙醇-水系统60％-100％(60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,100％)梯度洗脱，得到10个组分B_1.1-B_1.10；

(5)将B_1.7(12g)进一步经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯系统50:1-1:1进行梯度洗脱得到8个组分B_1.7.1-B_1.7.8；

(6)所得组分B_1.7.4(600mg)经制备HPLC柱以甲醇-水(60:40-65:35,v/v,7.0mL/min)获得10个亚组分B_1.7.4.1-B_1.7.4.10；

(7)对B_1.7.4.6进一步使用半制备C18及C8 HPLC柱以乙腈-水(40:60-45:55)及甲醇-水(55:45-60:40)分离得到化合物1(18.5mg)、化合物2(10mg)。

(8)对B_1.7.4.8进一步使用C8半制备HPLC柱以乙腈-水(45:55-50:50 3.0mL/min)进行二次纯化获得5个次级流分B_1.7.4.8.1-B_1.7.4.8.5；对B_1.7.4.8.2进一步使用半制备C18 HPLC柱以甲醇-水(60:40-65:35,v/v,3.0mL/min)制备获得化合物3(3mg)；组分B_1.7.4.8.3经半制备使用半制备C18及C8 HPLC柱以乙腈-水(40:60-45:55)及甲醇-水(55:45-60:40)反复纯化，得到化合物4(1mg)；

(9)化合物2在弱酸条件下不稳定，以氯仿为溶剂，加入1mol/L稀盐酸常温条件放置，一段时间后就会部分转成化合物5(2mg)。

实施例2

所述化合物1-5在体外肿瘤细胞MCF-7，A549和HepG2的抗肿瘤活性考察。

利用MTT法，考察化合物1-5对肿瘤细胞MCF-7，A549和HepG2的细胞毒活性实验。将细胞放置于96孔板中，用培养液静置培养12h,使用不同浓度的化合物处理MCF-7，A549和HepG2细胞，并分别用紫杉醇和索拉非尼做阳性对照组。作用48h后，加入20μL MTT试剂并在37℃放置4h，用酶标仪在490nm波长下对不同浓度处理的细胞进行检测。结果如表3所示，化合物5对HepG2具有中等强度的细胞毒活性，IC₅₀值为18.24μM。

表3化合物1-5在体外肿瘤细胞MCF-7，A549和HepG2的抗肿瘤活性考察

Claims

1.一种珊瑚树中降vibsane二萜类化合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述vibsan e二萜类化合物为如下所示结构式中任一种：

2.一种权利要求1所述的珊瑚树中降vibsane二萜类化合物或其在药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(9)用弱酸处理化合物2制备化合物5；

(10)化合物5经半制备C18 HPLC柱经乙腈-水(50:50-55:45)纯化。

3.根据权利要求2所述的珊瑚树中降vibsane二萜类化合物或其在药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述的日本珊瑚树叶为忍冬科荚蒾属植物珊瑚树(Viburnumodoratissimum Ker-Gawl.var.awabuki(K.Koch)Zabel ex Rumpl.)叶。

4.根据权利要求2所述的珊瑚树中降vibsane二萜类化合物或其在药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，二氯甲烷/甲醇以100:1-1:1的比例进行梯度洗脱，收集到2个馏分Fr.A-Fr.B。

5.根据权利要求2所述的珊瑚树中降vibsane二萜类化合物或其在药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，馏分Fr.B经HP-20柱色谱以乙醇-水系统30％-90％梯度洗脱得两个组分B₁、B₂。

6.根据权利要求2所述的珊瑚树中降vibsane二萜类化合物或其在药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，组分B₁经ODS柱色谱以乙醇-水系统60％-100％梯度洗脱，得到10个组分B_1.1-B_1.10。

7.根据权利要求2所述的珊瑚树中降vibsane二萜类化合物或其在药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，组分B_1.7.4经制备HPLC柱以甲醇-水(60:40-65:35)等度洗脱获得亚流分B_1.7.4.1-B_1.7.4.10。

8.一种药物组合物，其特征在于，以权利要求1所述的vibsane二萜类化合物或其在药学上可接受的盐作为活性成分，与药学上可接受的赋形剂混合制备成的组合物，并制备成临床上可接受的剂型，所述赋形剂是指能够用于药学领域的稀释剂、辅助剂或载体，所述剂型为注射剂、片剂或胶囊剂。

9.一种权利要求1所述的vibsane二萜类化合物或其在药学上可接受的盐在制备治疗肝癌药物中应用。

10.一种权利要求8所述的药物组合物在制备治疗肝癌药物中应用。