CN115969809A - 一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法及其在鼻腔黏膜修复的应用 - Google Patents
一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法及其在鼻腔黏膜修复的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及鼻腔黏膜修复技术领域,具体为一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法及其在鼻腔黏膜修复的应用,本发明以丝素蛋白、氯化钠、依克多因、山梨醇、白藜芦醇、藏冰片、姜黄素、辛夷挥发油、苍耳子挥发油、鹅不食草挥发油、生物活性玻璃粉体、贻贝粘蛋白为原料,利用鼻腔黏膜带负电的特性,制备出了可以与鼻腔黏膜产生强烈静电吸附作用的功能微球,该功能微球鼻腔黏膜表面形成了一层生物膜,能阻止并减少外界中的致病性微生物及其他颗粒性过敏物质与鼻黏膜接触,同时静电吸附还能延长功能性成分在鼻黏膜的作用时间,功能性成分先后从不同方面发挥作用,增强了其在鼻部黏膜的作用效果。本发明制备方法所得的功能微球可有效治疗各类鼻炎,改善患者的喷嚏、鼻漏、鼻塞等症状的效果,且作用持久,不易复发,刺激性小,安全性高。
Description
技术领域
本发明涉及鼻腔黏膜修复技术领域,具体为一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法及其在鼻腔黏膜修复的应用。
背景技术
鼻腔过敏分两种,一种是血管运动性鼻炎,它最主要就是自主神经功能的失调,使得副交感神经旺盛并且造成种种类似过敏性鼻炎的症状,它并非特定抗原所引起,而和情绪紧张、压力增加或种种物理变化使然。另外一种就是过敏性鼻炎,过敏性鼻炎即变应性鼻炎,是指特应性个体接触变应原后,主要由IgE介导的介质(主要是组胺)释放,并有多种免疫活性细胞和细胞因子等参与的鼻黏膜非感染性炎性疾病。它的症状就是水样鼻涕、鼻塞、打喷嚏,甚至还会有鼻根酸痛、鼻眼耳痒、头晕发胀、注意力不集中等。除此之外,它还可能诱发过敏性结膜炎、过敏性皮炎、慢性鼻窦炎、鼻息肉、分泌性中耳炎,严重时甚至可能诱发哮喘而危及生命。统计表明,近些年来过敏性鼻炎的患病率全球呈逐年增加的趋势,我国的过敏性鼻炎患者数量也在逐年攀升,这不仅对人们的身心健康和生活质量具有负面影响,而且对社会经济亦会造成一定的负担,日益成为普通民众关注的健康问题。
目前来说,治疗鼻炎一般用的比较多的是喷剂和滴鼻给药,但是由于鼻黏膜表面众多纤毛的清除功能,液体在鼻腔的停留时间仅15min左右,粉末或颗粒在鼻腔的停留时间则有20min~30min左右,这在一定程度上影响了药物的吸收和疗效,所以就需要长期使用,有的喷剂和滴鼻给药含有激素类药物,如果长期频繁使用,会有一些局部副作用,如:鼻干,鼻出血,甚至可能引起激素的全身副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法及其在鼻腔黏膜修复的应用,该功能微球安全无副作用,可以延长药物作用时间,有效提高对鼻腔黏膜修复作用。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法,它包括以下制备步骤:
步骤一:将8-14重量份丝素蛋白、1-5重量份氯化钠、3-5重量份依克多因、2-5重量份山梨醇溶于纯水,搅拌得到重量百分比8%-14%丝素蛋白水溶液,本发明将丝素蛋白浓度控制在8%-14%,丝素蛋白水溶液的浓度过低则挥发油表面无法沉积到足够的丝素蛋白,浓度过高则溶液粘度太大,无法制备得到微球;
步骤二:将0.02-0.5重量份白藜芦醇、0.02-0.5重量份藏冰片、0.02-0.5重量份姜黄素溶于2-5重量份无水乙醇,与步骤一中的8%-14%丝素蛋白水溶液混合搅拌均匀,得到混合液;
步骤三:将0.05-0.5重量份生物活性玻璃粉体加入到0.2-2重量份辛夷挥发油、0.2-2重量份苍耳子挥发油、0.2-2重量份鹅不食草挥发油中快速搅拌混合,然后再加入到步骤二的混合液中,搅拌形成白色乳液;
步骤四:将3-9重量份贻贝粘蛋白溶于纯水,搅拌得到重量百分比3%-9%贻贝粘蛋白水溶液,将该贻贝粘蛋白水溶液与步骤三中的白色乳液混合,搅拌混匀;
步骤五:向步骤四混合后的乳液中加入13-33重量份无水乙醇,搅拌,随后离心、清洗、干燥,得到一种复合蛋白包裹的功能微球。
制备过程搅拌速度控制在1000-5000r/min,离心速度控制在5000-20000r/min。
所述步骤(五)功能微球的粒径为120-160μm。
所述步骤(五)清洗用无水乙醇清洗。
所述步骤(五)干燥为真空条件、45-55℃下干燥12h。
所述生物活性玻璃粉体为纳米生物活性玻璃粉体。
将一种复合蛋白包裹的功能微球应用于鼻腔黏膜修复。
本发明的辛夷挥发油,苍耳子挥发油、鹅不食草挥发油为挥发性成分,具有抗炎,抗过敏,通鼻窍。
本发明的生物活性玻璃具有抗菌消炎、修复受损细胞的作用。
本发明的姜黄素具有抗炎杀菌的功效。
本发明的白藜芦醇具有抗氧化,调节免疫的功效。
本发明的藏冰片具有抗炎杀菌,促进黏膜对药物吸收的功效。
本发明的依克多因具有保湿剂的功效,对鼻炎有缓解作用。
本发明的贻贝粘蛋白是一种具有高强度、高韧性和防水性以及很好的生物相容性、生物可降解性以及低毒性等特点的生物胶黏剂,由70-90个重复的多肽片段组成,每个多肽段由10个氨基酸组成,其中2个是赖氨酸,使得其成为少数的碱性蛋白,在人体正常生理pH时,带有大量的正电荷。
本发明的丝素蛋白是一种从蚕丝中提取的天然蛋白质,具有两亲结构,在分子中同时含有亲水和疏水基团。
本发明将生物活性玻璃粉体加入到辛夷挥发油、苍耳子挥发油、鹅不食草挥发油中,形成油包固的功能性油滴,当丝素蛋白遇到功能性油滴时,会包裹与功能性油滴表面,形成微球第一壳层。另外,由于丝素蛋白在中性水溶液中表面带负电荷,贻贝粘蛋白带有正电荷,当加入带正电荷的贻贝粘蛋白后,贻贝粘蛋白会自动沉积在丝素蛋白表面,形成微球第二壳层,加固微球第一壳层,最终形成复合蛋白包覆的功能微球,本发明氯化钠和山梨醇的加入使得在制备过程中形成的微球体系更加稳定。
当本发明功能微球作用于鼻腔时,带有正电荷的贻贝粘蛋白可以与带负电的鼻腔黏膜产生强烈的静电作用,进而使得功能微球黏附于鼻腔粘膜,形成带正电的纳米级生物网络膜。另外,贻贝粘蛋白分子中含有大量的3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA),氧化的DOPA和未氧化的DOPA的氧存在的环境中自氧化交联形成微观非连续网状生物膜,加固了黏附效果。
本发明由于贻贝粘蛋白与鼻黏膜的静电吸附作用,形成的生物膜可以阻止并减少外界中的致病性微生物及其他颗粒性过敏物质与鼻黏膜接触,静电吸附还能延长功能性成分在鼻黏膜的作用时间,增强对黏膜的渗透能力,进而增强其在鼻部黏膜的作用效果。本发明功能性成分中,首先发挥作用的是姜黄素、白藜芦醇、藏冰片、依克多因,同时伴随着辛夷挥发油、苍耳子挥发油、鹅不食草挥发油的挥发,当本发明功能性油滴中的辛夷挥发油、苍耳子挥发油、鹅不食草挥发油挥发完以后,生物活性玻璃粉体失去油性包裹,得以进入鼻腔黏膜中发挥抗菌消炎、修复受损细胞的作用,本发明制备方法得到功能微球多个维度发挥作用。需要说明的是,生物活性玻璃粉体进入鼻腔黏膜中发挥作用时,鼻腔内形成的生物膜已经形成了一个稳定的湿环境,可以克服生物活性玻璃粉体直接与鼻黏膜接触时局部pH迅速增加导致的刺激和瞬间剧痛,这也是本发明将生物活性玻璃粉体包裹在挥发油中的原因。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明以丝素蛋白、氯化钠、依克多因、山梨醇、白藜芦醇、藏冰片、姜黄素、辛夷挥发油、苍耳子挥发油、鹅不食草挥发油、生物活性玻璃粉体、贻贝粘蛋白为原料,利用鼻腔黏膜带负电的特性,制备出了可以与鼻腔黏膜产生强烈静电吸附作用的功能微球,该功能微球鼻腔黏膜表面形成了一层生物膜,能阻止并减少外界中的致病性微生物及其他颗粒性过敏物质与鼻黏膜接触,同时静电吸附还能延长功能性成分在鼻黏膜的作用时间,功能性成分先后从不同方面发挥作用,增强了其在鼻部黏膜的作用效果。本发明制备方法所得的功能微球可有效治疗各类鼻炎,改善患者的喷嚏、鼻漏、鼻塞等症状的效果,且作用持久,不易复发,刺激性小,安全性高。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法,它包括以下制备步骤:
步骤一:将8重量份丝素蛋白、1重量份氯化钠、3重量份依克多因、2-5重量份山梨醇溶于纯水,搅拌得到重量百分比8%丝素蛋白水溶液;
步骤二:将0.02重量份白藜芦醇、0.02重量份藏冰片、0.02重量份姜黄素溶于2重量份无水乙醇,与步骤一中的8%丝素蛋白水溶液混合搅拌均匀,得到混合液;
步骤三:将0.05重量份生物活性玻璃粉体加入到0.2重量份辛夷挥发油、0.2重量份苍耳子挥发油、0.2重量份鹅不食草挥发油中快速搅拌混合,然后再加入到步骤二的混合液中,搅拌形成白色乳液;
步骤四:将3重量份贻贝粘蛋白溶于纯水,搅拌得到重量百分比3%贻贝粘蛋白水溶液,将该贻贝粘蛋白水溶液与步骤三中的白色乳液混合,搅拌混匀;
步骤五:向步骤四混合后的乳液中加入13重量份无水乙醇,搅拌,随后离心、清洗、干燥,得到一种复合蛋白包裹的功能微球。
制备过程搅拌速度控制在1000-5000r/min,离心速度控制在5000-20000r/min。
所述步骤(五)功能微球的粒径为120μm。
所述步骤(五)清洗用无水乙醇清洗。
所述步骤(五)干燥为真空条件、45℃下干燥12h。
所述生物活性玻璃粉体为纳米生物活性玻璃粉体。
将一种复合蛋白包裹的功能微球应用于鼻腔黏膜修复。
实施例2
一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法,它包括以下制备步骤:
步骤一:将10重量份丝素蛋白、3重量份氯化钠、4重量份依克多因、3重量份山梨醇溶于纯水,搅拌得到重量百分比10%丝素蛋白水溶液;
步骤二:将0.2重量份白藜芦醇、0.2重量份藏冰片、0.2重量份姜黄素溶于4重量份无水乙醇,与步骤一中的10%丝素蛋白水溶液混合搅拌均匀,得到混合液;
步骤三:将0.2重量份生物活性玻璃粉体加入到1重量份辛夷挥发油、1重量份苍耳子挥发油、1重量份鹅不食草挥发油中快速搅拌混合,然后再加入到步骤二的混合液中,搅拌形成白色乳液;
步骤四:将6重量份贻贝粘蛋白溶于纯水,搅拌得到重量百分比6%贻贝粘蛋白水溶液,将该贻贝粘蛋白水溶液与步骤三中的白色乳液混合,搅拌混匀;
步骤五:向步骤四混合后的乳液中加入25重量份无水乙醇,搅拌,随后离心、清洗、干燥,得到一种复合蛋白包裹的功能微球。
制备过程搅拌速度控制在1000-5000r/min,离心速度控制在5000-20000r/min。
所述步骤(五)功能微球的粒径为140μm。
所述步骤(五)清洗用无水乙醇清洗。
所述步骤(五)干燥为真空条件、50℃下干燥12h。
所述生物活性玻璃粉体为纳米生物活性玻璃粉体。
将一种复合蛋白包裹的功能微球应用于鼻腔黏膜修复。
实施例3
一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法,它包括以下制备步骤:
步骤一:将14重量份丝素蛋白、5重量份氯化钠5重量份依克多因、5重量份山梨醇溶于纯水,搅拌得到重量百分比14%丝素蛋白水溶液;
步骤二:将0.5重量份白藜芦醇、0.5重量份藏冰片、0.5重量份姜黄素溶于5重量份无水乙醇,与步骤一中的15%丝素蛋白水溶液混合搅拌均匀,得到混合液;
步骤三:将0.5重量份生物活性玻璃粉体加入到2重量份辛夷挥发油、2重量份苍耳子挥发油、2重量份鹅不食草挥发油中快速搅拌混合,然后再加入到步骤二的混合液中,搅拌形成白色乳液;
步骤四:将9重量份贻贝粘蛋白溶于纯水,搅拌得到重量百分比9%贻贝粘蛋白水溶液,将该贻贝粘蛋白水溶液与步骤三中的白色乳液混合,搅拌混匀;
步骤五:向步骤四混合后的乳液中加入33重量份无水乙醇,搅拌,随后离心、清洗、干燥,得到一种复合蛋白包裹的功能微球。
制备过程搅拌速度控制在1000-5000r/min,离心速度控制在5000-20000r/min。
所述步骤(五)功能微球的粒径为160μm。
所述步骤(五)清洗用无水乙醇清洗。
所述步骤(五)干燥为真空条件、55℃下干燥12h。
所述生物活性玻璃粉体为纳米生物活性玻璃粉体。
将一种复合蛋白包裹的功能微球应用于鼻腔黏膜修复。
对比例1
本发明与实施例2的不同之处在于:本实施例中步骤三中未采用生物活性玻璃粉体:直接将1重量份辛夷挥发油、1重量份苍耳子挥发油、1重量份鹅不食草挥发油中快速搅拌混合,然后再加入到步骤二的混合液中,搅拌形成白色乳液,其余均相同,最终也得到一种复合蛋白包裹的功能微球。
对比例2
本发明与实施例2的不同之处在于:步骤三:将0.2重量份生物活性玻璃粉体加入到3重量份辛夷挥发油、4重量份苍耳子挥发油、3重量份鹅不食草挥发油中快速搅拌混合,然后再加入到步骤二的混合液中,搅拌形成白色乳液,其余均相同。
未观察到微球,原因分析:本对比例挥发油比例过高,导致微球过大,在后续的工艺中造成破损。
对比例3
本发明与实施例2的不同之处在于:本实施例中步骤四:将20重量份贻贝粘蛋白溶于纯水,搅拌得到重量百分比20%贻贝粘蛋白水溶液,将该贻贝粘蛋白水溶液与步骤三中的白色乳液混合,搅拌混匀,其余均相同。
微球粘连、团聚,原因分析:本对比例贻贝粘蛋白浓度过大,造成溶液粘度太大,形成的微球之间相互粘连、团聚,分散不均匀。
实验部分
1、动物实验:
将实施例1-3,对比例1-3制备所得产品10mg与100ml生理盐水混合,制备形成0.1mg/ml的混悬液。
治疗方案:将60只SD大鼠随机分为9组,每组10只,分别为①空白对照组、②过敏性鼻炎模型组、③实施例1治疗组、④实施例2治疗组、⑤实施例3治疗组、⑥对比例1治疗组、⑦对比例2治疗组、⑧对比例3治疗组、⑨地塞米松治疗组(阳性药物对照组)。
组不致敏也不给药,给、、、、、、、组的大鼠连续7d鼻腔滴入体积分数10%甲苯-2,4二异氰酸酯(TDI)橄榄油溶液使大鼠致敏,剂量为0.1mL/d。造模成功后,过敏性鼻炎模型组不进行治疗,、、、、大鼠每天鼻腔滴入0.2ml混悬液,地塞米松治疗组给予地塞米松滴鼻,各2次/d。连续观察7d。
过敏性鼻炎症状观察指标:最后一次滴鼻后30分钟,观察大鼠的抓鼻、喷嚏、清涕的轻重程度并评分,逐项评分并采用叠加法进行计算总分。
(1)抓鼻(鼻痒):1分(1-5个),2分(6-15个),3分(15个以上);
(2)喷嚏:1分(1-3个),2分(4-10个),3分(11个以上);
(3)清涕:1分(流至前鼻孔),2分(超过前鼻孔),3分(涕流满面)。
统计学处理:所有数据以±S表示。组间差异比较用ANOVA和Student-Newman-Keuls法多重比较;S检验分析,由SPSS11.5统计软件完成,双侧P<0.05说明差异具有显著性。
。
与过敏性鼻炎组比较,*P<0.05;与空白对照组比较,#P<0.05;n=10.
结果分析:除空白对照组外,其他各组从给药TDI橄榄油溶液开始,均出现不同程度的鼻痒、喷嚏、流涕症状。过敏症状随着给药次数的增加而加重。模型复制成功的大鼠具有典型的鼻痒、喷嚏、流涕症状。地塞米松组减轻了过敏鼻炎症状,与过敏性鼻炎组有明显差异。实施例1-3治疗组对鼻炎有治疗作用,与过敏性鼻炎组有明显差异(P<0.05),治疗后评分略优于地塞米松组。对比例1-3治疗组虽有治疗作用,但是治疗后评分明显低于实施例1-3治疗组地塞米松组,这说明微球和生物活性玻璃粉体都分别对过敏性鼻炎具有明显治疗效果。
2、细胞毒性实验
本次测试遵照《GB∕T 16886.5-2017医疗器械生物学评价 第5部分:体外细胞毒性试验》进行浸提液试验,以前实施例1-3所得微球为试验组,实验过程中三个样品组仅有少量细胞出现圆缩、疏松贴壁、无胞浆内颗粒的形态,形态发生变化的细胞数量低于20%。测试样品呈现轻微毒性的倾向性,毒性等级为1级,通过毒性测试。具体结果可见如下表。
。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例,并不用来限制本发明,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法,其特征在于,它包括以下制备步骤:
步骤一:将8-14重量份丝素蛋白、1-5重量份氯化钠、3-5重量份依克多因、2-5重量份山梨醇溶于纯水,搅拌得到重量百分比8%-14%丝素蛋白水溶液;
步骤二:将0.02-0.5重量份白藜芦醇、0.02-0.5重量份藏冰片、0.02-0.5重量份姜黄素溶于2-5重量份无水乙醇,与步骤一中的8%-14%丝素蛋白水溶液混合搅拌均匀,得到混合液;
步骤三:将0.05-0.5重量份生物活性玻璃粉体加入到0.2-2重量份辛夷挥发油、0.2-2重量份苍耳子挥发油、0.2-2重量份鹅不食草挥发油中快速搅拌混合,然后再加入到步骤二的混合液中,搅拌形成白色乳液;
步骤四:将3-9重量份贻贝粘蛋白溶于纯水,搅拌得到重量百分比3%-9%贻贝粘蛋白水溶液,将该贻贝粘蛋白水溶液与步骤三中的白色乳液混合,搅拌混匀;
步骤五:向步骤四混合后的乳液中加入13-33重量份无水乙醇,搅拌,随后离心、清洗、干燥,得到一种复合蛋白包裹的功能微球。
2.根据权利要求1所述的一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法,其特征在于:制备过程搅拌速度控制在1000-5000r/min,离心速度控制在5000-20000r/min。
3.根据权利要求1所述的一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法,其特征在于:所述步骤五功能微球的粒径为120-160μm。
4.根据权利要求1所述的一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法,其特征在于:所述步骤五清洗用无水乙醇清洗。
5.根据权利要求1所述的一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法,其特征在于:所述步骤五干燥为真空条件、45-55℃下干燥12h。
6.根据权利要求1所述的一种复合蛋白包裹的功能微球的制备方法,其特征在于:所述生物活性玻璃粉体为纳米生物活性玻璃粉体。
7.将权利要求1所述的一种复合蛋白包裹的功能微球应用于鼻腔黏膜修复。
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