CN115966251A - 一种基于网络药理学及分子对接分析中药组合物治疗围绝经期冠心病机制的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于网络药理学及分子对接分析中药组合物治疗围绝经期冠心病机制的方法。所述方法包括以下步骤：步骤S1：中药组合物有效活性成分及靶点的查询和筛选；步骤S2：构建围绝经期综合征相关基因数据集；步骤S3：女贞二仙合剂‑围绝经期综合征的重要核心靶点及网络构建；步骤S4：GO功能和KEGG通路富集分析；步骤S5：分子对接验证。网络药理学分析结果表明：本发明针对的中药组合物‑女贞二仙合剂主要涉及细胞过程、代谢过程、对应激的应答等生物过程，通过调节PI3K‑AKT等信号通路来发挥治疗围绝经期冠心病作用。

Description

一种基于网络药理学及分子对接分析中药组合物治疗围绝经期冠心病机制的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于网络药理学及分子对接分析中药组合物治疗围绝经期冠心病机制的方法。

背景技术

心血管疾病目前已经成为威胁人类健康的主要杀手，冠心病的发病率致死率均较前出现显著增高，且有年轻化趋势。女贞二仙合剂为新乡医学院第一附属医院治疗围绝经期综合征时研制出来的一款新药，其是在中医整体观念和辨证论治的指导下，基于病证结合—方证对应理论，根据临床经验在“二仙汤”的基础上加减组方成“女贞二仙汤”(女贞二仙合剂)，临床上用以治疗围绝经期综合征肾阴阳两虚证，详见申请号为202111092300.3的发明专利申请(公布号：CN113750176A)。但前期研究表明女贞二仙合剂具有能够干预急性心肌梗死大鼠的作用，提示女贞二仙合剂具有修复心肌细胞的作用，这可能为临床上治疗围绝经期冠心病提供新的治疗途经，但机制尚不明确。

2007年Hopkins等提出了“网络药理学”的概念，通过分析药物对疾病网络的干预，构建“药物 -靶点-疾病”网络，为药物研发提供了新的策略。中药因其成分复杂、系统庞大而不易研究，网络药理学则为复杂中药系统的研究提供了新的思路和视角。网络药理学研究策略的整体性、系统性与中医学从整体、辨证论治的角度诊治疾病的理论以及中药及其复方的多成分、多途径、多靶点协同作用的原理不谋而合。

“网络药理学”的研究方法或许能够揭示女贞二仙合剂治疗围绝经期综合征的作用机制，但现有技术并无相关研究。

因此，需要提供一种针对上述现有技术不足的改进技术方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于网络药理学及分子对接分析中药组合物治疗围绝经期冠心病机制的方法，为采用中药组合物治疗围绝经期冠心病提供新思路和新方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于网络药理学及分子对接技术分析中药组合物治疗围绝经期冠心病机制的方法，包括以下步骤：

步骤S1：中药组合物有效活性成分及靶点的查询和筛选

以中药组合物中主要中药作为关键词在数据库与分析平台中进行化学成分以及相应成分靶点的检索，选出有效活性成分，构建中药组合物的活性成分数据集，并进一步得到中药靶基因；

步骤S2：构建围绝经期综合征相关基因数据集

在多个数据库中检索与围绝经期综合征相关基因然后取并集，得到围绝经期综合征相关基因数据集；

步骤S3中药组合物-疾病的重要核心靶点及网络构建

将中药靶基因与疾病相关基因进行比对取交集，筛选出步骤S1中的有效活性成分与围绝经期综合征共同的基因靶点，基于Cytoscape 3.8.0软件绘制“成分-靶点”的可视化网络图，从而得到有效活性成分与靶基因的靶向关系，确定作用的靶点，利用String数据库构建PPI网络，然后对所述靶点进行多次拓扑分析，得到所述中药组合物治疗围绝经期综合征的重要核心靶点；

步骤S4：GO功能和KEGG通路富集分析

在R 4.1.0软件上将基因信号转换后对所述中药组合物治疗围绝经期综合征的潜在靶点进行GO 及KEGG富集分析，筛选出前30条最具有统计学意义的GO功能和KEGG通路制作柱状图、气泡图以及关键信号通路图；

步骤S5：分子对接验证

通过步骤S3中构建的网络选择重要组合物的关键活性成分，然后与所述重要核心靶点进行分子对接验证。

在上述方法中，优选地，步骤S1中，所述“选出有效活性成分”为：通过口服生物利用度和类药性进行选择，所述口服生物利用度在30％以上，所述类药性在0.18以上。

在上述方法中，优选地，步骤S1中，所述中药靶基因的获得为：通过Uniprot数据库进行靶标蛋白以及基因信息的校正，物种限定为“Home sapiens”，得到中药靶基因。

在上述方法中，优选地，步骤S2中，所述数据库包括GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、 DrugBank。

在上述方法中，优选地，步骤S3中，所述“利用String数据库构建PPI网络”具体为：利用String 数据库构建PPI网络，数据库选择Multiple Protein，导入中药组合物对治疗围绝经期综合征的潜在基因靶点，物种限定为“Home sapiens”，获取得到这些潜在基因靶点的蛋白质相互作用关系，并保存为“TSV”格式文件。

在上述方法中，优选地，步骤S4中，所述R 4.1.0软件上安装的程序包包括org.Hs.eg.db、 colorspace、stringi、ggplot2、DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview。

在上述方法中，优选地，步骤S5中，包括以下步骤：从Pubchem数据库下载中药组合物(例如女贞二仙合剂)-围绝经期综合征交集靶点对应的主要活性成分的2D结构，保存为“SDF”格式文件，基于Chem3D 18.0软件对筛选到的“SDF”文件进行3D结构生成及优化，保存为“mol2”格式的小分子配体文件。

在上述方法中，优选地，步骤S5中，还包括以下步骤：首先在Uniprot数据库中搜索核心靶点对应的蛋白ID，需要注意物种应为“Home sapiens”，再利用所得ID从PDB数据库下载“PDB”格式的蛋白受体3D文件，最后在Pymol 2.5.0软件中进行移除水分子等处理。

在上述方法中，优选地，步骤S5中，还包括以下步骤：将处理好的蛋白受体导入AutodockTools 1.5.6软件，经过加氢后保存为“PDBQT”格式文件，之后导入“mol2”格式的小分子配体文件，同样保存为“PDBQT”格式文件，然后设置网格点，并将参数保存并输出为“GPF”格式文件，最后使用AutodockVina 1.1.2软件进行小分子配体与蛋白受体对接，取打分最高的构象借助Pymol 2.5.0软件进行优化制图。

在上述方法中，优选地，所述中药组合物为女贞二仙合剂。

有益效果：

本发明网络药理学与分子对接技术证实了中药组合物(例如：女贞二仙合剂)通过作用围绝经期综合征的重要靶蛋白，本发明还对作用靶点的位置进行了归属，并绘制通路图，提示PI3K-AKT通路保护心肌细胞的作用，对中药组合物治疗围绝经期冠心病的机制进一步研究提供了方向。

从围绝经期冠心病中医治疗的优势和必要性以及实验研究显示：围绝经期冠心病主要病理改变为心脉痹阻，病位在心肾，病因与阴阳失调相关，治疗当以补肾通脉为原则，重在调补肾阴肾阳。本发明的分析结果表明，女贞二仙合剂可以通过调节PI3K-AKT信号通路来减少去卵巢大鼠心肌梗死后心肌重构，保护心功能。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。其中：

图1为本发明实施例提供的从GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank数据库中筛选出“围绝经期综合征”相关靶点的韦恩图；

图2为本发明实施例中得到的女贞二仙合剂的有效活性成分靶点与PS相关靶点的韦恩图；

图3为女贞二仙合剂的有效活性成分-作用靶点网络；

图4为女贞二仙合剂-围绝经期综合征交集靶点的PPI网络；

图5-1、图5-2、图5-3为图4所构建的PPI网络连续进行2次拓扑分析的靶点；

图6为GO功能富集柱状图；其中，横坐标轴表示富集数量，颜色表示显著性，P值越小，颜色越红；

图7为KEGG通路富集气泡图；其中，横坐标表示富集因素百分比，气泡大小表示富集靶点数，颜色越红表明P值越小；

图8为分子对接其中A-D.CASP3与女贞二仙合剂有效成分对接(A.Beta_sitosterol； B.Kaempferol；C.Luteolin；D.uercetin)；E.CXCL8与女贞二仙合剂有效成分对接(Quercetin)；F-G. IL6与女贞二仙合剂有效成分对接(F.Luteolin；G.Quercetin)；H-I.MAPK1与女贞二仙合剂有效成分对接(H：Luteolin；I：Quercetin)；J-M.TNF与女贞二仙合剂有效成分对接(J：Quercetin；K： Rutaecarpine；L：Quercetin；M：Rutaecarpine)；N-P.TP53与女贞二仙合剂有效成分对接(N：Diosgenin； O：Luteolin；P：Quercetin)；Q-S.VEGFA与女贞二仙合剂有效成分对接(Q：Diosgenin；R：Luteolin； S：Quercetin)；

图9为女贞二仙合剂对去卵巢大鼠大鼠体重的影响检测结果图；

图10为女贞二仙合剂对去卵巢大鼠术后11周和14周时，各组间子宫体质量对比图(图10中，横坐标按照从左到右的顺序排列，依次对应对照组、模型组、雌激素组、女贞二仙合剂低剂量组和女贞二仙合剂高剂量组)；

图11为女贞二仙合剂对去卵巢大鼠术后11周和14周时，各组间子宫组织结构染色(HE染色，放大倍数×100)结果图；

图12为女贞二仙合剂对去卵巢大鼠术后11周和14周时，各组间股骨组织结构染色(HE染色，放大倍数×100)结果图；

图13为女贞二仙合剂干预去卵巢大鼠心肌梗死后7天(术后11周)、28天(术后14周)的超声检测结果图(图13A、13B)；以及各组间不同时期心功能(图13D：心梗后7天；图13C：心梗后28天)检测结果图；***P(P＜0.001)；

图14为女贞二仙合剂干预去卵巢心肌梗死大鼠心肌梗死7天(左图，术后11周)和28天(右图，术后14周)的TCC染色结果图；

图15为女贞二仙合剂干预去卵巢心肌梗死大鼠心肌梗死7天(左图，术后11周)和28天(右图，术后14周)的心肌梗死面积统计图；图15的横坐标中，从左到右依次为对照组、模型组、雌激素组、低剂量组和高剂量组的统计结果柱状图；

图16为女贞二仙合剂保护去卵巢心肌细胞病理检查结果，其中A图心肌细胞病理HE染色(上图7天，下图28天，放大倍数×100)，B图为Masson染色(上图7天，下图28天，放大倍数×100)；

图17为女贞二仙合剂保护去卵巢大鼠心肌细胞超微结构(去卵巢大鼠2个月心肌梗死后7天， 28天放大倍数×20000，图17A为心肌梗死后7天的超微结构，为图17B为心肌梗死后28天的超微结构)；

图18为女贞二仙合剂保护去卵巢大鼠心肌细胞相关蛋白表达*P(P＜0.05)，图18A为Westernblot 电泳图，图18B为各蛋白的表达量对比图(图中，对应每个蛋白的柱状图中，横坐标按照从左到右的顺序排列，依次对应对照组、模型组、雌激素组、女贞二仙合剂高剂量组和女贞二仙合剂低剂量组)。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

“女贞二仙合剂”显著用于临床治疗围绝经期综合征，且已申请发明专利，在前期研究基础上发现女贞二仙合剂对冠心病、急性心肌梗死具有很好的保护作用，本发明通过构建女贞二仙合剂-围绝经期综合征相关靶点预测相关靶点通路，进而通过查阅文献、动物实验验证的方式验证其作用及机制。

本发明的基于网络药理学及分子对接分析中药组合物治疗围绝经期冠心病机制的方法，主要包括以下步骤：

步骤S1：女贞二仙合剂有效活性成分及靶点的查询和筛选

以女贞二仙合剂中主要的7味中药：酒女贞子、酒仙茅、炙淫羊藿、盐巴戟天、当归、盐黄柏、盐知母等作为关键词在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)中进行化学成分以及相应成分靶点的检索。口服生物利用度(OB)是经口服用的药物中所含有的有效成分或活性物质被生物体吸收到达体循环的速度与程度，类药性(DL)则是用以评价药物分子成药性高低的指标。结合文献研究，选取同时满足“OB≥30％”和“DL≥0.18”的化学成分作为潜在的有效活性成分共117个，映射出1863 个作用靶点。构建女贞二仙合剂活性成分数据集。通过Uniprot数据库进行靶标蛋白以及基因信息的校正(将基因的全称转换为symbol以便后续分析)，物种限定为“Home sapiens”(即物种限定为“人”)，得到中药靶基因。

步骤S2：构建围绝经期综合征(perimenopause syndome,PS)相关基因数据集

在五大常用数据库GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank数据库中输入检索词“perimenopause syndome”检索围绝经期综合征相关基因并进行整合取并集，去除重复并合并后共有 534个基因。将药物有效成分及疾病相关基因组结合，得出女贞二仙合剂与围绝经期基因合集共52个。

步骤S3：药物(中药组合物)-疾病的重要核心靶点及网络构建

将中药靶基因与疾病相关基因进行比对取交集，筛选出前述117个女贞二仙合剂活性成分与围绝经期综合征共同的基因靶点并绘制韦恩图。基于Cytoscape 3.8.0软件绘制“成分-靶点”的可视化网络图，从而得到有效活性成分与靶基因的靶向关系，得到了50个药效成分，可作用于52个围绝经期综合征的基因靶点，其中SCN5A、SER1、AR、PGR等基因与女贞二仙合剂中有效成分靶点显著相关(如图3)。利用String数据库构建PPI网络，数据库选择Multiple Protein，导入女贞二仙合剂对治疗围绝经期综合征的潜在52个基因靶点(交集靶点)，物种限定为“Home sapiens”，设置最低交互分数为0.400，同时隐藏网络中断开连接的节点，其余为默认设置，获取得到这些潜在基因靶点的蛋白质相互作用关系(Protein-Protein interaction,PPI)，并保存为“TSV”格式文件。之后将该TSV文件导入Cytoscape3.8.0 软件中，运用内置CytoNCA插件对PPI网络进行拓扑属性分析，对初始网络节点的中介中心性(BC)、接近中心性(CC)、点度中心性(DC)、特征向量中心性(EC)、局部平均连通性(LAC)以及网络中心性(NC)这六种参数进行打分，筛选出在所有参数中的分值均大于中位值的靶点并进行子网络创建，再次按照上述步骤二次筛选以进一步简化网络，通过2次拓扑分析，最终明确女贞二仙合剂治疗围绝经期综合征中CASP3、CXCL8、IL6、MAPK1、TNF、TP53和VEGFA等7个核心靶点。

本实验部分是将中药的有效活性成分整理合集后进行药物靶点的ID转换，得到中药的靶基因，同时通过五大数据库整理并合并出疾病的相关基因，通过软件将中药基因与疾病的基因靶点进行结合，构建出PPI网络。

步骤S4：GO功能和KEGG通路富集分析

在R 4.1.0软件上安装org.Hs.eg.db、colorspace、stringi、ggplot2、DOSE、clusterProfiler、enrichplot 以及pathview等程序包，将基因symbol(“基因信号”)转换为ID后，对女贞二仙合剂治疗围绝经期综合征的潜在靶点(交集靶点)进行GO(geneontology)及KEGG(KEGGpathway analysis)富集分析，以P＜0.05作为具有统计学差异的筛选条件且从小到大排列，筛选出前30条最具有统计学意义的GO功能和KEGG通路制作柱状图、气泡图以及关键信号通路图。

步骤S5：分子对接验证

通过构建PPI网络图，并通过两次拓扑分析后得到的药物-疾病核心靶点网络选择女贞二仙合剂关键活性成分，然后与重要核心靶点进行分子对接验证。从Pubchem数据库下载女贞二仙合剂-围绝经期综合征集靶点对应的主要活性成分的2D结构，保存为“SDF”格式文件，基于Chem3D 18.0软件对筛选到的“SDF”文件进行3D结构生成及优化(自由能最小)，保存为“mol2”格式的小分子配体文件。在蛋白受体文件的准备上，为增加检索的匹配性与准确性，首先在Uniprot数据库中搜索核心靶点对应的蛋白ID，需要注意物种应为“Homesapiens”，再利用所得ID从PDB数据库下载“PDB”格式的蛋白受体3D文件，最后在Pymol2.5.0软件中进行移除水分子等处理。

将处理好的蛋白受体导入AutodockTools 1.5.6软件，经过加氢后保存为“PDBQT”格式文件，之后导入“mol2”格式的小分子配体文件，同样保存为“PDBQT”格式文件，至此，受体和配体文件格式转换相一致。活性口袋大小定为40×40×40个网格点(注：IL6受体活性口袋大小为60×60×60， TP53则为80×80×80)，格点距离即Spaing值设置为1(注：CSCL8Spaing值为0.55)，将参数保存并输出为“GPF”格式文件。最后使用AutodockVina1.1.2软件进行小分子配体与蛋白受体对接，取打分最高的构象借助Pymol 2.5.0软件进行优化制图。

以上数据库网址详见表1。

表1：分析用数据库网址

本发明通过构建中药组合物(例如：女贞二仙合剂)的活性成分-作用靶点网络和蛋白相互作用网络，对靶点涉及的功能和通路进行分析，探讨女贞二仙合剂治疗围绝经期冠心病的作用机制。

本发明通过TCMSP数据库、文献挖掘和本实验室已有研究获取女贞二仙合剂主要活性成分，利用GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank数据库预测和筛选女贞二仙合剂活性成分治疗围绝经期冠心病的作用靶点。利用Cytoscape软件构建活性成分-作用靶点网络，利用String数据库和Cytoscape软件绘制蛋白相互作用网络，通过Systems DockWebSite对成分与靶点进行分子对接验证。并且，本发明采用DAVID数据库对靶点进行GO及KEGG通路分析，采用DisGeNET数据库对靶点所属类型进行归属。

本发明筛选得到女贞二仙合剂52个活性成分，涉及7个重要核心靶点。网络药理学分析结果表明：女贞二仙合剂主要涉及细胞过程、代谢过程、对应激的应答等生物过程，通过调节PI3K-AKT等信号通路来发挥治疗围绝经期冠心病作用。

本发明体现了女贞二仙合剂多成分-多靶点-多途径的作用特点，为进一步开展女贞二仙合剂治疗围绝经期冠心病作用机制的研究提供了新思路和新方法。

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明：首先详细介绍基于网络药理学及分子对接分析女贞二仙合剂治疗围绝经期冠心病机制的方法，然后通过去卵巢大鼠模型对分析得到的治疗围绝经期冠心病的机制进行实验验证。

(一)机制研究

1女贞二仙合剂治疗围绝经期冠心病的机制分析

1.1女贞二仙合剂有效活性成分及靶点的查询与筛选

使用TCMSP数据库进行检索，以OB≥30％，DL≥0.18为标准筛选出女贞二仙合剂潜在的有效活性成分共117个，其中：20个来源于盐巴戟天、2个来源于当归、37个来源于盐黄柏、13个来源于酒女贞子、7个来源于酒仙茅、23个来源于炙淫羊藿、15个来源于盐知母。

与此同时，将这7味中药的有效活性成分的靶点信息全部导出，共收集到1863个药物靶点，其中：盐巴戟天145个、当归69个、盐黄柏510个、酒女贞子352个、酒仙茅88个、炙淫羊藿511个和盐知母188个。

1.2女贞二仙合剂与围绝经期冠心病的靶点交集分析

在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank数据库中用疾病名称“Perimenopausal syndrome”进行检索整合，去除重复后可得到534个与PS相关的靶点，即疾病靶点，见图1，其中 TTD数据库未检测到疾病相关靶点存在。

将1.1中的药物靶点与上述疾病靶点取交集，筛选出52个女贞二仙合剂治疗围绝经期综合征靶点，即交集靶点，见图2。

1.3复方调控网络及PPI网络的构建

将中药的有效活性成分及其交集靶点信息导入Cytoscape 3.8.0软件，构建“有效活性成分-作用靶点”网络图，见图3，有效活性成分以圆圈形式位于靶点左侧，获得成分-靶点的对应关系。从图3中可以看出，女贞二仙合剂中往往一个有效活性成分可作用于多个靶点，同时大多数靶点也与多种活性成分相连，体现了这些成分在治疗PS中的协同或累加效应。女贞二仙合剂能够通过50个有效活性成分，作用于52个靶点达到治疗PS的作用，说明女贞二仙合剂治疗PS具有多成分、多靶点的综合调节特征。将上述192个药物-疾病共同靶点上传至String数据库进行分析，构建了PPI网络图，见图4。由于单独孤立的蛋白与其它蛋白无相互作用，故不在蛋白互作网络中体现，因此该网络包含有68个节点，节点间具有相互作用关系的边457条。

利用Cytoscape 3.8.0软件内置插件CytoNCA对PPI网络进行拓扑属性分析，选取在中介中心性 (BC)、接近中心性(CC)、点度中心性(DC)、特征向量中心性(EC)、局部平均连通性(LAC) 以及网络中心性(NC)这6个参数中均大于中位值的初始网络节点作为核心靶点，连续进行2次拓扑分析后，共筛选得到7个重要核心靶点，核心靶点即两次筛选得到的中药核心靶点依次见图5-1、图 5-2、图5-3，具体包括CASP3、CXCL8、IL6、MAPK1、TNF、TP53和VEGFA使用AutodockVina 进行分子对接。

1.4 GO功能与KEGG通路的富集分析

对筛选到的药物-疾病共同靶点进行GO和KEGG分析，如图6、图7所示。GO分析(柱状图) 中横坐标轴表示富集数量，颜色表示显著性，P值越小，色调越红，相反，P值越大，色调越蓝。我们一共得到1790个富集条目(P＜0.05)，重要靶点的基因功能聚集数据表明，生物过程中发生明显富集(1692个条目)，包括对脂多糖的反应(response tolipopolysaccharide)、对细菌源分子的反应 (response to molecule ofbacterialorigin)、类固醇代谢过程(steroidmetabolic process)、多细胞生物过程(multi-multicellular organismprocess)、上皮细胞增殖(epithelial cellproliferation)等。细胞组分富集条目24个，包括脂筏(membrane raft)、膜微结构域(membranemicrodomain)、囊泡腔(vesicle lumen)等。分子功能富集条目74个，则包括细胞因子受体结合(cytokine receptorbinding)、细胞因子活性(cytokine activity)、受体配体活性(receptor ligand activity)、信号受体激活器活性(signaling receptor activatoractivity)等(图6)。

KEGG分析(气泡图)中横坐标表示富集因素百分比，气泡大小表示富集靶点数，颜色上同柱状图相一致，越红表明P值越小。192个交集靶点共涉及128条通路(P＜0.05)，其中比较重要的通路有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signalingpathway indiabetic complications)、脂质和动脉粥样硬化(Lipid andatherosclerosis)、人巨细胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection) 和PI3K-Akt信号通路(PI3K-Aktsignalingpathway)等(图7)。

1.5分子对接验证

再次从Uniprot数据库中搜索上述药物-靶点网络中基因靶点所编码的蛋白结构，同时从Pubchem 数据库下载上述药物-靶点网络中的药物主要活性成分的2D结构，用Chem3D 18.0软件将2D结构以最小能量转化为3D结构并导出，在Pymol 2.5.0软件中进行受体蛋白脱水、AutodockTools 1.5.6软件中进行蛋白氢化以及电荷计算，最后利用AutodockVina将受体蛋白与女贞二仙合剂活性化合物的小分子配体对接，见图8、图9。具体来说，从Pubchem数据库下载主要活性成分的2D结构后，在 Uniprot数据库中搜索核心靶点对应的蛋白ID，再利用所得ID从PDB数据库下载“PDB”格式的蛋白受体3D文件，最后在Pymol2.5.0软件中进行移除水分子等处理。以蛋白氢化以及电荷最小为条件，通过分子对接发现，女贞二仙合剂对药物-靶点网络中基因靶点所编码的蛋白有很好的亲和性。

结果显示CASP3与β-谷甾醇、山奈酚、木犀草素和槲皮素药物小分子对接；CXCL8与槲皮素对接；IL-6与木犀草素和槲皮素对接；MAPK1与木犀草素和槲皮素对接；TNF与山奈酚、木犀草素、槲皮素和吴茱萸次碱对接；TP53与薯蓣皂苷元、木犀草素和槲皮素对接；VEGFA薯蓣皂苷元与木犀草素和槲皮素对接，详见表2。

表2：蛋白受体与药物小分子对接及有效成分来源

综上所述，网络药理结果显示女贞二仙合剂的117个活性成分作用于534个靶点，经过富集分析构建出复合调控网络，得出了女贞二仙合剂中有50个药效成分，可作用于52个围绝经期综合征的基因靶点，涉及多种过程、分子和通路，体现了女贞二仙合剂-多靶点-多途径的作用特点，上述结果与文献报道基本一致。本发明通过蛋白相互作用网络证实了女贞二仙合剂治疗围绝经期综合征作用的 CASP3、CXCL8、IL6、MAPK1、TNF、TP53和VEGFA等7个重要靶蛋白，并对其进行了分子对接验证，一方面从某种程度上验证了网络药理学测靶点的可靠性，另一方面为后续进一步验证奠定了基础。此外，本发明还对作用靶点的位置进行了归属，并绘制通路图，提示PI3K-AKT通路的作用，对女贞二仙合剂治疗围绝经期冠心病的机制进一步研究提供了方向。

(二)动物实验

本发明优选实施例中，围绝经期冠心病采用去卵巢大鼠心肌梗死模型模拟得到。

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。

1.实验材料

1.1实验动物

SD雌性大鼠130只，体重在170-200g/只，来源于辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001，实验动物质量合格证号：No.210726200100228968，饲养在新乡医学院第一附属医院生命科学研究中心，自由饮食、饮水。

1.2实验用药

女贞二仙合剂，由新乡医学院第一附属医院中药制剂室制备；戊酸雌二醇片，购自拜尔医药保健有限公司(614A)；羧甲基纤维素钠，上海阿拉丁生化科技股份有限公司(C104986)。

1.2.1实验药品制备

(1)女贞二仙合剂配伍及浓度：

下述制备女贞二仙合剂的过程中各原料的来源：酒女贞子、酒仙茅、盐巴戟天、当归、盐黄柏和盐知母购自河南省修之合药业有限公司；酒仙茅购自河南百缘康药业有限公司；炙淫羊藿购自河北庆源堂中药科技有限公司。药物由新乡医学院第一附属医院自制而成，药液放置于4℃冰箱保存。灌胃给药量：低剂量组：0.84g/mL/100g(每100g体重大鼠灌胃1mL溶液，每1mL溶液含0.84g女贞二仙合剂)；高剂量组：1.68g/mL/100g。

女贞二仙合剂采用包括下述重量份的中药原料制备得到：酒女贞子6-30份、仙茅/酒仙茅3-15份、炙淫羊藿3-15份、盐巴戟天3-15份、当归6-18份、盐黄柏3-12份和盐知母6～12份。

女贞二仙合剂的具体制备方法如下：将酒女贞子200g、酒仙茅100g、炙淫羊藿100g、盐巴戟天 100g、当归100g、盐黄柏60g、盐知母60g等7味药材加水煎煮2次(10倍，8倍：1.5h/次；即第一次煎煮时加入酒女贞子、酒仙茅、炙淫羊藿、盐巴戟天、当归、盐黄柏和盐知母总质量10倍的水，煎煮1.5h，过滤，得到第一煎液；第二次煎煮时，加入酒女贞子、酒仙茅、炙淫羊藿、盐巴戟天、当归、盐黄柏和盐知母总质量8倍的水，煎煮1.5h，过滤，得到第二煎液)。合并第一煎液、第二煎液，滤过，滤液浓缩至2000mL，放出，静置冷藏，取上清液继续浓缩至950mL，加环拉酸钠2g，羟苯乙酯0.5g份充分搅拌均匀，调整总量为1000mL(加饮用水)，灌封，消毒即得。女贞二仙合剂为棕褐色至黑棕褐色的液体，气微香、味微苦。

(2)戊酸雌二醇片：每次取出雌二醇片18片，以研钵研磨碎，以0.5％羧甲基纤维素钠定容至 200mL，放置于4℃冰箱保存。灌药量：0.09mg/mL/100g

(3)0.5％羧甲基纤维素钠：取5g羧甲基纤维素钠粉末置于2L烧杯中，以无菌水定容至1L，充分混匀，置于4℃冰箱保存。

1.3：实验所用主要试剂(盒)

表3：实验所用主要试剂一览

1.4主要试剂制备

(1)细胞裂解液：取1960μL RIPA裂解液置于干净EP管中，再加入蛋白酶抑制剂(×100)、磷酸酶抑制剂(×100)各20uL充分混匀。(2)TBST：分别称取NaCl 8g、KCl 0.2g、Tris3g、Tween20 1mL置于2L烧杯中，定容至1L，充分混匀，置于4℃冰箱保存。(3)一抗抗体：分别取WB一抗稀释液10000、5000、5000μL置于15mLEP管中，再分别加入GAPDH、PI3K、P-Akt抗体2μL、5μL、 5μL，充分混匀，置于-20℃冰箱保存。(4)二抗抗体：取上述TBST溶液16mL置于25mLEP管中，再加入二抗试剂2μL充分混匀，置于-20℃冰箱保存。(5)电泳液：分别称取Tris3.02g、Gly 14.4g、 SDS 1g置于2L烧杯中，定容至1L，充分混匀，置于4℃冰箱保存。(6)转膜液：分别称取Tris 3.02g、 Gly 14.4g、甲醇200mL置于2L烧杯中，定容至1L，充分混匀，置于4℃冰箱保存。(7)显影液：分别吸取A、B液1mL，置于3mL EP管中，充分混匀，即用即配。(8)5％BSA：称取BSA粉末0.5g 置于烧杯中，加入10mL上述TBST溶液，充分混匀，置于-20℃冰箱保存。

(9)5％脱脂奶粉：称取脱脂奶粉5g，加入100mL上述TBST溶液，充分混匀，即用即配。(10)10％水合氯醛：称取10g水合氯醛结晶，用无菌水定容至100mL，配置成10％浓度，放置4℃冰箱避光保存。

1.5主要实验设备

表4：实验所用设备一览

1.6统计分析

用SPSS 25.0软件对数据进行分析处理，所有数据以x±s表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验，符合条件者多组间比较采用单因素方差分析，若方差不齐则采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2动物实验

2.1动物分组：SD雌鼠共130只，通过随机区组设计将大鼠分为“对照组，模型组、雌激素组、女贞二仙低剂量组、女贞二仙高剂量组，大鼠均自由获取水和食物，并固定于每日早上6-7时按照体重及各组药物完成灌胃(对照组、模型组灌用等同体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液)。

2.2去卵巢大鼠模型建立：(1)抓取SD大鼠，以10％乌拉坦(7mL/kg)腹腔麻醉后仰卧，腹部脱毛。(2)在无菌条件下于腹股沟水平沿腹中线剪开皮肤及肌层，暴露腹腔。(3)分离子宫并摘除卵巢，清理伤口后分两层缝合皮肤及肌层，待大鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察大鼠状态及死亡情况并做好记录。(4)术后3天，每只大鼠每天皮下注射4万单位青霉素，防止感染。(5)对照组仅摘除卵巢周围约1g脂肪，而保留卵巢，其余处理相同。

2.3去卵巢心肌梗死模型建立：(1)在去卵巢大鼠模型的基础上构建去卵巢心肌梗死模型，抓取去卵巢8周大鼠，以10％乌拉坦(7mL/kg)腹腔麻醉后仰卧，胸部脱毛。(2)经口气管插管连接呼吸机，呼吸机参数：潮气量60mL，呼吸频率50次/分。(3)消毒，在SD大鼠心脏部位第3，4肋间隙位置沿着腋窝与胸骨下端连线做一1.5cm的切口。(4)以左心耳下缘水平线为标志，在线下2mm 处以4-0proline丝线结扎冠脉，进针深度1mm左右，避免刺破心脏(假手术组只穿线不结扎)。(5) 结扎完毕，可见左心室前壁颜色由鲜红变为暗紫至苍白色，心电图提示ST段抬高，快速将心脏推入胸腔。(6)挤出胸内气体，关胸缝合。术后3天，每只大鼠每天皮下注射4万单位青霉素，防止感染。

2.4取材方式及样本的存放：(1)心脏、子宫、股骨(HE染色、Masson染色)：麻醉处死SD 大鼠后打开腹腔、胸腔，找到细长的子宫、球形的心脏，并将双侧股骨剥离出并称重后置于4％多聚甲醛溶液中。(2)心肌超微结构：按照上述方式取出心脏后剪取心尖区域心脏组织放置于电镜保存液 (2％戊二醛)中。(3)心脏(Westernblot)：按照上述方式取出心脏清洗后立即放置于-80℃超低温冰箱冻存，备用。

2.5考察女贞二仙合剂的影响：

2.5.1女贞二仙合剂对大鼠体重的影响：在检疫期后，通过随机区组设计将130只SD大鼠分为对照组、模型组、雌激素组、低剂量组、高剂量组。灌胃给药，每日1次，每周称取大鼠体重，实验数据表明0周组间大鼠体重无统计学意义(P＞0.05)；在行去卵巢摘除术后11周时与对照组比较，模型组体重呈明显上升趋势(P＜0.001)，女贞二仙合剂组未改善这一趋势(与对照组平均值差值：低剂量组：53.99g；高剂量组：47.13g；模型组：48.82g，P＜0.001)，行去卵巢摘除术后14周时体重情况与第11周大致相同(与对照组平均值差值：低剂量组：54.60g；高剂量组：49.89g；模型组：57.31g， P＜0.001，详见表5-6、图9)。

表5：各组大鼠体重变化(g)

表6：各组大鼠体重变化(g，)

注与对照组比，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

2.5.2女贞二仙合剂对子宫的影响：本发明在第11周和第14周(心梗术后1周、4周)将大鼠处死，并取出子宫进行称重及子宫宫体HE染色。与对照组比较，模型组大鼠子宫的大体标本出现明显变细、萎缩，而女贞二仙合剂组子宫大体形态与模型组无明显差异。与对照组相比，模型组子宫重量显著降低(P＜0.05)；与模型组相比，女贞二仙合剂各组未能显著改善因去卵巢所致的大鼠体重增加、子宫萎缩、子宫重量降低(详见表7、图10)。

表7：各组大鼠子宫重量

与对照组相比(^*P＜0.05；^**P＜0.01；^***P＜0.001)；与模型组相比(^#P＜0.05；^##P＜0.01；^###P＜0.001)；与雌激素组相比(^ΔP＜0.05；^ΔΔP＜0.01；^ΔΔΔP＜0.001)

子宫HE染色结果显示，对照组子宫的腺体数量明显多于其余4组，且腺体大小均一，分布均匀，去卵巢模型组的大鼠子宫腺体减少、融合、扩大；对照组与雌激素组的大鼠子宫细胞间质较为均匀，模型组、女贞二仙合剂各组的子宫细胞间质细胞增生、胶原纤维增生、部分腺体萎缩、腺体处于非分泌状态、子宫小血管增生(详见图11)。

2.5.3女贞二仙合剂对股骨的影响：女贞二仙合剂具有改善股骨病理学的作用。第11、14周后行 HE染色结果显示：摘除卵巢后大鼠股骨的骨小梁数量减少，骨小梁连续性大多数中断，间质细胞充盈。女贞二仙合剂组及雌激素组大鼠的股骨，骨小梁的形态较模型组显著改善(详见图12)。

2.5.4女贞二仙合剂对心脏的影响：本发明对去卵巢大鼠运用女贞二仙合剂干预8周后，结扎去卵巢大鼠心脏左前降支构建心肌梗死模型，术后继续运用女贞二仙合剂干预7天、28天，由于心梗后7 天为心肌梗死急性期，28天为心肌梗死陈旧期。因此，本实验通过动态检测去卵巢心肌梗死心功能，分析组织病理学，明确女贞二仙合剂干预去卵巢心肌梗死大鼠的作用。

2.5.5.1心功能：

结果显示，在去卵巢8周心梗后7天，与对照组相比，各组的左室射血分数有显著下降趋势(与对照组平均值差值：雌激素组：45.83％；模型组：51.82％；低剂量组：37.37％；高剂量组：57.81％， P＜0.001)，与模型组相比，雌激素、女贞二仙合剂各组心功能无明显改善(P＞0.05)，参照图13A 和图13D。在心梗后28天时，结果显示心肌梗死会导致大鼠左室射血分数降低(P＜0.001)，但女贞二仙合剂低剂量的大鼠心功能得到显著改善(平均值差值：21.38％，P＝0.025，图13B、图13C)。

2.5.5.2 TTC染色：

TTC染色结果显示，与模型组比较，女贞二仙合剂组均能显著改善去卵巢大鼠心肌梗死面积。详见说明书附图图14。

其中，TCC染色与分析的具体方法如下：(1)将取出的心脏放置-20℃冰箱中速冻20分钟左右； (2)待心脏速冻，迅速取出置于冰上从结扎线以下至心尖部位进行切片，间隔2mm；(3)将切片置于2％TTC溶液中，置于入37℃水浴锅15min；(4)取出切片后吸干多余水分，放置于4％多聚甲醛中固定6h，运用相机进行拍摄；(5)将各个TTC染色心脏图片导入Image-J，以三色光算出各个心脏梗死面积并进行统计(统计结果如图15所示)。

TTC染色结果显示，与模型组比较，女贞二仙合剂组均能显著改善去卵巢大鼠心肌梗死面积。详见说明书附图图14。结果显示，在心肌梗死7天时，与模型组相比，雌激素组、女贞二仙合剂低剂量组及女贞二仙合剂高剂量组的心肌梗死面积均未得到明显改善(P＞0.05)；在心肌梗死28天时，女贞二仙合剂低剂量组的心肌梗死面积较7天时有明显的改善。其余行心梗手术大鼠的心肌梗死面积组间无统计学差异(P＞0.05)。

2.5.5.3 HE与MASSON染色：

(1)HE染色

结果显示，与对照组比较，模型组心梗区域心肌厚度减少，大量的炎性细胞浸润，心肌细胞细胞核消失，残余心肌细胞肿胀；与模型组比较，各给药组给药7天，明显减少炎细胞浸润以及心梗区域心肌肿胀程度，雌激素组与女贞二仙合剂组之间未见明显差异。

去卵巢大鼠心肌梗死28天后，与对照组比较，模型组心肌细胞少量炎性细胞浸润，心肌细胞密度下降；与模型组比较，各给药组的心肌梗死区域存活心肌细胞数量增加，炎性细胞明显减少。

相比心肌梗死后7天的HE结果，心梗后28天各组间的心肌梗死区域较急性期时炎性浸润明显减少，细胞间隙扩大；其中模型组左心室明显扩大，梗死区域心肌厚度明显减少；与模型组相比，各给药组心肌梗死区域中，心肌细胞面积增加，炎性细胞分布较为聚集，并分布于坏死区域及正常心肌细胞周围(图16A)。

(2)Masson染色

Masson染色显示，去卵巢大鼠心肌梗死7天后对照组心肌细胞排列紧密，无过多心肌纤维组织浸润；与对照组相比，模型组心肌梗死区域纤维化明显，其中掺杂大量炎性细胞，且胶原纤维向正常组织渗透单位面积心肌细胞数量减少。相比模型组，各给药组心肌纤维组织向心肌细胞内渗透的程度低，心肌细胞密度较模型组高。

去卵巢大鼠心肌梗死28天后，Masson染色结果显示，对照组未见明显心肌纤维化；与对照组相比，模型组心肌梗死区域纤维化明显，并向正常心肌细胞间渗透；相比模型组，各给药组同样观察到心肌纤维组织的渗透程度减低。

相比心肌梗死后7天的Masson染色结果，心梗后28天时，各组间心梗区域纤维化更加明显，且行心梗手术的四组均出现胶原纤维和心肌细胞交叉出现，以模型组及雌激素组为重，相比较而言，女贞二仙合剂可以明显改善心肌细胞纤维化向正常心肌细胞间的渗透(图16B)。

HE染色的具体方法为：(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I10min-二甲苯Ⅱ10min- 无水乙醇I5min-无水乙醇Ⅱ5min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。(2)苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。(3)伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。(4)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇I5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯 I5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。(5)显微镜镜检，图像采集分析。

Masson染色具体方法为：组织固定于Bouin氏液，流水冲洗一晚，常规脱水包埋：首先切片脱蜡至水：(1)二甲苯中脱蜡10min×3次，用吸水纸吸干液体。(2)100％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体。(3)95％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体。(4)流水2min，用吸水纸吸干水分。然后，Weiger氏铁苏木素染5-10min。流水稍洗。0.5％盐酸酒精分化15s。流水冲洗3min。丽春红酸性品红液染8min。蒸馏水稍冲洗。1％磷钼酸水溶液处理约5min。不用水洗，直接用苯胺蓝液或亮绿液复染 5min。1％冰醋酸处理1min。95％乙醇脱水5min×2次，用吸水纸吸干液体。100％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体。二甲苯中透明5min×2次，用吸水纸吸干液体。中性树胶封片。

2.5.5.4心肌细胞微观结构：

本发明通过对去卵巢大鼠心肌梗死区域心肌细胞微观结构分析，在心肌梗死后7天(图17A)时，与对照组相比，模型组的心肌细胞线粒体体型减小、数量增多、肿胀，嵴断裂；相较于模型组，各给药组的心肌的线粒体体积较大，嵴较为清晰，可见线粒体分裂，这种现象在雌激素组最为明显。

在心肌梗死后28天(图17B)后，模型组中心肌梗死区域的线粒体稀数，可观察到被巨噬细胞吞噬的已经模糊不清的线粒体；各给药组线粒体排列紊乱，体积较心梗后7天时缩小，但数量增加，线粒体结构较为清楚，其中雌激素组的线粒体排列整齐，线粒体结构清楚。由此对于线粒体的保护功能，雌激素组要优于女贞二仙合剂组(图17)。

2.5.5.5 Western blotting：

上述结果显示女贞二仙合剂可以改善去卵巢大鼠心肌梗死区域炎症细胞浸润、减少心肌纤维化、保护心功能，本发明通过Westernblot技术分析进一步分析了女贞二仙合剂干预去卵巢大鼠心肌梗死组织中CXCL8、MAPK1、TNF、PI3K及p-Akt蛋白水平。

结果显示，与对照组相比，模型组大鼠心脏组织中CXCL8(IL-8)、TNF、PI3K及p-AKT的含量较对照组增加，表明心肌梗死后心肌细胞内的CXCL8(IL-8)、TNF、PI3K及p-AKT表达量增加 (P＜0.05)。和心肌梗死模型组对比，女贞二仙合剂低剂量组大鼠心脏组织中IL-8、TNF有下降趋势，其中IL-8显著下降(P＜0.05)，女贞二仙合剂可能作用于炎性通路保护心肌梗死后心肌损伤；且女贞二仙合剂各组大鼠心脏中的PI3K及p-AKT的水平较模型组有下降趋势，p-AKT的水平明显降低(P＜0.05)(图18)。

Western blot分析方法按照下述步骤进行：

提取蛋白：(1)取心脏梗死边缘区细胞通过PBS洗涤并抽提细胞裂解液，用移液器将细胞碎片和裂解混合液移至1.5mL离心管中，在4℃预冷的离心机，以12000r/min，离心15min。将上清液转移至新的EP管中，即为提取的总蛋白。(2)取96孔板，开始制作标准曲线：依次加入(0、2、4、 6、8、10、14、16、20μL)的标准蛋白溶液(BSA)，PBS补齐每孔至20μL。(3)制作蛋白样品：取出2μL蛋白样品+18μL PBS混匀。(4)在标曲和蛋白样品中加入配好的BCA工作液，每孔200μL。并置于37℃恒温箱中孵育30min。(5)使用酶标仪检测样品在A570nm处的OD值，用EXCLE软件将检测的标准品OD值算出标准曲线。(6)根据规定的上样量计算出样品的蛋白体积、裂解液体积、 5×buffer的体积。(7)制备好后用封口膜封口，沸水中煮10min，室温冷却等待上样或分装后置于-80℃冰箱中保存。

Western blot：(1)配胶：清晰并按要求组装配胶板，加入纯水观察有无漏液来判断组装是否牢固，检查完将纯水倒掉。配制分离胶，用移液器吸到组装好的板子里，用异丙醇封口，室温下放置30 min，待分离胶凝固后倒掉异丙醇，用滤纸吸干残余异丙醇，配制上层胶，插上15孔的梳子，室温下放置30min。(2)上样：从﹣80℃冰箱中取出已定量变性的蛋白样品解冻。用电泳夹夹好玻璃板，在两板之间加入配制好的电泳液，均速拔出梳子，用20ul的枪头上样，先上marker 5uL，再上蛋白，剩余用1×loading buffer补齐。若蛋白样品数量较少，剩余孔加入1×loading Buffer，保证每孔上样的体积一致。(3)电泳：将剩余的电泳液倒入电泳槽中，以70V电压电泳30min，待marker分开后换 100V电压电泳90min左右直到蓝色条带至胶的底部时，停止电泳。(4)转膜：电泳结束后用专用的板慢慢撬开玻璃板，切掉上层胶，根据目的蛋白位置可切部分下层胶。准备所需的PVDF膜，用甲醇浸泡。准备“三明治”夹子，从下往上以“黑-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵”的顺序放好，且各层之间无气泡。放入转膜夹，并倒入充分预冷的转膜液，放入冰晶，并将整个电泳箱置入冰中。以100V电压转膜60min。(5)封闭：非磷酸蛋白使用5％的脱脂牛奶，使用5％BSA封闭1h。(6)洗膜：根据所需的蛋白分子量画好剪膜图，用配制好的TBST溶液在摇床上洗3遍，每遍10min。根据蛋白分子量大小剪好膜，放入TBST中，保持PDVF膜湿润。(7)一抗孵育：按照说明书使用一抗稀释液配制一抗，加入到对应的PVDF膜中，放4°摇床上孵育过夜。(8)二抗孵育：回收一抗，用TBST清洗 PVDF膜3遍，每遍10min。加入配制好的二抗室温孵育1h。完成后回收二抗，再次用TBST溶液洗膜三次，每次10min。(9)曝光：按A液：B液＝1：1比例配置显影液，均匀滴在待曝光膜上，用曝光仪进行曝光，内参一般0.1～0.3s足够，其它可选Auto自动检测最佳曝光时间。(10)分析：将图片导入Image-J，算出各个条带的灰度值，以SPSS计算差异，以GraphPad作图。

3.研究结果分析

本发明研究显示，女贞二仙合剂能够通过PI3K-AKT信号通路保护去卵巢大鼠心肌组织，改善心功能。

研究结果显示去卵巢大鼠引起雌激素依赖性的子宫重量减少、体重增加，与Janas等人的实验结果相同，且HE结果提示子宫腺体减少、间质增加以及胶原纤维增生，也证实了卵巢功能丧失所带来的危害。大鼠体重从第三周开始，正常大鼠与除了补充雌激素的其余三组摘除卵巢的大鼠出现了组间差异，同样与Wegorzewska等人的实验结果一致，这种现象的出现可能与雌激素通过下丘脑调节胰岛素的敏感性、调节胰岛素分泌，从而影响外周脂肪组织有关。

女贞二仙合剂能够保护心梗后心肌组织。本实验通过结扎去卵巢大鼠前降支构建心肌梗死模型，结果显示心肌梗死区域内的心肌细胞、炎性细胞的状态各不相同。心梗急性期时HE及Masson染色发现，饲养雌激素及女贞二仙合剂的SD大鼠，明显减少炎细胞浸润的程度、心梗区域心肌肿胀程度以及纤维化向心肌细胞内渗透的程度，心肌细胞密度相比较高；在心梗陈旧期，喂养雌激素组及女贞二仙合剂的大鼠，心梗区域心肌细胞面积增加，炎性细胞分布较为聚集，且饲养女贞二仙合剂的两组SD 大鼠心肌细胞纤维化的边界更加清楚。各组间心肌细胞纤维化程度各不相同，且心功能有明显统计学意义，通过比较组间心功能发现女贞二仙合剂低剂量组在心梗急性期时较模型组有好转趋势，在陈旧期时出现统计学差异。心肌梗死后会引起心功能的下降，其主要原因可能是因为心肌细胞数量的减少、无收缩能力的纤维组织增生以及心肌细胞凋亡的共同结果。相关研究表明，雌激素可以通过抑制RASS 系统和交感神经系统，改善去卵巢大鼠的心功能及心肌纤维化程度。

PI3K/AKT通路对细胞生长、转移、存活、代谢等生物学过程是不可或缺的。本发明实验结果显示，心梗后PI3K、p-AKT的表达量增加，这与RuanY等人的实验结果一致，且增强PI3K/AKT信号通路的活性可能是其参与心肌纤维化的机制之一。本发明实验结果显示，饲养女贞二仙合剂低剂量的大鼠，在心梗后p-AKT的表达量降低，表明女贞二仙合剂可能是通过调PI3K/AKT通路，从而改善去卵巢大鼠急性心肌梗死后心功能的。相关研究表明，通过抑制PI3K/AKT信号通路，可以下调炎性细胞因子水平，从而保护心肌细胞；抑制PI3K/AKT通路可降低糖尿病性心肌病模型中PI3K、AKT的表达，从而阻碍心肌纤维化的进展。相反PI3K/AKT通路的激活与心肌损伤密切相关，甚至加重急性心梗后心肌细胞损伤。通过抑制PI3K/AKT通路可显著提高caspase系列蛋白的活性，减少心肌细胞的凋亡。

本发明的主要结果是女贞二仙合剂通过调节PI3K-AKT信号通路改善心肌梗死后心功能。

综上所述，本发明结合围绝经期冠心病主要发生机制，通过对去卵巢大鼠心肌梗死模型的建立，发现女贞二仙合剂可以通过调节PI3K-AKT信号通路来抗去卵巢大鼠心肌梗死后心肌重构、保护心功能。

4.结论

基于中医理论组方女贞二仙合剂可通过减少PI3K-AKT信号通路，减少心肌纤维化、保护心肌细胞，从而保护心肌梗死后心功能。本发明研究结果显示基于中医理论组方女贞二仙合剂为围绝经期冠心病临床治疗的候选药物。

Claims (10)

1.一种基于网络药理学及分子对接分析中药组合物治疗围绝经期冠心病机制的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：中药组合物有效活性成分及靶点的查询和筛选

以中药组合物中主要中药作为关键词在数据库与分析平台中进行化学成分以及相应成分靶点的检索，选出有效活性成分，构建中药组合物的活性成分数据集，并进一步得到中药靶基因；

步骤S2：构建围绝经期综合征相关基因数据集

在多个数据库中检索与围绝经期综合征相关基因然后取并集，得到围绝经期综合征相关基因数据集；

步骤S3：中药组合物-围绝经期综合征的重要核心靶点及网络构建

将中药靶基因与疾病相关基因进行比对取交集，筛选出步骤S1中的有效活性成分与围绝经期综合征共同的基因靶点，基于Cytoscape 3.8.0软件绘制“成分-靶点”的可视化网络图，从而得到有效活性成分与靶基因的靶向关系，确定作用的靶点，利用String数据库构建PPI网络，然后对所述靶点进行多次拓扑分析，得到所述中药组合物治疗围绝经期综合征的重要核心靶点；

步骤S4：GO功能和KEGG通路富集分析

在R 4.1.0软件上将基因信号转换后对所述中药组合物治疗围绝经期综合征的潜在靶点进行GO及KEGG富集分析，筛选出前30条最具有统计学意义的GO功能和KEGG通路制作柱状图、气泡图以及关键信号通路图；

步骤S5：分子对接验证

通过步骤S3中构建的网络选择重要组合物的关键活性成分，然后与所述重要核心靶点进行分子对接验证。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述“选出有效活性成分”为：通过口服生物利用度和类药性进行选择，所述口服生物利用度在30％以上，所述类药性在0.18以上。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述中药靶基因的获得为：通过Uniprot数据库进行靶标蛋白以及基因信息的校正，物种限定为“Home sapiens”，得到中药靶基因。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述数据库包括GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，所述“利用String数据库构建PPI网络”具体为：利用String数据库构建PPI网络，数据库选择Multiple Protein，导入中药组合物对治疗围绝经期综合征的潜在基因靶点，物种限定为“Home sapiens”，获取得到这些潜在基因靶点的蛋白质相互作用关系，并保存为“TSV”格式文件。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4中，所述R 4.1.0软件上安装的程序包包括org.Hs.eg.db、colorspace、stringi、ggplot2、DOSE、clusterProfiler、enrichplot、pathview。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中，包括以下步骤：从Pubchem数据库下载中药组合物-围绝经期综合征交集靶点对应的主要活性成分的2D结构，保存为“SDF”格式文件，基于Chem3D 18.0软件对筛选到的“SDF”文件进行3D结构生成及优化，保存为“mol2”格式的小分子配体文件。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中，还包括以下步骤：首先在Uniprot数据库中搜索核心靶点对应的蛋白ID，需要注意物种应为“Home sapiens”，再利用所得ID从PDB数据库下载“PDB”格式的蛋白受体3D文件，最后在Pymol 2.5.0软件中进行移除水分子等处理。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5中，还包括以下步骤：将处理好的蛋白受体导入Autodock Tools 1.5.6软件，经过加氢后保存为“PDBQT”格式文件，之后导入“mol2”格式的小分子配体文件，同样保存为“PDBQT”格式文件，然后设置网格点，并将参数保存并输出为“GPF”格式文件，最后使用Autodock Vina 1.1.2软件进行小分子配体与蛋白受体对接，取打分最高的构象借助Pymol 2.5.0软件进行优化制图。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其特征在于，所述中药组合物为女贞二仙合剂。

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