CN115814017A - 女贞二仙合剂在制备预防或治疗围绝经期冠心病药物中的应用 - Google Patents
女贞二仙合剂在制备预防或治疗围绝经期冠心病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及女贞二仙合剂在制备预防或治疗围绝经期冠心病药物中的应用。所述女贞二仙合剂采用包括下述重量份的原料制备得到：酒女贞子6‑30份、酒仙茅3‑15份、炙淫羊藿3‑15份、盐巴戟天3‑15份、当归6‑18份、盐黄柏3‑12份和盐知母6～12份。本发明有助于促进研究女贞二仙合剂成果转化为临床应用，同时为中西医结合防控PMCHD提供新策略。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及女贞二仙合剂在制备预防或治疗围绝经期冠心病药物中的应用。
背景技术
心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)仍然是全球绝经女性发病和死亡的主要原因，该病迅猛增长已成为威胁我国女性健康的“杀手”之一。女性在围绝经期(从45岁左右开始至停经后12个月内的时期)容易发生冠心病、高血压、肿瘤等疾患，同时还具有特殊的心理、生理和社会特征，严重影响生活质量。传统的雌激素治疗(Menopause hormonetherapy，MHT)围绝经期虽然能够显著改善临床症状，但最新Meta分析表明，MHT风险超过预防CVD的任何获益。目前国内外指南均指出：MHT为缓解绝经症状的最有效疗法，但也存在一些学术争议，比如雌激素治疗会引起子宫内膜癌、乳腺癌、其他癌等，还会引起一些心血管疾病。
中医对围绝经期冠心病(PMCHD)的认识截至目前较之为少，中医将围绝经期综合征称为“绝经前后诸症”，归属“脏躁”等范畴。病因病机：PMCHD主要病因病机是心肾不交，其中肾虚是其根本，心脉痹阻为标。研究显示围绝经期冠心病主要病理改变为心脉痹阻，病位在心肾，病因与阴阳失调相关，治疗当以补肾通脉为原则，重在调补肾阴肾阳。辨证治疗：PMCHD有别于一般冠心病，临床上常见胸痛、胸闷、心悸等胸痹症状外，常伴随潮热振汗、抑郁焦虑等一系列围绝经期症候群。相关证候研究显示PS主要证候依次为肾阴虚证、肾阴阳两虚证、血瘀证等，冠心病女性则较男性多见气虚、阴虚、阳虚、血虚，也有报道病理基础为肝肾等脏器功能失调，以及与肾精不足、脾气亏虚、心失所养、心肝火旺等因素有关。中药常用天王补心丹、大柴胡汤、温胆汤和酸枣仁汤等辨证治疗。
女贞二仙合剂是在传统“二仙汤”基础上加用“酒女贞子”研制而成。功能主治：温肾阳、补肾精、泻相火、调冲任，用于治疗围绝经期综合征，闭经以及其它慢性病见有肾阴阳两虚、虚火上扰者。二仙汤出自《中医方剂临床手册》、《古今名方》和《妇产科学》，由仙茅、仙灵脾、当归、巴戟天，黄柏、知母组成，具有温肾阳，补肾精，泻肾火，调理冲任之功效。主治肾阴、肾阳不足而虚火上炎之更年期综合征，高血压病，肾炎、肾盂肾炎，尿路感染，闭经。
祖国医学基于整体观和辨证观干预PMCHD具有较好的疗效和优势，但该病中医规范化诊疗仍面临许多难点与壁垒。尽管国际中医更年期综合征临床实践指南(2020-10-11)对PS的中医诊疗给予建设性意见，但用于治疗PMCHD的中成药少之又少。中医对围绝经期冠心病的辨证是一个动态的过程，不仅辨证治疗PS临床症状，且要防止其发展、演变成PMCHD的可能。
因此，需要提供一种针对上述现有技术不足的改进技术方案。
发明内容
本发明的目的在于提供女贞二仙合剂在制备预防或治疗围绝经期冠心病药物中的应用，为围绝经期冠心病的治疗提供新的候选药物。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：女贞二仙合剂在制备预防或治疗围绝经期冠心病的药物中的应用，所述女贞二仙合剂采用包括下述重量份的原料制备得到：酒女贞子6-30份、酒仙茅3-15份、炙淫羊藿3-15份、盐巴戟天3-15份、当归6-18份、盐黄柏3-12份和盐知母6～12份。
优选地，所述女贞二仙合剂在制备保护心肌梗死后心功能的药物中的应用。
优选地，所述女贞二仙合剂在制备增加心肌梗死射血分数的药物中的应用。
优选地，所述女贞二仙合剂在制备减少心肌梗死后心肌纤维化和保护心肌梗死后心肌细胞的药物中的应用。
优选地，所述女贞二仙合剂在制备减少心肌梗死面积和/或减少炎性细胞浸润的药物中的应用。
优选地，所述女贞二仙合剂在制备增加心肌梗死后心肌细胞和心肌细胞线粒体数量以及改善心肌梗死后心肌细胞线粒体结构清晰度中的至少一种的药物中的应用。
优选地，所述女贞二仙合剂在制备调节心肌梗死后PI3K-Akt信号通路的药物中的应用。
优选地，所述女贞二仙合剂在制备降低心肌梗死后细胞的IL-8、TNF、PI3K和P-AKT中的至少一种的表达量的药物中的应用。
优选地，所述女贞二仙合剂采用包括下述重量份的原料制备得到：酒女贞子20份、酒仙茅10份、炙淫羊藿10份、盐巴戟天10份、当归10份、盐黄柏6份和盐知母6份。
优选地，所述围绝经期冠心病采用去卵巢大鼠心肌梗死模型模拟得到。
有益效果：
本发明的研究表明：女贞二仙合剂功能主治：温肾阳、补肾精、泻相火、调冲任，用于治疗围绝经期综合征，闭经以及其它慢性病见有肾阴阳两虚、虚火上扰者，可以起到心血管及骨质疏松的保护作用；本发明的研究表明，女贞二仙合剂还有望用于改善围绝经期女性冠心病的临床证候。本发明促进研究女贞二仙合剂成果转化为临床应用，同时为中西医结合防控PMCHD提供新策略。
女贞二仙合剂可以通过调节PI3K-AKT信号通路来减少去卵巢大鼠心肌梗死后心肌重构，保护心功能。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。其中：
图1为女贞二仙合剂对去卵巢大鼠大鼠体重的影响检测结果图；
图2为女贞二仙合剂对去卵巢大鼠术后11周和14周时，各组间子宫体质量对比图(图2中，横坐标按照从左到右的顺序排列，依次对应对照组、模型组、雌激素组、女贞二仙合剂低剂量组和女贞二仙合剂高剂量组)；
图3为女贞二仙合剂对去卵巢大鼠术后11周和14周时，各组间子宫组织结构染色(HE染色，放大倍数×100)结果图；
图4为女贞二仙合剂对去卵巢大鼠术后11周和14周时，各组间股骨组织结构染色(HE染色，放大倍数×100)结果图；
图5为女贞二仙合剂干预去卵巢大鼠心肌梗死后7天(术后11周)、28天(术后14周)的超声检测结果图(图5A、5B)；以及各组间不同时期心功能(图5D：心梗后7天；图5C：心梗后28天)检测结果图；***P(P＜0.001)；
图6为女贞二仙合剂干预去卵巢心肌梗死大鼠心肌梗死7天(左图，术后11周)和28天(右图，术后14周)的TCC染色结果图；
图7为女贞二仙合剂干预去卵巢心肌梗死大鼠心肌梗死7天(左图，术后11周)和28天(右图，术后14周)的心肌梗死面积统计图；图7的横坐标中，从左到右依次为对照组、模型组、雌激素组、低剂量组和高剂量组的统计结果柱状图；
图8为女贞二仙合剂保护去卵巢心肌细胞病理检查结果，其中A图心肌细胞病理HE染色(上图7天，下图28天，放大倍数×100)，B图为Masson染色(上图7天，下图28天，放大倍数×100)；
图9为女贞二仙合剂保护去卵巢大鼠心肌细胞超微结构(去卵巢大鼠2个月心肌梗死后7天，28天放大倍数×20000，图9A为心肌梗死后7天的超微结构，为图9B为心肌梗死后28天的超微结构)；
图10为女贞二仙合剂保护去卵巢大鼠心肌细胞相关蛋白表达*P(P＜0.05)，图10A为Westemblot电泳图，图10B为各蛋白的表达量对比图(图中，对应每个蛋白的柱状图中，横坐标按照从左到右的顺序排列，依次对应对照组、模型组、雌激素组、女贞二仙合剂高剂量组和女贞二仙合剂低剂量组)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明针对目前围绝经期冠心病的治疗中存在的问题，提供女贞二仙合剂在制备预防或治疗围绝经期冠心病的药物中的应用。
本发明实施例的技术方案如下：女贞二仙合剂在制备预防或治疗围绝经期冠心病的药物中的应用，女贞二仙合剂采用包括下述重量份的原料制备得到：酒女贞子6-30份、仙茅3-15份、炙淫羊藿3-15份、盐巴戟天3-15份、当归6-18份、盐黄柏3-12份和盐知母6～12份。
本发明团队分析显示围绝经期冠心病归属中医“胸痹”、“心痛”，心脉痹阻为其主要病理改变，病位报道不一，如见肝肾或心肾或心肝肾或心肝脾肾等。对PMCHD的证候分析显示：PMCHD主要证候为心血瘀阻证、气滞心胸证、肾虚痰阻证、气阴两虚证、心肾阴虚证、心肾阳虚证、阴阳不调证，其中阴阳不调为其主要证候。对PMCHD的辨证治疗的研究显示：PMCHD临床以“和”为治则，调和脏腑阴阳，以期阴平阳秘，治疗以补肾通脉为纲，以益气活血、滋养肝肾、健脾疏肝益肾为基本治法，调整阴阳、调和气血贯穿于始末，还应重视相关脏器的功能调节和心身同治。本发明团队将女贞二仙合剂用于PMCHD的治疗，研究结果显示：女贞二仙合剂中的酒女贞子与其他成分相互协调，可以起到心血管及骨质疏松的保护作用，改善围绝经期冠心病女性的临床证候。
本发明优选实施例中，女贞二仙合剂在制备保护(去卵巢大鼠)心肌梗死后心功能的药物中的应用。
本发明优选实施例中，女贞二仙合剂在制备增加心肌梗死射血分数的药物中的应用。
本发明优选实施例中，女贞二仙合剂在制备减少(去卵巢大鼠)心肌梗死后心肌纤维化和保护心肌梗死后心肌细胞的药物中的应用。
本发明优选实施例中，女贞二仙合剂在制备减少(去卵巢大鼠)心肌梗死心肌梗死面积和/或减少炎性细胞浸润的药物中的应用。
本发明优选实施例中，所述女贞二仙合剂在制备增加心肌梗死后心肌细胞和心肌细胞线粒体数量以及改善心肌梗死后心肌细胞线粒体结构清晰度中的至少一种的药物中的应用。
本发明优选实施例中，女贞二仙合剂在制备调节(去卵巢大鼠)心肌梗死后PI3K-Akt信号通路的药物中的应用。
本发明优选实施例中，女贞二仙合剂在制备降低(去卵巢大鼠)心肌梗死后细胞IL-8、TNF、PI3K和P-AKT中的至少一种的表达量的药物中的应用。
本发明优选实施例中，女贞二仙合剂采用包括下述重量份的原料制备得到：酒女贞子20份、酒仙茅10份、炙淫羊藿10份、盐巴戟天10份、当归10份、盐黄柏6份和盐知母6份。
本发明优选实施例中，围绝经期冠心病采用去卵巢大鼠心肌梗死模型模拟得到。
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
1.实验材料
1.1实验动物
SD雌性大鼠130只，体重在170-200g/只，来源于辽宁长生生物技术股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2020-0001，实验动物质量合格证号：No.210726200100228968，饲养在新乡医学院第一附属医院生命科学研究中心，自由饮食、饮水。
1.2实验用药
女贞二仙合剂，由新乡医学院第一附属医院中药制剂室制备；戊酸雌二醇片，购自拜尔医药保健有限公司(614A)；羧甲基纤维素钠，上海阿拉丁生化科技股份有限公司(C104986)。
1.2.1实验药品制备
(1)女贞二仙合剂配伍及浓度：
下述制备女贞二仙合剂的过程中各原料的来源：酒女贞子、酒仙茅、盐巴戟天、当归、盐黄柏和盐知母购自河南省修之合药业有限公司；酒仙茅购自河南百缘康药业有限公司；炙淫羊藿购自河北庆源堂中药科技有限公司。药物由新乡医学院第一附属医院自制而成，药液放置于4℃冰箱保存。灌胃给药量：低剂量组：0.84g/mL/100g(每100g体重大鼠灌胃1mL溶液，每1mL溶液含0.84g女贞二仙合剂)；高剂量组：1.68g/mL/100g。
女贞二仙合剂采用包括下述重量份的中药原料制备得到：酒女贞子6-30份、仙茅/酒仙茅3-15份、炙淫羊藿3-15份、盐巴戟天3-15份、当归6-18份、盐黄柏3-12份和盐知母6～12份。
女贞二仙合剂的具体制备方法如下：将酒女贞子200g、酒仙茅100g、炙淫羊藿100g、盐巴戟天100g、当归100g、盐黄柏60g、盐知母60g等7味药材加水煎煮2次(10倍，8倍：1.5h/次；即第一次煎煮时加入酒女贞子、酒仙茅、炙淫羊藿、盐巴戟天、当归、盐黄柏和盐知母总质量10倍的水，煎煮1.5h，过滤，得到第一煎液；第二次煎煮时，加入酒女贞子、酒仙茅、炙淫羊藿、盐巴戟天、当归、盐黄柏和盐知母总质量8倍的水，煎煮1.5h，过滤，得到第二煎液)。合并第一煎液、第二煎液，滤过，滤液浓缩至2000mL，放出，静置冷藏，取上清液继续浓缩至950mL，加环拉酸钠2g，羟苯乙酯0.5g份充分搅拌均匀，调整总量为1000mL(加饮用水)，灌封，消毒即得。女贞二仙合剂为棕褐色至黑棕褐色的液体，气微香、味微苦。
(2)戊酸雌二醇片：每次取出雌二醇片18片，以研钵研磨碎，以0.5％羧甲基纤维素钠定容至200mL，放置于4℃冰箱保存。灌药量：0.09mg/mL/100g
(3)0.5％羧甲基纤维素钠：取5g羧甲基纤维素钠粉末置于2L烧杯中，以无菌水定容至1L，充分混匀，置于4℃冰箱保存。
1.3实验所用主要试剂(盒)
1.4主要试剂制备
(1)细胞裂解液：取1960μL RIPA裂解液置于干净EP管中，再加入蛋白酶抑制剂(×100)、磷酸酶抑制剂(×100)各20uL充分混匀。(2)TBST：分别称取NaCl 8g、KCl 0.2g、Tris3g、Tween20 1mL置于2L烧杯中，定容至1L，充分混匀，置于4℃冰箱保存。(3)一抗抗体：分别取WB一抗稀释液10000、5000、5000μL置于15mL EP管中，再分别加入GAPDH、PI3K、P-Akt抗体2μL、5μL、5μL，充分混匀，置于-20℃冰箱保存。(4)二抗抗体：取上述TBST溶液16mL置于25mLEP管中，再加入二抗试剂2μL充分混匀，置于-20℃冰箱保存。(5)电泳液：分别称取Tris3.02g、Gly 14.4g、SDS 1g置于2L烧杯中，定容至1L，充分混匀，置于4℃冰箱保存。(6)转膜液：分别称取Tris 3.02g、Gly 14.4g、甲醇200mL置于2L烧杯中，定容至1L，充分混匀，置于4℃冰箱保存。(7)显影液：分别吸取A、B液1mL，置于3mL EP管中，充分混匀，即用即配。(8)5％BSA：称取BSA粉末0.5g置于烧杯中，加入10mL上述TBST溶液，充分混匀，置于-20℃冰箱保存。
(9)5％脱脂奶粉：称取脱脂奶粉5g，加入100mL上述TBST溶液，充分混匀，即用即配。(10)10％水合氯醛：称取10g水合氯醛结晶，用无菌水定容至100mL，配置成10％浓度，放置4℃冰箱避光保存。
1.5主要实验设备
1.6统计分析
用SPSS 25.0软件对数据进行分析处理，所有数据以
表示。对数据进行正态性检验和方差齐性检验，符合条件者多组间比较采用单因素方差分析，若方差不齐则采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2动物实验
2.1动物分组：SD雌鼠共130只，通过随机区组设计将大鼠分为“对照组，模型组、雌激素组、女贞二仙低剂量组、女贞二仙高剂量组，大鼠均自由获取水和食物，并固定于每日早上6-7时按照体重及各组药物完成灌胃(对照组、模型组灌用等同体积的0.5％羧甲基纤维素钠溶液)。
2.2去卵巢大鼠模型建立：(1)抓取SD大鼠，以10％乌拉坦(7mL/kg)腹腔麻醉后仰卧，腹部脱毛。(2)在无菌条件下于腹股沟水平沿腹中线剪开皮肤及肌层，暴露腹腔。(3)分离子宫并摘除卵巢，清理伤口后分两层缝合皮肤及肌层，待大鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察大鼠状态及死亡情况并做好记录。(4)术后3天，每只大鼠每天皮下注射4万单位青霉素，防止感染。(5)对照组仅摘除卵巢周围约1g脂肪，而保留卵巢，其余处理相同。
2.3去卵巢心肌梗死模型建立：(1)在去卵巢大鼠模型的基础上构建去卵巢心肌梗死模型，抓取去卵巢8周大鼠，以10％乌拉坦(7mL/kg)腹腔麻醉后仰卧，胸部脱毛。(2)经口气管插管连接呼吸机，呼吸机参数：潮气量60mL，呼吸频率50次/分。(3)消毒，在SD大鼠心脏部位第3，4肋间隙位置沿着腋窝与胸骨下端连线做一1.5cm的切口。(4)以左心耳下缘水平线为标志，在线下2mm处以4-0proline丝线结扎冠脉，进针深度1mm左右，避免刺破心脏(假手术组只穿线不结扎)。(5)结扎完毕，可见左心室前壁颜色由鲜红变为暗紫至苍白色，心电图提示ST段抬高，快速将心脏推入胸腔。(6)挤出胸内气体，关胸缝合。术后3天，每只大鼠每天皮下注射4万单位青霉素，防止感染。
2.4取材方式及样本的存放：(1)心脏、子宫、股骨(HE染色、Masson染色)：麻醉处死SD大鼠后打开腹腔、胸腔，找到细长的子宫、球形的心脏，并将双侧股骨剥离出并称重后置于4％多聚甲醛溶液中。(2)心肌超微结构：按照上述方式取出心脏后剪取心尖区域心脏组织放置于电镜保存液(2％戊二醛)中。(3)心脏(Western blot)：按照上述方式取出心脏清洗后立即放置于-80℃超低温冰箱冻存，备用。
2.5考察女贞二仙合剂的影响：
2.5.1女贞二仙合剂对大鼠体重的影响：在检疫期后，通过随机区组设计将130只SD大鼠分为对照组、模型组、雌激素组、低剂量组、高剂量组。灌胃给药，每日1次，每周称取大鼠体重，实验数据表明0周组间大鼠体重无统计学意义(P＞0.05)；在行去卵巢摘除术后11周时与对照组比较，模型组体重呈明显上升趋势(P＜0.001)，女贞二仙合剂组未改善这一趋势(与对照组平均值差值：低剂量组：53.99g；高剂量组：47.13g；模型组：48.82g，P＜0.001)，行去卵巢摘除术后14周时体重情况与第11周大致相同(与对照组平均值差值：低剂量组：54.60g；高剂量组：49.89g；模型组：57.31g，P＜0.001，详见表2、图1)。
表2：各组大鼠体重变化(g
)
附表2：各组大鼠体重变化(g，
)
注与对照组比，＊P＜0.05；＊＊P＜0.01；＊＊＊P＜0.001
2.5.2女贞二仙合剂对子宫的影响：本发明在第11周和第14周(心梗术后1周、4周)将大鼠处死，并取出子宫进行称重及子宫宫体HE染色。与对照组比较，模型组大鼠子宫的大体标本出现明显变细、萎缩，而女贞二仙合剂组子宫大体形态与模型组无明显差异。与对照组相比，模型组子宫重量显著降低(P＜0.05)；与模型组相比，女贞二仙合剂各组未能显著改善因去卵巢所致的大鼠体重增加、子宫萎缩、子宫重量降低(详见图2)。
表3：各组大鼠子宫重量
与对照组相比(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)；与模型组相比(#P＜0.05；##P＜0.01；###P＜0.001)；与雌激素组相比(ΔP＜0.05；ΔΔP＜0.01；ΔΔΔP＜0.001)
子宫HE染色结果显示，对照组子宫的腺体数量明显多于其余4组，且腺体大小均一，分布均匀，去卵巢模型组的大鼠子宫腺体减少、融合、扩大；对照组与雌激素组的大鼠子宫细胞间质较为均匀，模型组、女贞二仙合剂各组的子宫细胞间质细胞增生、胶原纤维增生、部分腺体萎缩、腺体处于非分泌状态、子宫小血管增生(详见图3)。
2.5.3女贞二仙合剂对股骨的影响：女贞二仙合剂具有改善股骨病理学的作用。第11、14周后行HE染色结果显示：摘除卵巢后大鼠股骨的骨小梁数量减少，骨小梁连续性大多数中断，间质细胞充盈。女贞二仙合剂组及雌激素组大鼠的股骨，骨小梁的形态较模型组显著改善(详见图4)。
2.5.4女贞二仙合剂对心脏的影响：本发明对去卵巢大鼠运用女贞二仙合剂干预8周后，结扎去卵巢大鼠心脏左前降支构建心肌梗死模型，术后继续运用女贞二仙合剂干预7天、28天，由于心梗后7天为心肌梗死急性期，28天为心肌梗死陈旧期。因此，本实验通过动态检测去卵巢心肌梗死心功能，分析组织病理学，明确女贞二仙合剂干预去卵巢心肌梗死大鼠的作用。
2.5.5.1心功能：
结果显示，在去卵巢8周心梗后7天，与对照组相比，各组的左室射血分数有显著下降趋势(与对照组平均值差值：雌激素组：45.83％；模型组：51.82％；低剂量组：37.37％；高剂量组：57.81％，P＜0.001)，与模型组相比，雌激素、女贞二仙合剂各组心功能无明显改善(P＞0.05)，参照图5A和5D。在心梗后28天时，结果显示心肌梗死会导致大鼠左室射血分数降低(P＜0.001)，但女贞二仙合剂低剂量的大鼠心功能得到显著改善(平均值差值：21.38％，P＝0.025，图5B、图5C)。
2.5.5.2 TTC染色：
TTC染色结果显示，与模型组比较，女贞二仙合剂组均能显著改善去卵巢大鼠心肌梗死面积。详见说明书附图图6。
其中，TCC染色与分析的具体方法如下：(1)将取出的心脏放置-20℃冰箱中速冻20分钟左右；(2)待心脏速冻，迅速取出置于冰上从结扎线以下至心尖部位进行切片，间隔2mm；(3)将切片置于2％TTC溶液中，置于入37℃水浴锅15min；(4)取出切片后吸干多余水分，放置于4％多聚甲醛中固定6h，运用相机进行拍摄；(5)将各个TTC染色心脏图片导入Image-J，以三色光算出各个心脏梗死面积并进行统计(统计结果如图7所示)。
TTC染色结果显示，与模型组比较，女贞二仙合剂组均能显著改善去卵巢大鼠心肌梗死面积。详见说明书附图图6。结果显示，在心肌梗死7天时，与模型组相比，雌激素组、女贞二仙合剂低剂量组及女贞二仙合剂高剂量组的心肌梗死面积均未得到明显改善(P＞0.05)；在心肌梗死28天时，女贞二仙合剂低剂量组的心肌梗死面积较7天时有明显的改善。其余行心梗手术大鼠的心肌梗死面积组间无统计学差异(P＞0.05)。
2.5.5.3 HE与MASSON染色：
(1)HE染色
结果显示，与对照组比较，模型组心梗区域心肌厚度减少，大量的炎性细胞浸润，心肌细胞细胞核消失，残余心肌细胞肿胀；与模型组比较，各给药组给药7天，明显减少炎细胞浸润以及心梗区域心肌肿胀程度，雌激素组与女贞二仙合剂组之间未见明显差异。
去卵巢大鼠心肌梗死28天后，与对照组比较，模型组心肌细胞少量炎性细胞浸润，心肌细胞密度下降；与模型组比较，各给药组的心肌梗死区域存活心肌细胞数量增加，炎性细胞明显减少。
相比心肌梗死后7天的HE结果，心梗后28天各组间的心肌梗死区域较急性期时炎性浸润明显减少，细胞间隙扩大；其中模型组左心室明显扩大，梗死区域心肌厚度明显减少；与模型组相比，各给药组心肌梗死区域中，心肌细胞面积增加，炎性细胞分布较为聚集，并分布于坏死区域及正常心肌细胞周围(图8A)。
(2)Masson染色
Masson染色显示，去卵巢大鼠心肌梗死7天后对照组心肌细胞排列紧密，无过多心肌纤维组织浸润；与对照组相比，模型组心肌梗死区域纤维化明显，其中掺杂大量炎性细胞，且胶原纤维向正常组织渗透单位面积心肌细胞数量减少。相比模型组，各给药组心肌纤维组织向心肌细胞内渗透的程度低，心肌细胞密度较模型组高。
去卵巢大鼠心肌梗死28天后，Masson染色结果显示，对照组未见明显心肌纤维化；与对照组相比，模型组心肌梗死区域纤维化明显，并向正常心肌细胞间渗透；相比模型组，各给药组同样观察到心肌纤维组织的渗透程度减低。
相比心肌梗死后7天的Masson染色结果，心梗后28天时，各组间心梗区域纤维化更加明显，且行心梗手术的四组均出现胶原纤维和心肌细胞交叉出现，以模型组及雌激素组为重，相比较而言，女贞二仙合剂可以明显改善心肌细胞纤维化向正常心肌细胞间的渗透(图8B)。
HE染色的具体方法为：(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I10min-二甲苯II 10min-无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。(2)苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。(3)伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。(4)脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-二甲苯I 5min-二甲苯II 5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。(5)显微镜镜检，图像采集分析。
Masson染色具体方法为：组织固定于Bouin氏液，流水冲洗一晚，常规脱水包埋：首先切片脱蜡至水：(1)二甲苯中脱蜡10min×3次，用吸水纸吸干液体。(2)100％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体。(3)95％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体。(4)流水2min，用吸水纸吸干水分。然后，Weiger氏铁苏木素染5-10min。流水稍洗。0.5％盐酸酒精分化15s。流水冲洗3min。丽春红酸性品红液染8min。蒸馏水稍冲洗。1％磷钼酸水溶液处理约5min。不用水洗，直接用苯胺蓝液或亮绿液复染5min。1％冰醋酸处理1min。95％乙醇脱水5min×2次，用吸水纸吸干液体。100％乙醇5min×2次，用吸水纸吸干液体。二甲苯中透明5min×2次，用吸水纸吸干液体。中性树胶封片。
2.5.5.4心肌细胞微观结构：
本发明通过对去卵巢大鼠心肌梗死区域心肌细胞微观结构分析，在心肌梗死后7天(图9A)时，与对照组相比，模型组的心肌细胞线粒体体型减小、数量增多、肿胀，嵴断裂；相较于模型组，各给药组的心肌的线粒体体积较大，嵴较为清晰，可见线粒体分裂，这种现象在雌激素组最为明显。
在心肌梗死后28天(图9B)后，模型组中心肌梗死区域的线粒体稀数，可观察到被巨噬细胞吞噬的已经模糊不清的线粒体；各给药组线粒体排列紊乱，体积较心梗后7天时缩小，但数量增加，线粒体结构较为清楚，其中雌激素组的线粒体排列整齐，线粒体结构清楚。由此对于线粒体的保护功能，雌激素组要优于女贞二仙合剂组(图9)。
2.5.5.5 Western blotting：
上述结果显示女贞二仙合剂可以改善去卵巢大鼠心肌梗死区域炎症细胞浸润、减少心肌纤维化、保护心功能，本发明通过Western blot技术分析进一步分析了女贞二仙合剂干预去卵巢大鼠心肌梗死组织中CXCL8、MAPK1、TNF、PI3K及p-Akt蛋白水平。
结果显示，与对照组相比，模型组大鼠心脏组织中CXCL8(IL-8)、TNF、PI3K及p-AKT的含量较对照组增加，表明心肌梗死后心肌细胞内的CXCL8(IL-8)、TNF、PI3K及p-AKT表达量增加(P＜0.05)。和心肌梗死模型组对比，女贞二仙合剂低剂量组大鼠心脏组织中IL-8、TNF有下降趋势，其中IL-8显著下降(P＜0.05)，女贞二仙合剂可能作用于炎性通路保护心肌梗死后心肌损伤；且女贞二仙合剂各组大鼠心脏中的PI3K及p-AKT的水平较模型组有下降趋势，p-AKT的水平明显降低(P＜0.05)(图10)。
Western blot分析方法按照下述步骤进行：
提取蛋白：(1)取心脏梗死边缘区细胞通过PBS洗涤并抽提细胞裂解液，用移液器将细胞碎片和裂解混合液移至1.5mL离心管中，在4℃预冷的离心机，以12000r/min，离心15min。将上清液转移至新的EP管中，即为提取的总蛋白。(2)取96孔板，开始制作标准曲线：依次加入(0、2、4、6、8、10、14、16、20μL)的标准蛋白溶液(BSA)，PBS补齐每孔至20μL。(3)制作蛋白样品：取出2μL蛋白样品+18μL PBS混匀。(4)在标曲和蛋白样品中加入配好的BCA工作液，每孔200μL。并置于37℃恒温箱中孵育30min。(5)使用酶标仪检测样品在A570nm处的OD值，用EXCLE软件将检测的标准品OD值算出标准曲线。(6)根据规定的上样量计算出样品的蛋白体积、裂解液体积、5×buffer的体积。(7)制备好后用封口膜封口，沸水中煮10min，室温冷却等待上样或分装后置于-80℃冰箱中保存。
Western blot：(1)配胶：清晰并按要求组装配胶板，加入纯水观察有无漏液来判断组装是否牢固，检查完将纯水倒掉。配制分离胶，用移液器吸到组装好的板子里，用异丙醇封口，室温下放置30min，待分离胶凝固后倒掉异丙醇，用滤纸吸干残余异丙醇，配制上层胶，插上15孔的梳子，室温下放置30min。(2)上样：从-80℃冰箱中取出已定量变性的蛋白样品解冻。用电泳夹夹好玻璃板，在两板之间加入配制好的电泳液，均速拔出梳子，用20ul的枪头上样，先上marker 5uL，再上蛋白，剩余用1×loading buffer补齐。若蛋白样品数量较少，剩余孔加入1×loading Buffer，保证每孔上样的体积一致。(3)电泳：将剩余的电泳液倒入电泳槽中，以70V电压电泳30min，待marker分开后换100V电压电泳90min左右直到蓝色条带至胶的底部时，停止电泳。(4)转膜：电泳结束后用专用的板慢慢撬开玻璃板，切掉上层胶，根据目的蛋白位置可切部分下层胶。准备所需的PVDF膜，用甲醇浸泡。准备“三明治”夹子，从下往上以“黑-海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵”的顺序放好，且各层之间无气泡。放入转膜夹，并倒入充分预冷的转膜液，放入冰晶，并将整个电泳箱置入冰中。以100V电压转膜60min。(5)封闭：非磷酸蛋白使用5％的脱脂牛奶，使用5％BSA封闭1h。(6)洗膜：根据所需的蛋白分子量画好剪膜图，用配制好的TBST溶液在摇床上洗3遍，每遍10min。根据蛋白分子量大小剪好膜，放入TBST中，保持PDVF膜湿润。(7)一抗孵育：按照说明书使用一抗稀释液配制一抗，加入到对应的PVDF膜中，放4°摇床上孵育过夜。(8)二抗孵育：回收一抗，用TBST清洗PVDF膜3遍，每遍10min。加入配制好的二抗室温孵育1h。完成后回收二抗，再次用TBST溶液洗膜三次，每次10min。(9)曝光：按A液：B液＝1：1比例配置显影液，均匀滴在待曝光膜上，用曝光仪进行曝光，内参一般0.1～0.3s足够，其它可选Auto自动检测最佳曝光时间。(10)分析：将图片导入Image-J，算出各个条带的灰度值，以SPSS计算差异，以GraphPad作图。
3.研究结果分析
本发明研究显示，女贞二仙合剂能够通过PI3K-AKT信号通路保护去卵巢大鼠心肌组织，改善心功能。
研究结果显示去卵巢大鼠引起雌激素依赖性的子宫重量减少、体重增加，与Janas等人的实验结果相同，且HE结果提示子宫腺体减少、间质增加以及胶原纤维增生，也证实了卵巢功能丧失所带来的危害。大鼠体重从第三周开始，正常大鼠与除了补充雌激素的其余三组摘除卵巢的大鼠出现了组间差异，同样与Wegorzewska等人的实验结果一致，这种现象的出现可能与雌激素通过下丘脑调节胰岛素的敏感性、调节胰岛素分泌，从而影响外周脂肪组织有关。
女贞二仙合剂能够保护心梗后心肌组织。本实验通过结扎去卵巢大鼠前降支构建心肌梗死模型，结果显示心肌梗死区域内的心肌细胞、炎性细胞的状态各不相同。心梗急性期时HE及Masson染色发现，饲养雌激素及女贞二仙合剂的SD大鼠，明显减少炎细胞浸润的程度、心梗区域心肌肿胀程度以及纤维化向心肌细胞内渗透的程度，心肌细胞密度相比较高；在心梗陈旧期，喂养雌激素组及女贞二仙合剂的大鼠，心梗区域心肌细胞面积增加，炎性细胞分布较为聚集，且饲养女贞二仙合剂的两组SD大鼠心肌细胞纤维化的边界更加清楚。各组间心肌细胞纤维化程度各不相同，且心功能有明显统计学意义，通过比较组间心功能发现女贞二仙合剂低剂量组在心梗急性期时较模型组有好转趋势，在陈旧期时出现统计学差异。心肌梗死后会引起心功能的下降，其主要原因可能是因为心肌细胞数量的减少、无收缩能力的纤维组织增生以及心肌细胞凋亡的共同结果。相关研究表明，雌激素可以通过抑制RASS系统和交感神经系统，改善去卵巢大鼠的心功能及心肌纤维化程度。
PI3K/AKT通路对细胞生长、转移、存活、代谢等生物学过程是不可或缺的。本发明实验结果显示，心梗后PI3K、p-AKT的表达量增加，这与Ruan Y等人的实验结果一致，且增强PI3K/AKT信号通路的活性可能是其参与心肌纤维化的机制之一。本发明实验结果显示，饲养女贞二仙合剂低剂量的大鼠，在心梗后p-AKT的表达量降低，表明女贞二仙合剂可能是通过调PI3K/AKT通路，从而改善去卵巢大鼠急性心肌梗死后心功能的。相关研究表明，通过抑制PI3K/AKT信号通路，可以下调炎性细胞因子水平，从而保护心肌细胞；抑制PI3K/AKT通路可降低糖尿病性心肌病模型中PI3K、AKT的表达，从而阻碍心肌纤维化的进展。相反PI3K/AKT通路的激活与心肌损伤密切相关，甚至加重急性心梗后心肌细胞损伤。通过抑制PI3K/AKT通路可显著提高caspase系列蛋白的活性，减少心肌细胞的凋亡。
本发明的主要结果是女贞二仙合剂通过调节PI3K-AKT信号通路改善心肌梗死后心功能。
综上所述，本发明结合冠心病的主要发生机制，通过对去卵巢大鼠心肌梗死模型的建立，发现女贞二仙合剂可以通过调节PI3K-AKT信号通路来抗去卵巢大鼠心肌梗死后心肌重构、保护心功能。
4.结论
基于中医理论组方女贞二仙合剂可通过减少PI3K-AKT信号通路，减少心肌纤维化、保护心肌细胞，从而保护心肌梗死后心功能。
本发明研究结果显示基于中医理论组方女贞二仙合剂为围绝经期心肌梗死临床治疗的候选药物。
Claims (10)
1.女贞二仙合剂在制备预防或治疗围绝经期冠心病的药物中的应用，所述女贞二仙合剂采用包括下述重量份的原料制备得到：酒女贞子6-30份、酒仙茅3-15份、炙淫羊藿3-15份、盐巴戟天3-15份、当归6-18份、盐黄柏3-12份和盐知母6～12份。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述女贞二仙合剂在制备保护心肌梗死后心功能的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述女贞二仙合剂在制备增加心肌梗死射血分数的药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述女贞二仙合剂在制备减少心肌梗死后心肌纤维化和保护心肌梗死后心肌细胞的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述女贞二仙合剂在制备减少心肌梗死面积和/或减少炎性细胞浸润的药物中的应用。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述女贞二仙合剂在制备增加心肌梗死后心肌细胞和心肌细胞线粒体数量以及改善心肌梗死后心肌细胞线粒体结构清晰度中的至少一种的药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述女贞二仙合剂在制备调节心肌梗死后PI3K-Akt信号通路的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述女贞二仙合剂在制备降低心肌梗死后细胞的IL-8、TNF、PI3K和P-AKT中的至少一种的表达量的药物中的应用。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述女贞二仙合剂采用包括下述重量份的原料制备得到：酒女贞子20份、酒仙茅10份、炙淫羊藿10份、盐巴戟天10份、当归10份、盐黄柏6份和盐知母6份。
10.根据权利要求1-9任一项所述的应用，其特征在于，所述围绝经期冠心病采用去卵巢大鼠心肌梗死模型模拟得到。
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