CN115963263A - 一种检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒及应用 - Google Patents
一种检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及IPC G01N33，更具体的涉及，一种检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒及应用。所述的试剂盒包括检测板、样本采集器、样本处理液和干燥剂；所述的检测板包括试剂条和塑料件；所述的试剂条包括样品垫、硝酸纤维膜(NC膜)、试剂垫、吸水纸，其中试剂垫中有纳米碳标记的HP鼠单克隆抗体，NC膜上有预先包被的HP鼠单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体。本发明中的试剂盒以口腔牙垢为样本，样本采集方便，检测灵敏度高，特异性强，成本低廉，适用人群广。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及IPC G01N33，更具体的涉及，一种检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒及应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori简称HP)是一种末端钝圆、长2.5～4.0μm、宽0.5～1.0μm、多鞭毛、单极、呈革兰阴性，是一种微需氧菌，对环境氧的要求为5％～8％。流行病学调查显示，全世界人群总幽门螺杆菌的感染率在59.2％左右，其中有症状的在15％～20％左右。1994年世界卫生组织(WHO)/国际癌症研究机构(IARC)将幽门螺杆菌定为Ⅰ类致癌原。因此，幽门螺杆菌检测逐渐受到人们的关注，如何选择一种敏感性及特异性较高的检测方法对临床有很重要的指导作用。
幽门螺杆菌感染的诊断方法依据取材有无创伤性分为两大类：侵入性检测方法和非侵入性检测方法。侵入性检测由于技术要求高、仪器价格昂贵以及受试者耐受性差等限制，非侵入性检测方法成为现在研究的热点，尿素呼气试验检测(UBT)是国际上公认的幽门螺旋杆菌检查的“金标准”。考虑操作简便性，及产品的适用性，目前国内外产品的研究主要是通过粪便样本幽门螺杆菌抗原检测法和血液幽门螺杆菌抗体检测法两种。
现有专利CN201510292062.9公开了一种幽门螺旋杆菌抗原胶体金检测试剂盒，所述抗原胶体金检测试剂盒包括纸卡、所述试纸卡包括底板、及位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述金标垫上包含胶体金标记的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体-1，所述硝酸纤维素膜上包被有检测线和质控线。所述试剂盒是通过粪便样本幽门螺杆菌检测的，但使用粪便样本的方法容易引起部分人的不适。
1989年，Krajden等及Shames等从胃炎患者牙菌斑中分离出幽门螺杆菌，经培养并应用DNA限制性内切酶后，证实胃和牙菌斑中的幽门螺杆菌为同一菌株，并推测口腔可能是幽门螺杆菌的第二个贮存地。近年来国内外学者通过巢式PCR、LAMP-RFLP、细菌培养法、ELISA、免疫层析抗原检测法等多种方法都检测到了口腔样本中含有幽门螺杆菌。
因此，需要开发一种从口腔牙垢中检测幽门螺杆菌抗原的试剂盒，可用于体外定性检测人口腔牙垢样本中幽门螺杆菌的抗原。
发明内容
为了解决现有技术中的问题，本发明第一方面提供了一种检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，包括检测板、样本采集器、样本处理液和干燥剂。
优选的，所述检测板包括试剂条和塑料件。
优选的，所述试剂条包括样品垫、硝酸纤维膜(NC膜)、试剂垫、吸水纸。
优选的，所述样本处理液为10～30mM磷酸盐缓冲液(PBS)。
优选的，所述的样品垫采用样品垫处理液处理；进一步优选的，所述样品垫处理方式为用30～50mL的样品垫处理液处理玻璃纤维后，35～39℃烘干过夜。
优选的，所述样品垫处理液包括0.1～0.2M Tris-HCl缓冲液、0.1～0.2M四硼酸钠水溶液缓冲液、0.1～0.2M甘氨酸缓冲液中的一种或多种；进一步优选的，为0.1～0.2MTris-HCl缓冲液、0.1～0.2M四硼酸钠水溶液缓冲液中的一种或多种。
在一些优选的方案中，所述样品垫处理液包括0.1～0.2M Tris-HCl缓冲液或0.1～0.2M四硼酸钠水溶液缓冲液。
优选的，所述样品垫处理液的pH为7.8～8.2；进一步优选的，为8.0。
优选的，所述样品垫处理液还包括0.3～0.8％(w/v)CaseinNa、0.05～2％(w/v)Tetronic 1307、0.05～2％(w/v)S17、0.05～2％(w/v)EDTA、0.05～2％(w/v)BSA、0.5～2％(v/v)Triton X-100；进一步优选的，所述样品垫处理液还包括0.5％(w/v)CaseinNa、1％(w/v)Tetronic 1307、1％(w/v)S17、1％(w/v)EDTA、1％(w/v)BSA、0.5％(v/v)Triton X-100。
本发明中，将样品垫用样品垫处理液处理，所用的样品垫处理液为0.1～0.2MTris-HCl缓冲液、0.1～0.2M四硼酸钠水溶液缓冲液、0.1～0.2M甘氨酸缓冲液，还包括0.3～0.8％(w/v)CaseinNa、0.05～2％(w/v)Tetronic 1307、0.05～2％(w/v)S17、0.05～2％(w/v)EDTA、0.05～2％(w/v)BSA、0.5～2％(v/v)Triton X-100，能够提高检测试剂盒的灵敏度。本发明人意外发现，当使用实施例中的样品垫处理液时，能将检测口腔中的幽门螺旋杆菌的灵敏度降到10ng/mL以下，尤其是Tris-HCl缓冲液，可能是因为这些缓冲液能够提供一个合适环境，能让样本进入样品垫时，样品中的物质能够进行更好的释放，促进了抗体和抗原的结合，减少了其他因素对结合的影响，且具有稳定样本的作用，从而提高了灵敏度。
优选的，所述试剂垫用标记的HP鼠单克隆抗体处理；进一步优选的，所述试剂垫的处理方式为用40％(v/v)稀释液将标记的HP鼠单克隆抗体按1：15的体积稀释后，铺于玻璃纤维上，37℃烘干过夜，裁切为5mm宽，干燥封存。
优选的，所述40％(v/v)的稀释液为用水将稀释液进行稀释后得到。
优选的，所述稀释液为含有蔗糖、海藻糖、Triton X-100的Tris缓冲液；进一步优选的，所述稀释液为含有0.8～1.2％(w/v)BSA、8～12％(w/v)蔗糖、4～6％(w/v)海藻糖、0.3～0.5％(v/v)Triton X-100的65～75mM Tris缓冲液。
在一些优选的方案中，所述40％(v/v)的稀释液为含有1％(w/v)BSA、10％(w/v)蔗糖、5％(w/v)海藻糖、0.4％(v/v)Triton X-100的70mM Tris缓冲液。
优选的，所述标记稀释液为用40％(v/v)稀释液将标记的HP鼠单克隆抗体按1：15的体积稀释的溶液。
优选的，所述标记稀释液的用量为10-15mL/每张玻璃纤维；进一步优选的，为12mL/每张玻璃纤维。
优选的，所述玻璃纤维的尺寸为200mm×300mm。
需要说明的是，本发明中各物质的百分含量％(w/v)为质量与体积的比，具体单位为1g/100mL。
优选的，所述标记的HP鼠单克隆抗体为纳米碳标记的HP鼠单克隆抗体。
优选的，所述纳米碳标记的HP鼠单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1：将纳米碳分散处理后，用超声仪分散均匀；
S2：取分散好的纳米碳加入离心管中；将待标记抗体加入pH为8.8的3～7mM Borax中，振荡混匀，室温摇晃偶联25～35min；
S3：离心12000～15000rpm，10～20min后，弃上清；
S4：加入封闭剂，再加入封闭液，超声均匀3～5次，室温封闭25～35min；
S5：离心12000～15000rpm，10～20min后，弃上清；
S6：加入5mM Borax+1％BSA,超声均匀3～5次，再离心12000～15000rpm，10～20min后，弃上清；
S7：加入保存液，超声均匀4℃保存待用。
优选的，所述纳米碳标记的HP鼠单克隆抗体的具体制备方法，包括以下步骤：
S1：将纳米碳分散处理后，用超声仪分散均匀；
S2：取200μL分散好的纳米碳加入1.5mL离心管中；将40μg待标记抗体加入100μL的pH为8.8的3～7mM Borax中，振荡混匀，室温摇晃偶联25～35min；
S3：离心12000～15000rpm，10～20min后，弃上清；
S4：加入800μL封闭剂，再加入100μL封闭液，超声均匀3～5次，室温封闭25～35min；
S5：离心12000～15000rpm，10～20min后，弃上清；
S6：加入500μL 5mM Borax+1％BSA,超声均匀3～5次，再离心12000～15000rpm，10～20min后，弃上清；
S7：加200μL的保存液，超声均匀4℃保存待用。
优选的，所述封闭剂为3～7mM Borax水溶液；
优选的，所述封闭剂还包括0.1～0.3(w/v)％PVA；进一步优选的，为5mM Borax水溶液，所述封闭剂还包括0.2％(w/v)PVA。
优选的，所述封闭液为10％(v/v)的Tween20。
优选的，所述S7中的保存液为0.05～0.2M Borax水溶液，所述的保存液还包括0.5～1.5％(w/v)BSA；进一步优选的，为0.1M，所述的保存液还包括1％(w/v)BSA。
优选的，所述S1中纳米碳分散处理的具体步骤，包括以下步骤：
M1：将纳米碳粉溶于溶剂中，低温超声处理；
M2：将M1中低温超声处理后的纳米碳液，用溶剂稀释，离心，再进行两次离心重悬。
M3：将M2中超声重悬的纳米碳液用溶剂稀释300～500倍，测A400，保存待用。
优选的，所述M1中的具体步骤为：称取纳米碳粉，溶于pH为8.8的3～7mMBorax中，低温超声处理100～150min.
优选的，所述1g的纳米碳粉溶于pH为8.8的70～100mL的Borax。
优选的，所述M2中的具体步骤为：将M1中低温超声处理后的纳米碳液，用pH为8.8的5mM Borax溶液稀释3倍，平分至两个离心瓶中，进行第一次低速离心2000～3000rpm下离心8～12min；弃掉沉淀，将上清倒于新的离心管中；将第一步得到的上清液，5000～8000rpm离心8～12min；弃掉上清，将沉淀用pH为8.8的5mMBorax超声重悬；再进行高速离心5000～8000rpm离心10min，弃掉上清；将沉淀用pH为8.8的3～7Mm Borax超声重悬；
优选的，所述M3中的具体步骤为：将超声均匀处理好的纳米碳稀释400倍测A400，用5mM Borax调试A400至0.15±0.02，将处理好的纳米碳放入2～8℃保存待用。
优选的，所述Borax为Borax水溶液。
本发明采用了新的纳米碳标记方法，提高了检测试剂盒的灵敏度和稳定性，同时原材料具备廉价且环保等明显优势，市面上的胶体金检测产品不稳定，灵敏度低且成本高，检测结果不明显，而本发明中的试剂盒产品稳定，灵敏度高，纳米碳的成本低，检测结果中纳米碳和NC膜黑白对比明显，更容易分辨。
优选的，所述的NC膜为包被有相互平行的检测线T线和质控线C线，间隔距离为5mm，检测线T线靠近试剂垫，质控线C线靠近吸水纸。
优选的，所述NC膜的制备方法为：将PVC底板中间处的保护纸撕掉，将NC膜沿上面保护纸的下边缘粘贴，然后采用喷金划膜仪将T线抗体、C线抗体分别包被在NC膜上，烘干过夜，加入干燥剂封存备用。
优选的，所述PVC底板的尺寸为60mm×280mm。
优选的，所述NC膜为1UN14ER100020NT。
优选的，所述T线抗体为使用包被稀释液将HP鼠单克隆抗体稀释后的T线包被液。
优选的，所述C线抗体为使用包被稀释液将羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释后的C线包被液。
优选的，所述包被稀释液为含有pH为7.4的含有蔗糖的PBS缓冲溶液；进一步优选的，所述包被稀释液为含有pH为7.4的含有10g/L蔗糖的10mM PBS缓冲溶液。
优选的，所述T线抗体的质量浓度为0.5-1.5mg/mL，C线抗体的质量浓度为0.5-1.5mg/mL；优选地，所述T线抗体的质量浓度为1.0mg/mL，C线抗体的质量浓度为1.0mg/mL。
优选的，所述喷金划膜仪的划液量为0.5～1.5μL/cm，划膜速度为50～70mm/s；优选地，所述喷金划膜仪的划液量为1μL/cm，划膜速度为60mm/s。
优选的，所述试剂条由样品垫、试剂垫、NC膜、吸水纸粘贴于PVC底板上组成；优选的，所述试剂条的具体制备操作为：将NC膜包被后的PVC底板贴上17mm的吸水纸，然后依次粘贴宽度为5mm试剂垫(HP鼠单克隆抗体)一个、宽度为20mm样品垫一个。
优选的，所述检测板的制备方法为将试剂条切割为3-4mm宽，安装到塑料件的底板上，加上上盖，得到检测板。
本发明第二方面提供了一种检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒的应用，应用于口腔牙垢中幽门螺旋杆菌抗原的检测。
本发明中，通过检测口腔牙垢来进行幽门螺旋杆菌的检测，能减少检测的创伤性，简化样本的获取，以及可以随时检测且检测结果快速。本发明人发现，血清检测不能用于根除治疗后复查，且检测带有创伤性。而以粪便抗原作为检测抗原，大众不易接受且不能随时检测。本发明中的试剂盒以口腔牙垢作为检测样本，容易收集，且收集方便，安全无创，废弃物不需要特殊处理，而且无需考虑样本的保存、运输、处理等不当引起的结果误判、同时，适用于各个年龄人群。既适用于专业医务人员在医疗单位进行幽门螺杆菌抗原的检测，也适用于消费者的自测。具有检测简单、无创经济、结果快速直观等特点。
本发明通过免疫层析夹心法检测口腔幽门螺旋杆菌特异抗原鞭毛蛋白，能够缩短检测的时间，提高检测的灵敏性和特异性。本发明人发现，市面上试剂盒通过检测口腔唾液中幽门螺旋杆菌产生的尿素酶来确定是否为阳性，但这种检测试剂盒的假阳性高，主要是因为口腔内唾液链球菌、内氏放线菌、沃氏葡萄球菌都会产生尿素酶，这些菌产生的尿素酶与试剂盒中抗体容易产生交叉反应，从而出现假阳性。而本发明是通过口腔牙垢样本检测幽门螺旋杆菌特异的鞭毛蛋白，样本易获得，检测效率高，能够快速检测幽门螺旋杆菌的感染状况，具有很高的敏感性和特异性。
本发明中采用纳米碳免疫层析双抗体夹心法原理，定性检测人体口腔幽门螺杆菌的抗原，能提高检测的灵敏度、特异性，同时提高了检测的方便性。本发明人创造性的发现，在测试时，当样本加入试剂条的加样孔时，样本随之在毛细效由下向上层析。如样本中含有Hp抗原，首先会和固定在试剂垫上纳米碳标记的HP鼠单克隆抗体形成抗原-抗体复合物，进而通过检测区(T)时会被固定在检测区(T)HP鼠单克隆抗体所捕获，检测区(T)会出现一条黑色条带，判定为阳性。如样本中不含有Hp抗原，则检测区(T)将不会形成双抗夹心复合物，因此检测区(T)内将没有条带出现，则判定为阴性。无论Hp抗原是否存在于样本中，在质控区(C)都会出现一条黑色条带。质控区(C)内所显现的黑色条带是判定层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。采用纳米碳免疫层析双抗体夹心法原理，定性检测人体口腔幽门螺杆菌的抗原，能提高检测的灵敏度、特异性。
有益效果：
1、本发明中，将样品垫用样品垫处理液处理，所用的样品垫处理液为0.1～0.2MTris-HCl缓冲液、0.1～0.2M四硼酸钠水溶液缓冲液、0.1～0.2M甘氨酸缓冲液，还包括0.3～0.8％(w/v)CaseinNa、0.05～2％(w/v)Tetronic 1307、0.05～2％(w/v)S17、0.05～2％(w/v)EDTA、0.05～2％(w/v)BSA、0.5～2％(v/v)Triton X-100，能够提高检测试剂盒的灵敏度。
2、本发明中，通过检测口腔牙垢来进行幽门螺旋杆菌的检测，能减少检测的创伤性，简化样本的获取，以及可以随时检测且检测结果快速。
3、本发明通过免疫层析夹心法检测口腔幽门螺旋杆菌特异抗原鞭毛蛋白，能够缩短检测的时间，提高检测的灵敏性和特异性。
4、本发明采用了新的纳米碳标记方法，提高了检测试剂盒的灵敏度和稳定性，同时原材料具备廉价且环保等明显优势，市面上的胶体金检测产品不稳定，灵敏度低且成本高，检测结果不明显，而本发明中的试剂盒产品稳定，灵敏度高，纳米碳的成本低，检测结果中纳米碳和NC膜黑白对比明显，更容易分辨。
5、本发明中采用纳米碳免疫层析双抗体夹心法原理，定性检测人体口腔幽门螺杆菌的抗原，能提高检测的灵敏度、特异性，同时提高了检测的方便性。
附图说明
图1为实施例1中的试剂盒检测质控品的检测结果图；
图2为实施例1中的试剂盒检测标准品菌液的检测结果图；
图3为实施例2中的试剂盒检测质控品的检测结果图；
图4为对比例1中的试剂盒检测质控品的检测结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例第一方面提供了一种检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，为检测板、样本采集器、样本处理液和干燥剂。
所述检测板由试剂条和塑料件组成。
所述试剂条由样品垫、硝酸纤维膜(NC膜)、试剂垫、吸水纸组成。
所述样本处理液为500μL的10mM磷酸盐缓冲液(PBS)。
所述样品垫处理方式为用40mL样品垫处理液处理玻璃纤维8964(购买于上海韩以生物科技有限公司生产的8964)后，37℃烘干过夜，裁切为20mm宽，干燥封存。
所述玻璃纤维8964的尺寸为254mm×300mm。
所述样品垫处理液包括0.1M Tris-HCl缓冲液、0.1M四硼酸钠水溶液缓冲液、0.1M甘氨酸缓冲液中的一种或多种；
所述样品垫处理液还包括0.5％(w/v)CaseinNa、1％(w/v)Tetronic 1307、1％(w/v)S17、1％(w/v)EDTA、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Triton X-100。
所述样品垫处理液的pH为8.0
所述试剂垫的处理方式为用40％(v/v)稀释液将标记的HP鼠单克隆抗体按1：15的体积稀释后，铺于玻璃纤维(购买于上海韩以生物科技有限公司生产的KB50)上，37℃烘干过夜，裁切为5mm宽，干燥封存。
所述40％(v/v)的稀释液为用水将稀释液进行稀释后得到。
所述40％(v/v)的稀释液为含有1％(w/v)BSA、10％(w/v)蔗糖、5％(w/v)海藻糖、0.4％(v/v)Triton X-100的70mM Tris缓冲液。
所述标记稀释液为用40％(v/v)稀释液将标记的HP鼠单克隆抗体按1：15的体积稀释的溶液。
所述标记稀释液的用量为12mL/每张玻璃纤维(购买于上海韩以生物科技有限公司生产的KB50)。
所述玻璃纤维KB50的尺寸为200mm×300mm。
需要说明的是，本发明中各物质的百分含量％(w/v)为质量与体积的比，具体单位为1g/100mL。
所述标记的HP鼠单克隆抗体为纳米碳标记的HP鼠单克隆抗体
所述纳米碳标记的HP鼠单克隆抗体的具体制备方法，包括以下步骤：
S1：将纳米碳(购买自北京德科岛金科技有限公司生产的CNT302。)分散处理后，用超声仪分散均匀；
S2：取200μL分散好的纳米碳加入1.5mL离心管中；将40μg待标记抗体加入100μLpH为8.8的5mM Borax中，振荡混匀，25℃摇晃偶联30min；
S3：离心13000rpm，15min后，弃上清；
S4：加入800μL封闭剂，再加入100μL 10％的Tween20(购自VWR的货号0777)，超声均匀5次，25℃封闭30min；
S5：离心13000rpm，15min后，弃上清；
S6：加入500μL 5mM Borax+1％BSA,超声均匀5次，再离心13000rpm，15min后，弃上清；
S7：加200μL的保存液，超声均匀4℃保存待用。
所述封闭剂为5mM Borax水溶液；
所述封闭剂还包括0.2％(w/v)PVA。
所述S7中的保存液为0.1M Borax水溶液，所述的保存液还包括1％(w/v)BSA。
所述S1中纳米碳分散处理的具体步骤，以处理1g纳米碳球为例，包括以下步骤：
M1：将1g纳米碳粉溶于80mL pH为8.8的5mMBorax中，低温超声处理120min；
M2：将M1中低温超声处理后的纳米碳液，用pH为8.8的5mM Borax溶液稀释3倍，平分至两个离心瓶中，进行第一次低速离心2500rpm下离心10min；弃掉沉淀，将上清倒于新的离心管中；将第一步得到的上清液，6000rpm离心10min；弃掉上清，将沉淀用pH为8.8的5mMBorax超声重悬；再进行高速离心6000rpm离心10min，弃掉上清；将沉淀用pH为8.8的5mMBorax超声重悬；
M3：将超声均匀处理好的纳米碳稀释400倍测A400，用5mM Borax调试A400至0.15±0.02，将处理好的纳米碳放入4℃保存待用。
所述Borax为Borax水溶液。
所述的NC膜为包被有相互平行的检测线T线和质控线C线，间隔距离为5mm，检测线T线靠近试剂垫，质控线C线靠近吸水纸。
所述NC膜的制备方法为：将PVC底板中间处的保护纸撕掉，将NC膜沿上面保护纸的下边缘粘贴，然后采用喷金划膜仪将T线抗体、C线抗体分别包被在NC膜上，烘干过夜，加入干燥剂封存备用。
所述PVC底板的尺寸为60mm×280mm(购自衢州迈科新材料有限公司生产的MT101200507)。
所述NC膜为1UN14ER100020NT(购买自赛多利斯)。
所述T线抗体为使用包被稀释液将HP鼠单克隆抗体稀释后的T线包被液。
所述C线抗体为使用包被稀释液将羊抗鼠IgG多克隆抗体稀释后的C线包被液。
所述包被稀释液为含有pH为7.4的含有蔗糖的PBS缓冲溶液；进一步优选的，所述包被稀释液为含有pH为7.4的含有10g/L蔗糖的10mM PBS缓冲溶液。
所述T线抗体的质量浓度为1.0mg/mL，C线抗体的质量浓度为1.0mg/mL。
所述喷金划膜仪的划液量为1μL/cm，划膜速度为60mm/s。
所述试剂条的具体制备操作为：将NC膜包被后的PVC底板贴上17mm的吸水纸(购自上药医疗器械(上海)有限公司生产的21050901)，然后依次粘贴宽度为5mm试剂垫(HP鼠单克隆抗体)一个、宽度为20mm样品垫一个。
所述试剂条由PVC底板和位于底板表面的从加样端开始依次排列的样品垫、试剂垫、NC膜和吸水垫组成。
所述试剂垫为一个宽度为5mm的纳米碳标记的HP鼠单克隆抗体试剂垫。所述样品垫和试剂垫的长度与PVC底板的长度相同。
所述检测板的制备方法为将试剂条切割为4mm宽，安装到塑料件的底板上，加上上盖，得到检测板。
本实施例第二方面提供了一种检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒的应用，应用于口腔中幽门螺旋杆菌抗原的检测。
实施例2
实施例2的具体实施方式同实施1一样，不同之处在于，所述样品垫处理液为0.1M的四硼酸钠缓冲液。
对比例1
对比例1的具体实施方式同实施1一样，不同之处在于，所述标记的HP鼠单克隆抗体为胶体金标记的HP鼠单克隆抗体。
性能测试
1、采用实施例1的试剂盒，用样本处理液作为稀释液，稀释HP质控品到2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL的浓度。同时稀释标准品菌液不同梯度5.0×105CFU/mL、1.0×105CFU/mL、5.0×104CFU/mL、2.5×104CFU/mL，用移液器分别取100μL滴加到加样孔，待观察窗口出现液体时到达T位置，开始计时15min判读结果，见下表1。
结果实施例1的试剂盒检测不同浓度质控品及标准品菌液呈现梯度，见图1和图2，质控品最低检测限为2ng/mL，标准品菌液最低检测限为2.5×104CFU/mL。
采用实施例1中的试剂盒，用样本处理液作为稀释液，质控品到2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL的浓度。用移液器分别取100μL滴加到加样孔，待观察窗口出现液体时到达T位置，开始计时15min判读结果，对比例1的试剂盒检测不同浓度质控品呈现梯度，见图3。
结果：样品垫的制备中0.1M的Tris缓冲液换成0.1M的四硼酸钠缓冲液，用样本稀释液稀释质控品检测，灵敏度仅能检测到5ng/mL。
采用对比例1中的试剂盒，用样本处理液作为稀释液，稀释HP质控品到2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL的浓度。用移液器分别取100μL滴加到加样孔，待观察窗口出现液体时到达T位置，开始计时15min判读结果，对比例1的试剂盒检测不同浓度质控品呈现梯度，见图4。
结果：采用常规的胶体金标记，用样本处理液作为稀释液，稀释HP质控品检测，灵敏度仅能检测到25ng/mL。而实施例1中的纳米碳标记，灵敏度能检测到2ng/mL，纳米碳标记灵敏度提高了12.5倍。
表1
2、采用实施1中所述检测试剂盒进行检测：
1.样本的采集
用取样器在5处不同的牙缝间采集牙垢样本。采样时，将取样器前端刷头对准牙缝处轻轻地前后移动，并旋转2-3圈，后槽牙等不易触及的位置可将刷头折弯使用。
2.样本的处理
1)样本采集完成后，撕开样本收集管的封口，将取样器插进样本收集管处理液中；
2)手握紧收集管壁，将取样器在收集管中旋转摇晃10次左右(至少30秒)，至取样器刷子上无残留牙垢；
3)将取样器取出弃去，盖上滴头待用。
3.样本的检测
撕开铝箔袋，将检测板从铝箔袋中取出，平放在桌面上；将收集管中液体(3-4滴约100ul)滴在检测板的加样孔中；15分钟时观察检测结果，30分钟后判读结果无效。
4.真实样本的检测
对公司的26名员工做了13C-UBT呼气体检，有8名员工阳性；对参与呼气体检的26名员工，按照试剂盒说明书操作，取牙垢用试剂盒检测，同时取牙垢用市场上HP快速检测试纸(干化学法)检测比较。
呼气阳性的8名员工中，本检测试剂盒检测7人阳性，符合率87.5％；市场(干化学法)检测试纸4人阳性，符合率50％；呼气阴性的18名员工中，本检测试剂盒检测4人假阳；市场(干化学法)检测11人阳性，假阳率达61.1％。具体检测结果见表2。
呼气体检可以检测出人群中幽门螺旋杆菌感染情况。本检测试剂盒为口腔牙垢样本，主要用于幽门螺旋杆菌感染高危人群的筛查，呼气阴性的4人可能为幽门螺旋杆菌感染高危人群。初步确定本试剂盒的敏感性≥87.5％。说明该检测方式可行。
表2
Claims (10)
1.一种检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，其特征在于，包括检测板、样本采集器、样本处理液和干燥剂；
所述检测板包括试剂条和塑料件；
所述试剂条包括样品垫、硝酸纤维膜、试剂垫、吸水纸。
2.根据权利要求1所述的检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，其特征在于，所述样品垫处理方式为用30～50mL的样品垫处理液处理玻璃纤维后，35～39℃烘干过夜。
3.根据权利要求2所述的检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，其特征在于，所述样品垫处理液包括0.1～0.2M Tris-HCl缓冲液、0.1～0.2M四硼酸钠水溶液缓冲液、0.1～0.2M甘氨酸缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，其特征在于，所述样品垫处理液还包括0.3～0.8％w/v的CaseinNa、0.05～2％w/v的Tetronic 1307、0.05～2％w/v的S17、0.05～2％w/v的EDTA、0.05～2％w/v的BSA、0.5～2％v/v的Triton X-100。
5.根据权利要求1所述的检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，其特征在于，所述试剂垫用标记的HP鼠单克隆抗体处理。
6.根据权利要求5所述的检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，其特征在于，所述标记的HP鼠单克隆抗体为纳米碳标记的HP鼠单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，其特征在于，所述纳米碳标记的HP鼠单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
S1：将纳米碳分散处理后，用超声仪分散均匀；
S2：取分散好的纳米碳加入离心管中；将待标记抗体加入3～7mM Borax中，振荡混匀，室温摇晃偶联25～35min；
S3：离心12000～15000rpm，10～20min后，弃上清；
S4：加入封闭剂，再加入封闭液，超声均匀3～5次，室温封闭25～35min；
S5：离心12000～15000rpm，10～20min后，弃上清；
S6：加入5mM Borax+1％BSA,超声均匀3～5次，再离心12000～15000rpm，10～20min后，弃上清；
S7：加入保存液，超声均匀4℃保存待用。
8.根据权利要求7所述的检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，其特征在于，所述S1中纳米碳分散处理的具体步骤，包括以下步骤：
M1：将纳米碳粉溶于溶剂中，低温超声处理；
M2：将M1中低温超声处理后的纳米碳液，用溶剂稀释，离心，再进行两次离心重悬；
M3：将M2中超声重悬的纳米碳液用溶剂稀释300～500倍，测A400，保存待用。
9.根据权利要求1所述的检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒，其特征在于，所述试剂条由样品垫、试剂垫、NC膜、吸水纸粘贴于PVC底板上组成。
10.一种根据权利要求1～9任一项所述的检测口腔中幽门螺旋杆菌抗原的试剂盒的应用，其特征在于，应用于口腔牙垢中幽门螺旋杆菌抗原的检测。
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