CN115963217A - 一种咪达普利中间体及杂质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种咪达普利中间体及杂质的检测方法。本发明咪达普利中间体及杂质的检测方法包括如下步骤：对式IMI‑9所示咪达普利中间体样品中的待检测的物质进行高效液相色谱分析；以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相A，甲醇为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：0分钟，流动相A体积分数为57％；5分钟，流动相A体积分数为57％；15分钟，流动相A体积分数为45％；40分钟，流动相A体积分数为45％；41分钟，流动相A体积分数为57％；50分钟，流动相A体积分数为57％；检测波长为215nm；流速为每分钟1.0mL；柱温为40℃；进样量为20μL。本发明方法可对咪达普利中间体及杂质进行定性和定量检测，尤其是对多手性异构体进行质控，提升产品质量。

Description

一种咪达普利中间体及杂质的检测方法

技术领域

本发明属于色谱分析技术领域，尤其涉及一种咪达普利中间体及杂质的检测方法。

背景技术

盐酸咪达普利(Imidapril Hydrochloride)，是一种长效口服血管紧张素转换酶(ACE) 抑制剂，由田边制药公司(Tanabe Seiyaku)作为治疗高血压和心力衰竭的药物开发。咪达普利的体内代谢后，可较高选择性地作用于体内的肾素－血管紧张素(RA)系统，抑制血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)的生成，提高缓激肽和前列腺素，降压效果持久，有良好的心脏、肾脏保护作用。

盐酸咪达普利(结构式如式Ⅰ所示，本发明中IMI作为代号)，化学名为 (4S)-3-{(2S)-2-[(1S)-1-乙氧羰基-3-苯基丙基胺基]丙酰基}-1-甲基-2-氧咪唑烷-4-羧酸单盐酸盐，是单一的光学异构体(SSS构型)。如结构式所示，具有3个手性碳原子。根据一般的手性化学常识，盐酸咪达普利共计有2³-1＝7个光学异构体，如下式 所示：

这八个光学异构体中共计有4对化合物互为对映异构体，分别是IMI和RRR-IMI、SSR-IMI和RRS-IMI、SRS-IMI和RRS-IMI、SRS-IMI和RSR-IMI。

在合成咪达普利关键中间体(IMI-9)过程中，碱性条件容易造成IMI-6手性碳消旋，进而产生非对映异构体杂质IMI-9(SSR＝RRS)如图所示，该杂质会参与下一步反应生成终产品异构体杂质(SSR)，严重影响原料药质量。因此需对咪达普利中间体中的手性杂质进行检测，进一步提高原料药品质。

发明内容

本发明的目的是提供一种咪达普利中间体及杂质的检测方法，该方法可对多种手性异构体进行质控，提升咪达普利中间体产品的质量。

本发明提供的式IMI-9所示咪达普利中间体及杂质的检测方法，待检测的物质为下述1)-7)中的至少一种：

1)式IMI-9所示咪达普利中间体和/或式RRR-9所示手性杂质；

2)式IMI-6所示杂质；

3)式IMI-7所示杂质；

4)式IMI-8所示杂质；

5)式SRR-9所示手性杂质和/或式RRS-9所示手性杂质；

6)式RRS-9所示手性杂质和/或式SSR-9所示手性杂质；

7)式RSR-9所示手性杂质和/或式SRS-9所示手性杂质；

包括如下步骤：

对式IMI-9所示咪达普利中间体样品中的所述待检测的物质进行高效液相色谱分析实现定性检测和/或定量检测；

所述高效液相色谱分析的色谱条件如下：

以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(如：Ultimate XB-C8 4.6mm×150mm，5μm)；

以0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相A，甲醇为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：

0分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

5分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

15分钟，流动相A的体积分数为45％，流动相B的体积分数为55％；

40分钟，流动相A的体积分数为45％，流动相B的体积分数为55％；

41分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

50分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

检测波长为215nm；

流速为每分钟1.0mL；

柱温为40℃；

进样体积为20μL。

上述的检测方法中，分别以待检测物质对应的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

比较所述供试品的色谱图中色谱峰的保留时间和所述对照品的色谱峰的保留时间，实现所述定性检测。

上述的检测方法中，分别以待检测物质对应的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

根据供试品溶液中各待测物质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比(面积归一化法)，得到所述供试品中各待测物质的含量，实现所述定量检测。

作为实例，所述定性检测和所述定量检测中，以体积比为40：60的甲醇和水组成的体系为所述对照品和所述供试品的溶剂。

本发明进一步提供了式IMI-9所示咪达普利中间体样品中式IMI-9所示咪达普利中间体和式RRR-9所示手性杂质的检测方法，包括如下步骤：

对式IMI-9所示咪达普利中间体样品中的式IMI-9所示咪达普利中间体和式 RRR-9所示手性杂质进行高效液相色谱分析实现定性检测和/或定量检测；

所述高效液相色谱分析的色谱条件如下：

以多糖衍生物正相手性柱为手性色谱柱(如：DAICEL CHIRALPAK AD-H 4.6mm×250mm，5μm)；

以体积比为90:10:0.1:0.1的正己烷、异丙醇、三氟乙酸和二乙胺组成的体系为流动相；

检测波长为215nm；

流速为每分钟1.0mL；

柱温为30℃；

进样体积为20μL。

上述的检测方法中，分别以式IMI-9所示咪达普利中间体的标准物质和式RRR-9所示手性杂质的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

比较所述供试品的色谱图中色谱峰的保留时间和所述对照品的色谱峰的保留时间，实现所述定性检测。

上述的检测方法中，分别以式IMI-9所示咪达普利中间体的标准物质和式RRR-9所示手性杂质的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

根据供试品溶液中式RRR-9所示手性杂质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比(面积归一化法)，得到所述供试品中式RRR-9所示手性杂质的含量，实现式RRR-9 所示手性杂质的定量检测。

作为实例，所述定性检测和所述定量检测中，以体积比为90:10的正己烷和异丙醇组成的体系为所述对照品和所述供试品的溶剂。

作为实例，所述多糖衍生物正相手性柱的固定相为将直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂敷在硅胶表面得到的固定相。

作为实例，所述手性色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，固定相粒径为5μm。

本发明具有如下有益效果：

本发明方法可对咪达普利中间体及制备咪达普利中间体所产生的杂质进行定性和定量检测，尤其是对多手性异构体进行质控，提升咪达普利中间体产品质量。采用本发明色谱条件进行分析，分离效果好。

附图说明

图1为实施例1中梯度1系统适用性试验中的色谱图。

图2为实施例1中梯度2系统适用性试验中的色谱图。

图3为实施例1中方法3系统适用性试验中的色谱图。

图4为实施例1中方法4系统适用性试验中的色谱图。

图5为实施例1中代表性批次样品的色谱图。

图6为实施例2中系统适用性试验中的色谱图。

具体实施方式

本发明首先提供了一种式IMI-9所示咪达普利中间体及杂质的检测方法，待检测的物质为下述1)-7)中的至少一种：

1)式IMI-9所示咪达普利中间体和/或式RRR-9所示手性杂质；

2)式IMI-6所示杂质；

3)式IMI-7所示杂质；

4)式IMI-8所示杂质；

5)式SRR-9所示手性杂质和/或式RRS-9所示手性杂质；

6)式RRS-9所示手性杂质和/或式SSR-9所示手性杂质；

7)式RSR-9所示手性杂质和/或式SRS-9所示手性杂质；

包括如下步骤：

对式IMI-9所示咪达普利中间体样品中待检测的物质进行高效液相色谱分析实现定性检测或定量检测；

高效液相色谱分析的色谱条件如下：

以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(如：Ultimate XB-C8 4.6mm×150mm，5μm)；

以0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相A，甲醇为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：

0分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

5分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

15分钟，流动相A的体积分数为45％，流动相B的体积分数为55％；

40分钟，流动相A的体积分数为45％，流动相B的体积分数为55％；

41分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

50分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

检测波长为215nm；

流速为每分钟1.0mL；

柱温为40℃；

进样体积为20μL。

在本发明的至少一个实施例中，通过如下方式实现定性检测：

分别以各待测物质对应的标准物质为对照品，例如，分别以式IMI-9所示咪达普利中间体的标准物质或式RRR-9所示手性杂质的标准物质、以式IMI-6所示杂质的标准物质、式IMI-7所示杂质的标准物质、式IMI-8所示杂质的标准物质、式SRR-9所示手性杂质的标准物质或式RSS-9所示手性杂质的标准物质、式RRS-9所示手性杂质的标准物质或式SSR-9所示手性杂质的标准物质、式RSR-9所示手性杂质的标准物质或式SRS-9所示手性杂质的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

比较供试品的色谱图中色谱峰的保留时间与对照品的色谱峰的保留时间，实现定性检测。例如，

比较供试品的色谱图中色谱峰的保留时间与式IMI-9所示咪达普利中间体对照品或式RRR-9所示手性杂质对照品的色谱峰的保留时间，若供试品的色谱图中有与式 IMI-9所示咪达普利中间体对照品或式RRR-9所示手性杂质对照品的色谱峰的保留时间一致的色谱峰出现，则该供试品中含有式IMI-9所示咪达普利中间体和/或式RRR-9 所示手性杂质；

比较供试品的色谱图中色谱峰的保留时间与式IMI-6所示杂质对照品的色谱峰的保留时间，若供试品的色谱图中有与式IMI-6所示杂质对照品的色谱峰的保留时间一致的色谱峰出现，则该供试品中含有式IMI-6所示杂质；

比较供试品的色谱图中色谱峰的保留时间与式IMI-7所示杂质对照品的色谱峰的保留时间，若供试品的色谱图中有与式IMI-7所示杂质对照品的色谱峰的保留时间一致的色谱峰出现，则该供试品中含有式IMI-7所示杂质；

比较供试品的色谱图中色谱峰的保留时间与式IMI-8所示杂质对照品的色谱峰的保留时间，若供试品的色谱图中有与式IMI-8所示杂质对照品的色谱峰的保留时间一致的色谱峰出现，则该供试品中含有式IMI-8所示杂质；

比较供试品的色谱图中色谱峰的保留时间与式SRR-9所示手性杂质对照品或式RRS-9所示手性杂质对照品的色谱峰的保留时间，若供试品的色谱图中有与式SRR-9 所示手性杂质对照品或式RRS-9所示手性杂质对照品的色谱峰的保留时间一致的色谱峰出现，则该供试品中含有式SRR-9所示手性杂质和/或式RRS-9所示手性杂质；

比较供试品的色谱图中色谱峰的保留时间与式RRS-9所示手性杂质对照品或式SSR-9所示手性杂质对照品的色谱峰的保留时间，若供试品的色谱图中有与式RRS-9 所示手性杂质对照品或式SSR-9所示手性杂质对照品的色谱峰的保留时间一致的色谱峰出现，则该供试品中含有式RRS-9所示手性杂质和/或式SSR-9所示手性杂质；

比较供试品的色谱图中色谱峰的保留时间与式RSR-9所示手性杂质对照品或式SRS-9所示手性杂质对照品的色谱峰的保留时间，若供试品的色谱图中有与式RSR-9 所示手性杂质对照品或式SRS-9所示手性杂质对照品的色谱峰的保留时间一致的色谱峰出现，则该供试品中含有式RSR-9所示手性杂质和/或式SRS-9所示手性杂质。

在本发明的至少一个实施例中，采用如下面积归一化法进行定量检测：以待检测物质对应的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

根据供试品溶液中各待测物质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到所述供试品中各待测物质的含量，实现所述定量检测；例如，

根据供试品溶液中式IMI-9所示咪达普利中间体和/或式RRR-9所示手性杂质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到式IMI-9所示咪达普利中间体和/或式RRR-9 所示手性杂质的含量，实现式IMI-9所示咪达普利中间体和/或式RRR-9所示手性杂质的定量检测；

根据供试品溶液中式IMI-6所示杂质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到供试品中式IMI-6所示杂质的含量，实现式IMI-6所示杂质的定量检测；

根据供试品溶液中式IMI-7所示手性的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到供试品中式IMI-7所示杂质的含量，实现式IMI-7所示杂质的定量检测；

根据供试品溶液中式IMI-8所示杂质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到供试品中式IMI-8所示杂质的含量，实现式IMI-8所示杂质的定量检测；

根据供试品溶液中式SRR-9所示手性杂质和/或式RRS-9所示手性杂质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到式SRR-9所示手性杂质和/或式RRS-9所示手性杂质的含量，实现式SRR-9所示手性杂质和/或式RRS-9所示手性杂质的定量检测；

根据供试品溶液中式RRS-9所示手性杂质和/或式SSR-9所示手性杂质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到式RRS-9所示手性杂质和/或式SSR-9所示手性杂质的含量，实现式RRS-9所示手性杂质和/或式SSR-9所示手性杂质的定量检测；

根据供试品溶液中式RSR-9所示手性杂质和/或式SRS-9所示手性杂质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到式RSR-9所示手性杂质和/或式SRS-9所示手性杂质的含量，实现式RSR-9所示手性杂质和/或式SRS-9所示手性杂质的定量检测。

在本发明的至少一个实施例中，互为对映异构体的一对杂质(如RRS-9和SSR-9)，折算的相对校正因子均在0.9～1.1之间，可视为校正因子为1.0，同等浓度两个杂质相应一致。

在本发明的至少一个实施例中，以体积比为40：60的甲醇和水组成的体系为对照品和供试品的溶剂。

在本发明的至少一个实施例中，在定量检测中，式IMI-9所示咪达普利中间体的线性范围为：高浓度范围1209μg/ml～21.02μg/ml，低浓度范围21.54μg/ml～0.108μg/ml；

式IMI-6所示杂质的线性范围为20.66μg/ml～0.207μg/ml；

式IMI-7所示杂质的线性范围为19.94μg/ml～0.050μg/ml；

式IMI-8所示杂质的线性范围为20.16μg/ml～0.202μg/ml；

式SRR-9所示手性杂质的线性范围为19.70μg/ml～0.099μg/ml；

式RRS-9所示手性杂质的线性范围为21.30μg/ml～0.107μg/ml；

式RSR-9所示手性杂质的线性范围为20.86μg/ml～0.209μg/ml；

式RSS-9所示手性杂质的线性范围为23.24μg/ml～0.116μg/ml；

式SSR-9所示手性杂质的线性范围为20.36μg/ml～0.102μg/ml；

式SRS-9所示手性杂质的线性范围为20.02μg/ml～0.100μg/ml。

供试品溶液的浓度为1mg/mL。

在本发明的至少一个实施例中，高效液相色谱分析中，所用色谱柱(如UltimateXB-C8色谱柱)的长度为150mm，内径为4.6mm，固定相的粒径为5μm。

本发明进一步提供了一种式IMI-9所示咪达普利中间体样品中式IMI-9所示咪达普利中间体和式RRR-9所示手性杂质的检测方法，包括如下步骤：

        

对式IMI-9所示咪达普利中间体样品中的式IMI-9所示咪达普利中间体和式 RRR-9所示手性杂质进行高效液相色谱分析实现定性检测和/或定量检测；

所述高效液相色谱的色谱条件如下：

以多糖衍生物正相手性柱为手性色谱柱(DAICEL CHIRALPAK AD-H 250×4.6mm，5μm)；

以体积比为90±1％︰10±1％︰0.1︰0.1的正己烷、异丙醇、三氟乙酸和二乙胺组成的体系为流动相；

检测波长为215nm；

流速为每分钟1.0ml；

柱温为30℃；

进样量为20μl。

在本发明的至少一个实施例中，通过如下方式实现定性检测：

分别以式IMI-9所示咪达普利中间体的标准物质和式RRR-9所示手性杂质的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

比较供试品的色谱图中色谱峰的保留时间和对照品的色谱峰的保留时间，实现定性检测；例如：

比较供试品的色谱图中色谱峰的保留时间和式RRR-9所示手性杂质对照品的色谱峰的保留时间，若供试品的色谱图中有与式RRR-9所示手性杂质对照品的色谱峰的保留时间一致的色谱峰出现，则该供试品中含有式RRR-9所示手性杂质；

在本发明的至少一个实施例中，采用如下面积归一化法进行定量分析：

根据供试品溶液中式IMI-9所示咪达普利中间体的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到供试品中式IMI-9所示咪达普利中间体的含量，实现式IMI-9所示咪达普利中间体的定量检测；

根据供试品溶液中式RRR-9所示手性杂质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到供试品中式RRR-9所示手性杂质的含量，实现式RRR-9所示手性杂质的定量检测。

在本发明的至少一个实施例中，以体积比为90:10的正己烷和异丙醇组成的体系为所述对照品和所述供试品的溶剂。

在本发明的至少一个实施例中，在定量检测中，式IMI-9所示咪达普利中间体的线性范围为10.50μg/ml～0.05250μg/ml；

式RRR-9所示手性杂质的对照品溶液的线性范围为9.340μg/ml～0.04670μg/ml。

供试品溶液的浓度为0.5mg/mL。

在本发明的至少一个实施例中，多糖衍生物正相手性柱的固定相为将直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂敷在硅胶表面得到的固定相，如DAICEL CHIRALPAK AD-H手性色谱柱。

在本发明的至少一个实施例中，手性色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm；固定相的粒径为5μm。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的各标准物质均可从商业途径购买得到。

式IMI-9所示咪达普利中间体以下简称IMI-9。

式IMI-6所示咪达普利中间体以下简称IMI-6。

式IMI-7所示咪达普利中间体以下简称IMI-7。

式IMI-8所示咪达普利中间体以下简称IMI-8。

式SRR-9所示手性杂质以下简称SRR-9。

式RRS-9所示手性杂质以下简称RRS-9。

式RSR-9所示手性杂质以下简称RSR-9。

式RSS-9所示手性杂质以下简称RSS-9。

式SSR-9所示手性杂质以下简称SSR-9。

式SRS-9所示手性杂质以下简称SRS-9。

式RRR-9所示手性杂质以下简称RRR-9。

实施例1、检测咪达普利中间体样品

一、实验材料

以待检测的咪达普利中间体(IMI-9)样品为供试品。取本约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加2mL甲醇超声溶解后，再用甲醇-水(40︰60)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液(临用现配)。

二、色谱条件的确定

为了确定流动相组成及梯度洗脱程序，在不同流动相组成及梯度洗脱程序的色谱条件下进行系统适用性试验，实验过程如下：

高效液相色谱仪。色谱柱：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Ultimate XB-C8，150×4.6mm，5μm或等效柱适用)。检测器：紫外检测器。

流动相：以0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾1.36g，加水1000ml，溶解，用磷酸调节pH值为2.70±0.05)为流动相A，甲醇为流动相B，按下表表1和表2的程序进行梯度洗脱。

检测波长：215nm。

流速：每分钟1.0ml。

柱温：40℃。

进样量：20μl。

分别取IMI-6对照品、IMI-7对照品、IMI-8对照品、IMI-9对照品、RSS-9对照品、RRS-9对照品、RSR-9对照品适量，加甲醇-水(v︰v＝40︰60)溶解并定量稀释制成每1ml中约含IMI-9 1.0mg、各杂质分别约5μg的溶液，作为系统适用性试验溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图。

表1、梯度1和梯度2洗脱程序

梯度1和梯度2的系统适用性图谱见图1和图2。结论：采用梯度1采集的系统适用性图谱中杂质IMI-6和供试品中的未知杂质分离较差，其他已知杂质均能有效分离；采用梯度2采集的系统适用性图谱中SRR/RSS与IMI-9未能完全分离。

表2、不同流动相组成的洗脱方法

方法3和方法4的系统适用性图谱见图3和图4。结论：通过更改流动相起始比例，方法1(图1)未知杂质与IMI-6未能完全分离；方法3(图3)所有已知杂质均能与供试品中的未知峰完全分离；方法4(图4)IMI-6与相邻的未知杂质能分离，但空白对未知杂质有干扰；因此拟定梯度3为IMI-9有关物质的检测方法。

出峰顺序依次为IMI-6、IMI-7、IMI-8、IMI-9、RSS-9、RRS-9、RSR-9，理论板数按主峰计算不低于10000，主峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求。

验证结果(图3)：主峰与相邻已知杂质的分离度分别为14.194和2.992，理论板数为24975.514，拖尾因子为1.109。

三、方法的建立和验证

测定方法：取供试品溶液20μl，照上述确定的色谱条件进样，采用面积归一化法，计算咪达普利中间体(IMI-9)样品中各已知杂质的含量。

3.1精密度

6份供试品溶液测定出的IMI-6含量的结果RSD为6.29％，IMI-8含量的结果RSD 为8.13％，RRS-9/SSR-9含量的结果RSD为3.01％，其他已知杂质均未检出，其他单杂含量的结果RSD为6.15％，总杂含量的结果RSD为4.45％，主峰纯度无明显变化，表明本方法重复性较好。

3.2专属性

溶液配制方法见表3。

表3、专属性溶液配制方法

实验结果：空白溶剂对有关物质检测无干扰；样品经强酸破坏后主峰均有明显降解，主要产生RRT约为0.35的未知杂质峰；经强碱破坏后，主要产生RRT为0.13的未知杂质峰，与主峰均可完全分离；经氧化破坏后，主要产生RRT为0.35和1.75的未知杂质峰；经高温破坏后，主峰降解较少，主要产生较多种未知杂质峰；各破坏条件下所产生的杂质与主峰均能有效分离，色谱峰较纯，色谱条件专属性好。物料守恒。

3.3线性范围

取IMI-9对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度120％、100％、80％、50％、20％、10％、5％、2％的标准溶液作为高浓度线性溶液；取IMI-9对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、 0.05％、0.02％、0.01％、0.005％的标准溶液作为低浓度线性溶液。具体配制方式详见下表4。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。IMI-9高浓度线性方程：y＝39817x–21288，r＝0.9990； IMI-9高浓度线性范围：21.02μg/ml～1209μg/ml。IMI-9低浓度线性方程为：y＝38700x –1460.9，r＝1.0000；IMI-9低浓度线性范围：0.108μg/ml～21.54μg/ml。

取IMI-6对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％、0.005％的标准溶液。具体配制方式详见下表4。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。线性方程：y＝4823.1x–122.34，r＝1.0000。IMI-6线性范围：0.207μg/ml～20.66μg/ml。

取IMI-7对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％、0.005％的标准溶液。具体配制方式详见下表4。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。线性方程：y＝26421x–890.71，r＝1.0000；IMI-7线性范围：0.050μg/ml～19.94μg/ml。

取IMI-8对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％、0.005％的标准溶液。具体配制方式详见下表4。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。IMI-8线性方程：y＝17049x–947.23，r＝1.0000；IMI-8线性范围：0.202μg/ml～20.16μg/ml。

取SRR-9对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％的标准溶液。具体配制方式详见下表4。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。SRR-9线性方程：y＝31602x+9114.9，r＝0.9988；线性范围： 0.099μg/ml～19.70μg/ml。

取RRS-9对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％、0.005％的标准溶液。具体配制方式详见下表4。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。RRS-9线性方程：y＝31753x-1393.1；r＝1.0000；线性范围：0.107μg/ml～21.30μg/ml。

取RSR-9对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％、0.005％的标准溶液。具体配制方式详见下表4。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。RSR-9线性方程：y＝32264x-3308.9，r＝1.0000；线性范围：0.209μg/ml～20.86μg/ml。

取RSS-9对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％、0.005％的标准溶液。具体配制方式详见下表4。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。RSS-9线性方程：y＝28478x+474.8,r＝1.0000；线性范围： 0.116μg/ml～23.24μg/ml。

取SSR-9对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％的标准溶液。具体配制方式详见下表4。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。SSR-9线性方程：y＝31181x-55.903，r＝1.0000；线性范围： 0.102μg/ml～20.36μg/ml。

取SRS-9对照品溶液，用甲醇-水(v︰v＝40︰60)稀释成供试品浓度2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％的标准溶液。具体配制方式详见下表4。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。SRS-9线性方程：y＝30089x-1622.9，r＝1.0000；线性范围： 0.100μg/ml～20.02μg/ml。

表4、线性溶液配制方法

3.4定量限和检测限

取IMI-9对照品溶液进行逐级稀释，以IMI-9色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以IMI-9色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。IMI-9定量限为4.30ng (相当于主成分的0.0215％)，检测限为2.16ng(相当于主成分的0.0108％)。

取IMI-6对照品溶液进行逐级稀释，以IMI-6色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以IMI-6色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。IMI-6定量限为10.34 ng(相当于主成分的0.0517％)，检测限为4.14ng(相当于主成分的0.0207％)。

取IMI-7对照品溶液进行逐级稀释，以IMI-7的色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以IMI-7色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。IMI-7定量限为2.00 ng(相当于主成分的0.0100％)，检测限为1.00ng(相当于主成分的0.0050％)。

取IMI-8对照品溶液进行逐级稀释，以IMI-8色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以IMI-8色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。IMI-8定量限为10.08 ng(相当于主成分的0.0504％)，检测限为4.04ng(相当于主成分的0.0204％)。

取SRR-9对照品溶液进行逐级稀释，以SRR-9色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以SRR-9色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。SRR-9定量限为3.94 ng(相当于主成分的0.0197％)，检测限为1.98ng(相当于主成分的0.0099％)。

取RRS-9对照品溶液进行逐级稀释，以RRS-9色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以RRS-9色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。SRR-9定量限为4.26 ng(相当于主成分的0.0213％)，检测限为2.14ng(相当于主成分的0.0107％)。

取RSR-9对照品溶液进行逐级稀释，以RSR-9色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以RSR-9色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。SRR-9定量限为10.44 ng(相当于主成分的0.0522％)，检测限为4.18ng(相当于主成分的0.0209％)。

取RSS-9对照品溶液进行逐级稀释，以RSS-9色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以RSS-9色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。RSS-9定量限为4.64ng (相当于主成分的0.0232％)，检测限为2.32ng(相当于主成分的0.0116％)。

取SSR-9对照品溶液进行逐级稀释，以SSR-9色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以SSR-9色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。SSR-9定量限为4.08ng (相当于主成分的0.0204％)，检测限为2.04ng(相当于主成分的0.0102％)。

取SRS-9对照品溶液进行逐级稀释，以SRS-9色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以SRS-9色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。SRS-9定量限为4.00ng (相当于主成分的0.0200％)，检测限为2.00ng(相当于主成分的0.0200％)。

3.5稳定性

供试品溶液在室温放置12小时内，已知杂质IMI-6、IMI-7、IMI-8和RRT＝0.36、RRT＝0.85的未知杂质均随着时间的增长而有不同程度的增加，溶液稳定性差，因此需临用现配。

3.6耐用性

平行配制两份供试品溶液。取供试品溶液20μl，在上述色谱条件2.1发生微小变动时，进样检测，根据对照品及供试品的峰面积，采用面积归一化法，计算咪达普利中间体(IMI-9)样品中各已知杂质的含量。

本品在0.8ml/min、1.0ml/min及1.2ml/min流速条件下，本品有关物质测定结果无影响，系统适用性符合要求。

柱温在35℃～42℃范围内变化，对有关物质测定结果无影响，系统适用性符合要求。

流动相pH值在±0.1范围内变化，对有关物质测定结果无影响，系统适用性符合要求。

四、样品的测定

检测咪达普利中间体(IMI-9)代表性批次样品中各杂质的含量，色谱图如图5所示，检测结果如表5所示。

表5、代表性批次样品检测结果

结论，咪达普利中间体(IMI-9)代表性批次样品中的杂质为IMI-6、IMI-8、RRS-9和/或SSR-9，其含量分别为0.175％、0.028％、0.105％，IMI-9的含量为99.080％。

实施例2、检测咪达普利中间体中的对映异构体IMI-9和RRR-9的含量

一、实验材料

以待检测的咪达普利中间体(IMI-9)样品为供试品。取本品约10mg，精密称定，置20ml量瓶中，加正己烷-异丙醇(90︰10)溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

二、方法的建立

2.1色谱条件

色谱仪：高效液相色谱仪。手性色谱柱[DAICEL CHIRALPAK AD-H(250×4.6mm， 5μm)]。检测器：紫外检测器。

流动相：正己烷-异丙醇-三氟乙酸-二乙胺(90︰10︰0.1︰0.1)。

检测波长：215nm。

流速：每分钟1.0mL。

柱温：30℃。

进样量：20μL。

理论板数按主峰计算不低于7000。

2.2系统适用性试验

分别取IMI-9对照品、RRR-9对照品适量，精密称定，加正己烷-异丙醇(90︰10) 溶解并定量稀释制成每1ml中约含IMI-9 500μg、RRR-9 5μg的溶液，作为系统适用性试验溶液。精密量取系统适用性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，RRR-9 与IMI-9依次出峰，两峰间的分离度应符合要求。理论板数按主峰计算不低于7000。色谱图如图6所示。

验证结果：在该色谱条件下，系统适用性试验中RRR-9和IMI-9理论板数分别为10047和8687，主峰与相邻杂质的分离度分别为4.806和6,763，分离度较好。

三、方法的建立和验证

测定方法：分别取对照品溶液及供试品溶液各20μl，照上述色谱条件2.1进样，根据对照品及供试品的峰面积，采用面积归一化法，计算咪达普利中间体(IMI-9)样品中RRR-9的含量。

3.1重复性

6份供试品溶液RRR-9重复性测试结果见表6。

表6、不同供试品溶液RRR-9重复性测试结果

名称

样1

样2

样3

样4

样5

样6

平均

RSD

RRR-9

0.087％

0.079％

0.083％

0.088％

0.084％

0.076％

0.083％

5.58

6份供试品溶液测定结果显示IMI-9对映异构体检出结果为0.083％，RSD为5.58％，表明重复性良好。

3.2专属性

取空白溶剂及系统适用性溶液分别注入液相色谱仪，结果显示空白溶剂在主峰以及异构体色谱峰位置无色谱峰，不干扰本品的异构体检查。

3.3线性范围

取IMI-9对照品溶液，用溶剂稀释成浓度为0.0525μg/ml～10.50μg/ml的标准溶液。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。线性方程为y＝35990x-186.22，r＝1.0000；线性范围为0.0525μg/ml～10.50μg/ml。

取RRR-9对照品溶液，用溶剂稀释成浓度为0.0467μg/ml～9.340μg/ml的标准溶液。每个浓度进样1针，记录该浓度下色谱峰的峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。线性方程为y＝20878x-22.795，r＝1.0000；线性范围为0.0467μg/ml～9.340μg/ml。

3.4检测限和定量限

取IMI-9对照品溶液进行逐级稀释，以IMI-9色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以IMI-9色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。检测限为1.05ng，相当于主成分百分比0.009％；定量限为2.626ng，相当于主成分百分比0.023％。

取RRR-9对照品溶液进行逐级稀释，以RRR-9色谱峰的信噪比为10：1时的浓度为定量限，以RRR-9色谱峰的信噪比为3：1时的浓度为检测限。检测限为0.934ng，相当于主成分百分比0.011％；定量限为2.336ng，相当于主成分百分比0.026％。

实验结果表明，各异构体在0.011％以上的均可被检出，表明本方法灵敏度较高。各异构体在0.026％以上的均可被定量检测，表明本方法灵敏度较高。

3.5溶液稳定性

供试品溶液在室温条件下放置8h内，IMI-9和RRR-9的峰面积RSD分别为0.48％和0.85％，则溶液稳定性良好。

3.6耐用性

流速变化±0.1ml/min，对异构体的检查无明显影响，系统适用性符合要求。

流动相中正己烷比例变化±1％，对异构体的检查无明显影响，系统适用性符合要求。

柱温在25℃～33℃范围内变化时，对异构体的检查无明显影响，系统适用性符合要求。因此，应控制柱温在25℃～33℃。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种式IMI-9所示咪达普利中间体及杂质的检测方法，待检测的物质为下述1)-7)中的至少一种：

1)式IMI-9所示咪达普利中间体和/或式RRR-9所示手性杂质；

2)式IMI-6所示杂质；

3)式IMI-7所示杂质；

4)式IMI-8所示杂质；

5)式SRR-9所示手性杂质和/或式RRS-9所示手性杂质；

6)式RRS-9所示手性杂质和/或式SSR-9所示手性杂质；

7)式RSR-9所示手性杂质和/或式SRS-9所示手性杂质；

包括如下步骤：

       

对式IMI-9所示咪达普利中间体样品中的待检测的物质进行高效液相色谱分析实现定性检测和/或定量检测；

所述高效液相色谱分析的色谱条件如下：

以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；

以0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相A，甲醇为流动相B，按如下程序进行梯度洗脱：

0分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

5分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

15分钟，流动相A的体积分数为45％，流动相B的体积分数为55％；

40分钟，流动相A的体积分数为45％，流动相B的体积分数为55％；

41分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

50分钟，流动相A的体积分数为57％，流动相B的体积分数为43％；

检测波长为215nm；

流速为每分钟1.0mL；

柱温为40℃；

进样量为20μL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：分别以待检测物质对应的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

比较所述供试品的色谱图中色谱峰的保留时间和所述对照品的色谱峰的保留时间，实现所述定性检测。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：分别以待检测物质对应的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

根据供试品溶液中各待测物质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到所述供试品中各待测物质的含量，实现所述定量检测。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述定性检测和所述定量检测中，以体积比为40：60的甲醇和水组成的体系为所述对照品和所述供试品的溶剂。

5.一种式IMI-9所示咪达普利中间体样品中式IMI-9所示咪达普利中间体和式RRR-9所示手性杂质的检测方法，包括如下步骤：

对式IMI-9所示咪达普利中间体样品中的式IMI-9所示咪达普利中间体和式RRR-9所示手性杂质进行高效液相色谱分析实现定性检测和/或定量检测；

所述高效液相色谱分析的色谱条件如下：

以多糖衍生物正相手性柱为手性色谱柱；

以体积比为90︰10︰0.1︰0.1的正己烷、异丙醇、三氟乙酸和二乙胺组成的体系为流动相；

检测波长为215nm；

流速为每分钟1.0mL；

柱温为30℃；

进样量为20μL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：分别以式IMI-9所示咪达普利中间体的标准物质和式RRR-9所示手性杂质的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

比较所述供试品的色谱图中色谱峰的保留时间和所述对照品的色谱峰的保留时间，实现所述定性检测。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：分别以式IMI-9所示咪达普利中间体的标准物质和式RRR-9所示手性杂质的标准物质为对照品；以式IMI-9所示咪达普利中间体样品为供试品；

根据供试品溶液中式RRR-9所示手性杂质的色谱峰面积与总的色谱峰面积之比，得到所述供试品中式RRR-9所示手性杂质的含量，实现式RRR-9所示手性杂质的定量检测。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述定性检测和所述定量检测中，以体积比为90:10的正己烷和异丙醇组成的体系为所述对照品和所述供试品的溶剂。

9.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述多糖衍生物正相手性柱的固定相为将直链淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂敷在硅胶表面得到的固定相。

10.根据权利要求5-9中任一项所述的方法，其特征在于：所述手性色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，固定相粒径为5μm。

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